CN104147142A - 树脂法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了树脂法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，黄酮类成分的提取方法包括：按配比称取黄芪和女贞子，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，即得黄酮类成分提取物；蒸馏水洗脱液浓缩后再上大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用60％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，即得皂苷类成分提取物。采用本发明的树脂法对女贞子和黄芪中的黄酮类、皂苷类成分进行提取，提取率高，有效成分的纯度也较高。

Description

树脂法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种树脂法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，属于中药技术领域。

背景技术

贞芪扶正药是以植物药黄芪和女贞子进行组配生产的用于提高免疫力、治疗因放疗或化疗造成白细胞下降的药物。贞芪扶正药目前供临床选择的剂型有片剂、胶囊剂、颗粒剂及滴丸剂等，这些剂型大多采用溶剂萃取、过滤及透析等方法去除其中的不溶性杂质，不仅工艺复杂，生产成本高，有效成分的提取率低，提取纯度低，而且在除杂的过程中还会导致有效成分的大量流失。

申请号为200310122216.7的专利申请公开了一种“贞芪扶正药制备方法改进”的工艺，具体方法是：先对女贞子回流提取得清膏，对黄芪水煮提取得清膏；再将清膏过滤，滤液回收乙醇后减压浓缩成清膏；再过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，用水洗涤树脂床，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩，干燥，即得女贞子、黄芪的有效成分。该方案可以有效去除药材中的黏液质和树胶等，提高制剂的稳定性，但是其对有效成分的提取率和提取纯度仍然较低，不仅导致患者的服用量较大，而且还直接影响产品的质量和临床疗效。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种树脂法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，它可以有效解决现有技术中存在的问题，尤其是有效成分的提取率和提取纯度较低的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：树脂法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用40％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

优选的，按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％～80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，先用3BV蒸馏水洗脱，再用3BV的60％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

前述方法中，所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为2.0～5.0BV/h。

优选的，所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h。

前述方法提取得到的黄酮类成分提取物。

树脂法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，包括以下步骤：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，用蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用60％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物。

优选的，按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％～80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，用蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上预处理后的AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用70％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物。

前述方法中，所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为2.0～5.0BV/h；所述的大孔吸附树脂的吸附流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为0.5～5.0BV/h；乙醇洗脱液的体积为2.0～10.0BV。

优选的，所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h；所述的大孔吸附树脂的吸附流速为3.0BV/h；洗脱流速为2.0BV/h；洗脱液的体积为6.0BV。

前述方法提取得到的皂苷类成分提取物。

一种贞芪扶正药物，所述药物的有效成分包含前述的黄酮类成分提取物。

一种贞芪扶正药物，所述药物的有效成分包含前述的皂苷类成分提取物。

优选的贞芪扶正药物的有效成分同时包含前述的黄酮类成分提取物和皂苷类成分提取物。

所述的贞芪扶正药物可以是将前述方法提取得到的黄酮类和/或皂苷类有效成分干燥物混合其他有效成分后，加入相应辅料制成的各种药物制剂，比如胶囊剂、滴丸剂、糖浆剂、片剂、制剂剂、咀嚼剂等。

发明人进行了一系列实验，以选择本发明提供的贞芪扶正药物制备方法的工艺条件等，证明本发明制备方法的有效性。

实验例1 不同类型的树脂提取黄酮类成分的吸附试验

分别选用以下4种湿树脂吸附提取液，在室温下经静态吸附及用体积分数为80％的乙醇水溶液解吸后，比较其对总黄酮的吸附量、吸附率及解吸率大小的影响，实验结果见表1：

表1 树脂类型的选择

树脂吸附量大、解吸率高，有效成分的回收率就高，因此，吸附量与解吸率测定是树脂试验的重要环节。分别采用D101、DM301、AB-8和聚酰胺树脂对黄酮类有效成分进行吸附、解吸，结果显示：上述树脂对黄酮类成分均具有较强的吸附、解吸能力，其中吸附量最大的是AB-8，但其解吸率较聚酰胺低很多，而聚酰胺柱对总黄酮的解吸率最高，且其吸附量也不低。因此，优选聚酰胺树脂提取黄酮类成分。

