CN104083447A - 超临界萃取法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超临界萃取法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，将黄芪、女贞子粉碎并低温干燥，二者单独或者混合后以超临界二氧化碳为萃取剂进行第一次萃取，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物；对第一次萃余物进行第二次超临界萃取，得黄酮类成分提取物；对第二次萃余物进行第三次超临界萃取，得皂苷类成分提取物；再对第三次萃余物进行第四次超临界萃取，得萜类成分提取物。本发明提取方法能提高贞芪组合物中有效成分的提取率和纯度，从而降低贞芪扶正制剂服用量，使得贞芪制剂的治疗效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及一种超临界萃取法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，属于贞芪扶正制剂制备技术领域。
背景技术
贞芪扶正制剂有补气养阴、扶正固本之功效。现代药理实验证明能提高人体免疫功能，保护骨髓和肾上腺皮质功能，促进干扰素产生；配合肿瘤患者放、化疗，减轻病人放、化疗期间的毒副作用，促进正常功能的恢复的作用。其处方由黄芪、女贞子组成。目前，贞芪扶正制剂供临床选择的剂型有片剂、胶囊剂、颗粒剂及滴丸剂等。
女贞子、黄芪均富含多种药物有效成分，而在贞芪扶正制剂中起到免疫调节作用的成分主要有：萜类、多糖类、黄酮类和皂苷类成分。
目前，贞芪扶正制剂大多采用传统的制备方法：比如水提醇沉法、醇提水沉法。以黄芪的有效成分为例，利用水提醇沉法进行制备，黄芪多糖的提取会比较充分，但黄芪皂苷的得率和含量较低；而利用醇提水沉法制备，则可得到较高得率和含量的皂甙，但黄芪多糖的得率会降低，含量稍有提高。由于需要提取的药物有效成分有多种，通过上述传统的制备工艺得到的贞芪扶正制剂的药物有效成分基本上均为粗提物，提取率和纯度不能满足生产使用的需求，不仅会导致患者的服用量较大，而且还会直接影响产品的质量和临床疗效。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种超临界萃取法提取贞芪组合物中有效成分的方法及其产品，该方法能够提高有效成分的提取率和纯度，从而降低制剂服用量，使得贞芪制剂的治疗效果更好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得萃取液，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法中，萃取过程中,采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h。
优选的，萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力40Mpa，温度为50℃，CO2流量为25L/h，萃取时间为3h。
前述方法提取得到的多糖类成分提取物。
超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃取液，对第二次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得黄酮类成分提取物。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法中，第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h。
优选的，第一次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力40Mpa，温度为50℃，CO2流量为25L/h，萃取时间