实验例2 不同浓度的乙醇对黄芪、女贞子进行回流提取的影响：

采用不同浓度的乙醇分别对黄芪、女贞子进行回流提取，结果如下表2所示：

表2

表2的研究结果表明：黄酮类成分以芒柄花素为指标进行检测时，低浓度乙醇回流提取率较高；皂苷类成分以黄芪甲苷为指标进行检测时，高浓度乙醇回流提取率较高，且当乙醇浓度大于80％后，提取率趋于稳定；因此综上所述，本发明采用40％～80％乙醇进行回流提取，可以同时保证黄酮类成分及皂苷类成分的高提取率。

实验例3 聚酰胺树脂提取黄酮类成分的洗脱剂浓度选择

用聚酰胺树脂提取黄酮类成分，为了提高洗脱效率，同时防止有效成分的损失，分别采用浓度为40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，以芒柄花素和毛蕊异黄酮的总量为检测指标进行分析，结果见表3：

表3 乙醇洗脱浓度的选择

表3的研究结果表明：洗脱剂中乙醇的浓度对洗脱效果的影响较大，当洗脱液中乙醇的浓度达到60％时，黄酮的收率增加明显，且60％～90％的区间里，黄酮的提取率一直保持较高水平，因此优选60％～90％的乙醇进行梯度洗脱。

实验例4 不同类型树脂提取皂苷类成分的洗脱剂浓度选择

不同类型树脂提取皂苷类成分，以黄芪甲苷含量(mg/g)为指标进行检测，以过聚酰胺树脂的蒸馏水洗脱液分别过以下4种树脂，同时分别以40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的乙醇进行洗脱，结果见表4：

表4 树脂类型及洗脱液浓度的选择

表4的试验结果表明，AB-8大孔吸附树脂提取皂苷类成分的效果最佳；同时洗脱剂浓度也很大程度上影响了洗脱能力，当乙醇浓度为40％、50％时，可以检测到少量皂苷；随着乙醇浓度的增大，皂苷含量也随之增加，为了提高洗脱效率并防止有效成分的损失，选用AB-8大孔吸附树脂、60％～95％乙醇洗脱。

实验例5 乙醇洗脱液体积对洗脱性能的影响

精密量取处理后的样品溶液通过聚酰胺树脂柱，先用3.0BV水洗脱后，再用70％乙醇洗脱，洗脱液流速4.0BV/h，分段收集洗脱液，制备供试品溶液，测定1.0BV、2.0BV、3.0BV、4.0BV下芒柄花素的洗脱率分别为34.97％，81.10％，92.82％，96.95％，即采用3.0BV70％乙醇洗脱，洗脱率可达到92.8％，当采用4.0BV乙醇洗脱时，洗脱率变化不大，故本发明优选采用3.0BV乙醇进行洗脱。

精密量取处理后的样品溶液通过大孔吸附树脂柱，用3.0BV水洗脱后，再用70％乙醇洗脱，洗脱液流速为2.0BV/h，分段收集洗脱液，制备供试品溶液，测定0.5BV、1.0BV、2.0BV、3.0BV、4.0BV、5.0BV、6.0BV、7.0BV、8.0BV、9.0BV、10.0BV、11.0BV下黄芪甲苷的洗脱率分别为10.12％、20.56％、40.78％、51.25％、78.65％、81.56％、93.14％、92.91％、90.88％、87.12％、85.85％、82.77％，即采用6.0BV70％乙醇洗脱，洗脱率可达到93.14％，当洗脱体积大于6.0BV时，洗脱率有所下降，故本发明优选采用6.0BV乙醇进行洗脱。

实验例6 聚酰胺树脂的吸附流速、洗脱流速对洗脱性能的影响

(一)乙醇上样流速对洗脱效果的影响：

将本发明中的上样液以不同的流速通过聚酰胺树脂柱，收集流出液并测定流出液中总黄酮的含量，计算0.5BV/h、1.0BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h、4.0BV/h不同流速下树脂对芒柄花素的吸附率，实验结果分别为77.14％、81.34％、91.14％、90.43％、90.12％。在上样的流速选择中，随着流速的增加，吸附率上升，但是达到一定的流速后吸附率有缓慢降低的趋势，这说明流速过快不利于树脂对芒柄花素的吸附，会导致其吸附过程的流失；而流速过慢又不利于芒柄花素的吸附，上样流速为1.0BV/h～4.0BV/h时，芒柄花素的吸附率均较高，尤其是当吸附流速为2.0BV/h时，芒柄花素的吸附率最高，可达91.14％，因此聚酰胺树脂的乙醇上样流速优选2.0BV/h。

(二)乙醇洗脱流速对洗脱效果的影响：

将本发明中的上样液以2.0BV/h流速上样，吸附30min，水洗3BV，再采用70％乙醇洗脱，分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0BV/h的流速过柱，洗脱并收集3BV洗脱液，测定芒柄花素的洗脱率分别为52.87％、80.98％、86.59％、98.52％、90.28％、60.71％。由试验结果可知：洗脱流速与洗脱量有很好相关性，随着洗脱流速的提高，芒柄花素的洗脱率提升，但到6.0BV/h的流速时洗脱率反而下降，这是由于速度的加快，导致乙醇洗脱液不能很好的与树脂上吸附的芒柄花素进行交换，因而不能达到很好的洗脱效果；当本发明的洗脱流速为2.0～5.0BV/h时，洗脱率较好，尤其是当洗脱流速为4.0BV/h时，洗脱率可达到98.52％，洗脱效果最佳。

实验例7 大孔吸附树脂的吸附流速、洗脱流速对洗脱性能的影响

(一)吸附流速对洗脱性能的影响

将本发明中的上样液以不同的流速通过AB-8大孔树脂柱，收集流出液并测定流出液中黄芪甲苷的含量，计算0.5BV/h、1.0BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h、4.0BV/h、5.0BV/h不同流速下树脂对黄芪甲苷的吸附率，实验结果分别为61.22％、82.73％、89.43％、92.16％、89.71％、72.55％；结果表明，在一定的上样浓度和上样体积下，吸附流速为1.0BV/h～4.0BV/h时，黄芪甲苷的吸附率均较高，尤其是当吸附流速为3.0BV/h时，黄芪甲苷的吸附率最高，可达92.16％，因此本发明大孔吸附树脂的吸附流速优选3.0BV/h。

(二)洗脱流速对洗脱性能的影响

将本发明中的上样液以3.0BV/h的流速上样，吸附30min，水洗3.0BV，采用70％乙醇洗脱，分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0BV/h的流速过柱，洗脱并收集洗脱液，测定黄芪甲苷的洗脱率分别为80.42％、85.76％、92.78％、90.26％、86.15％、80.81％、71.88％；由试验结果可知：流速为0.5BV/h～5.0BV/h时，黄芪甲苷的洗脱率均较高，尤其是当洗脱流速为2.0BV/h时，黄芪甲苷的洗脱率最高，可达92.78％，因此大孔吸附树脂的乙醇洗脱流速优选2.0BV/h。

实验例8 采用本发明提取的有效成分制备的贞芪扶正胶囊的稳定性研究：

黄芪皂苷测定数据处理方法：在每一实验温度内，将lgC对t作线性回归，结果如表5所示：

表5 贞芪扶正胶囊中黄芪皂苷的加速实验结果

再将实验温度由摄氏温度改换为热力学温度T，调整如表6所示：

表6

T	1/T	K(h-1)	lgK
				100+273	2.681×10-3	6.384×10-2	1.1949
90+273	2.755×10-3	2.989×10-2	1.5244
				80+273	2.833×10-3	6.708×10-3	2.1734
70+273	2.915×10-3	2.281×10-3	2.6419

根据Arrhenius定律以lgK对1/T作线性回归，得直线方程：

lgIK＝-64031/T+16.02

将室温25℃(T＝298K)代入直线方程，得室温反应速度常数K_25℃＝3.4075×10^-6/h，代入公式t_0.9＝0.1045/K_25℃＝30660h＝3.5年，即黄芪皂苷于25℃的有效期为3.5年。

实验例9 贞芪制剂中有效成分含量对比试验

本发明制剂：女贞子采用80％乙醇进行提取，醇提浸膏加水取沉淀，得女贞子萜类成分；女贞子醇提药渣加水煎煮，所得清膏加乙醇取沉淀，得女贞子多糖类成分；黄芪加水煎煮，所得清膏加乙醇取沉淀，得黄芪多糖类成分；采用本发明的方法提取所得黄芪黄酮类、皂苷类成分和女贞子黄酮类、皂苷类有效成分；将上述各有效成分混合，粉碎成细粉，混匀，用85％乙醇制粒，干燥，整粒，装胶囊，即得。

现有贞芪扶正制剂：按照申请号为200510038194.5、名称为“贞芪扶正小水针及其制备方法”中的方法制备黄芪、女贞子多糖类成分；按照申请号为200310122216.7、名称为“贞芪扶正药制备方法改进”的方法制备女贞子萜类成分及黄芪、女贞子黄酮类和皂苷类成分；将上述各有效成分混合，粉碎成细粉，混匀，用85％乙醇制粒，干燥，整粒，装胶囊，即得。

本发明制剂与现有贞芪扶正制剂的有效成分含量对比如下表7所示：

表7

组别	芒柄花素(mg/g)	黄芪甲苷(mg/g)
			现有贞芪扶正制剂组	3.480	1.778
本发明制剂组	5.687	2.756

与现有技术相比，本发明通过采用树脂法对女贞子和黄芪中的黄酮类和皂苷类成分进行提取，不仅提取工艺简单，成本低，可操作性强，提取率高，而且提取的有效成分的纯度也较高，避免了有效成分的流失。另外，利用本发明的提取方法提取得到的有效成分来制备贞芪扶正药物，该贞芪扶正药物的药效更好。

具体实施方式

实施例1：贞芪组合物中的黄酮类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入70％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，先用3BV蒸馏水洗脱，再用3BV的60％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应(可采用现有技术检测有无黄酮反应)，其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

实施例2：贞芪组合物中的黄酮类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用3BV蒸馏水洗脱，再用3BV的40％～60％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应，其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为4.0BV/h；洗脱流速为5.0BV/h；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

实施例3：贞芪组合物中的黄酮类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用40％～80％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应，其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0BV/h；洗脱流速为2.0BV/h；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

实施例4：贞芪组合物中的黄酮类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入50％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用40％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

实施例5：贞芪组合物中的皂苷类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入70％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，用3BV蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上预处理后的AB-8大孔吸附树脂，先用3BV蒸馏水洗脱至无色，再用6BV的70％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物；其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h；所述的大孔吸附树脂的吸附流速为3.0BV/h；洗脱流速为2.0BV/h。

实施例6：贞芪组合物中的皂苷类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，用4BV蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上预处理后的AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用10BV的60％～70％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物；其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为4.0BV/h；洗脱流速为5.0BV/h；所述AB-8大孔吸附树脂的吸附流速为4.0BV/h；洗脱流速为5.0BV/h。

实施例7：贞芪组合物中的皂苷类成分提取物，通过以下方法进行提取：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，用3.5BV蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上预处理后的AB-8大孔吸附树脂，先用3.5BV蒸馏水洗脱至无色，再用2.0BV的70％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物；其中，所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0BV/h；洗脱流速为2.0BV/h；所述AB-8大孔吸附树脂的吸附流速为1.0BV/h；洗脱流速为0.5BV/h。

实施例8：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～4中任一项的黄酮类成分提取物，另取采用方法A提取的皂苷类成分、方法B提取的萜类成分及方法D或方法E提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。每次服用量按原生药材计为15g，每天2次。

实施例9：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～4中任一项的黄酮类成分提取物，取实施例5～7中任一项的皂苷类成分提取物，另取方法B提取的萜类成分及方法E提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。每次服用量按原生药材计为15g，每天2次。

实施例10：一种贞芪扶正滴丸，通过以下方法制备而成：取实施例5～7中任一项的皂苷类成分提取物，另取方法D提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将所述的药粉与基质在60～80℃下均匀混合，以10～50滴/分钟的速度滴入0～20℃的冷却剂中，即得贞芪扶正滴丸。每次服用量按原生药材计为15g，每天2次。

为确保本发明所得制剂产品的药效，申请人对其药效进行了对比实验研究。

1、实验材料

1.1实验药物：

(1)按照本发明实施例8～10分别制得的贞芪扶正制剂。

(2)按现有工艺方法(即发明专利200510038194.5、200310122216.7)提取黄芪和女贞子中的多糖类成分、黄酮类成分、皂苷类成分、萜类成分后制得的贞芪扶正制剂。现有技术提取工艺如下：

①发明专利200510038194.5：

皂苷类成分(现有技术方法A)：取黄芪、女贞子水提醇沉后的上清液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水使沉淀溶解，滤过，用乙酸乙酯、正丁醇或异戊醇萃取三次，合并萃取液，用1％的氢氧化钠水溶液洗涤二次，弃去碱水液，减压回收有机溶剂萃取液并浓缩至干，得黄芪、女贞子皂苷类成分；

多糖类成分(现有技术方法D)：取黄芪、女贞子药材颗粒或粗粉，用6～15倍量的去离子水通过煎煮法提取3次，合并提取液，滤过，减压浓缩成每1mL相当于1.5g生药的药液，加乙醇至含醇量达60％～80％，静置24h，滤过，得沉淀和过滤液；取沉淀，减压低温干燥，加适量蒸馏水溶解，再加乙醇至含醇量达60％～90％，静置24h，滤过，沉淀加蒸馏水溶解成1％的溶液，过中空纤维柱超滤，其截留分子量大于6000，超滤液减压浓缩至干，得多糖类成分。

②发明专利200310122216.7：

萜类成分(现有技术方法B)：取女贞子，加80％乙醇回流提取三次，每次加6倍量乙醇，回流提取1小时，回流液滤过，合并三次滤液，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1.10(50℃)的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得女贞子萜类成分；

黄酮类和皂苷类成分(现有技术方法C)：黄芪、女贞子水提醇沉后所得滤液合并，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1.18(50℃)的清膏，滤过，滤液通过D-101大孔树脂柱，用3倍树脂体积的水洗涤树脂床，再用4倍树脂体积的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩，干燥，即得黄芪黄酮、皂苷类成分。

多糖类成分(现有技术方法E)：取黄芪、女贞子药材粉碎，加水煎煮三次，每次加6倍量水，煎煮1.0小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩至相对密度为1.15(20℃)的清膏，加乙醇使醇含量达70％，搅匀，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得多糖类成分。

1.2实验动物：昆明种小鼠，♀各半，体重20±0.7g，由贵阳医学院实验动物中心提供；实验室光照充足，通气良好，室温18～22℃，湿度50％～70％，按常规定期消毒；自由饮水、饮食，小鼠饲养笼分笼饲养，动物实验前观察适应5天，复查合格后开始进入正式实验。

2、实验方法

2.1抗疲劳作用

对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响：取小鼠140只，雌雄各半，随机分成14组(本发明制剂组11个，现有贞芪扶正制剂组2个，生理盐水对照组1个)，每组10只，连续给药15天，末次给药30分钟后小鼠分别单个放入250mL的广口瓶中，内加适量钠石灰并加盖，用凡士林密封瓶口，观察动物死亡时间，统计分析采用q检验。

结果：试验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂可使成年小鼠耐缺氧的时间明显延长(P<0.01)，结果见表8。

表8 贞芪扶正制剂对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2抗炎免疫作用

对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)吞噬鸡红细胞(CRBC)能力的影响：取成年鼠150只，随机分为15组(本发明制剂组11个，现有贞芪扶正制剂组2个，NS组、LMS组各1个)，每组10只，雌雄各半，分别灌胃本发明制得的贞芪扶正制剂、市售贞芪扶正制剂、LMS及等容量NS，共7天。停药后2小时，给每只小鼠腹腔注射5％(V/V)CRBC0.4mL，12小时后将小白鼠脱臼处死，仰位固定于鼠板。剪开腹部皮肤，经腹腔注入NS2mL；转动鼠板1分钟，然后吸取腹腔洗液1mL，滴于载玻片上；每片0.2mL置于37℃孵暖箱内保育30分钟，干后用4％姬姆萨-瑞特氏液染色5小时，油镜下每片计数100个MΦ，按下式计算胸腺指数和脾脏指数，实验结果见表9。

吞噬率＝(吞噬CRBC的MΦ/100个MΦ)×100％

吞噬指数＝被吞噬的CRBC/100个MΦ

表9 贞芪扶正制剂对小鼠腹腔MΦ吞噬功能的影响

实验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂和现有贞芪扶正制剂均可明显的增加小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能，与免疫增强剂LMS的作用近似，并且本发明制得的贞芪扶正制剂比现有贞芪扶正制剂更能增强小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能。

综上所述，采用本发明工艺方法提取的有效成分制备的贞芪扶正制剂对小鼠的抗疲劳以及免疫功能均有明显调节作用，并且效果优于现有贞芪扶正制剂。

Claims (13)

1.树脂法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用40％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

2.根据权利要求1所述的树脂法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％～80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，先用3BV蒸馏水洗脱，再用3BV的60％～90％乙醇梯度洗脱至无黄酮反应；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得黄酮类成分提取物。

3.根据权利要求1或2所述的树脂法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为2.0～5.0BV/h。

4.根据权利要求3所述的树脂法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h。

5.权利要求1～4所述方法提取得到的黄酮类成分提取物。

6.树脂法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上聚酰胺柱，用蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用60％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物。

7.根据权利要求6所述的树脂法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：按照2：1的重量比称取黄芪和女贞子，将黄芪、女贞子单独或混合后，加入40％～80％乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水溶解；溶解后的溶液上已经过预处理的聚酰胺柱，用蒸馏水洗脱，蒸馏水洗脱液浓缩后再上预处理后的AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至无色，再用70％～95％乙醇梯度洗脱；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至干，若单独提取则合并干燥后的浓缩物，即得皂苷类成分提取物。

8.根据权利要求6或7所述的树脂法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：所述的聚酰胺柱的上样流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为2.0～5.0BV/h；所述的大孔吸附树脂的吸附流速为1.0～4.0BV/h；洗脱流速为0.5～5.0BV/h；洗脱液的体积为2.0～10.0BV。

9.根据权利要求8所述的树脂法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：所述的聚酰胺柱的上样流速为2.0BV/h；洗脱流速为4.0BV/h；所述的大孔吸附树脂的吸附流速为3.0BV/h；洗脱流速为2.0BV/h；洗脱液的体积为6.0BV。

10.权利要求6～9任一项所述方法提取得到的皂苷类成分提取物。

11.一种贞芪扶正药物，其特征在于：所述药物的有效成分包含权利要求5所述的黄酮类成分提取物。

12.一种贞芪扶正药物，其特征在于：所述药物的有效成分包含权利要求10所述的皂苷类成分提取物。

13.根据权利要求12所述的贞芪扶正药物，其特征在于：所述药物的有效成分还包含权利要求5所述的黄酮类成分提取物。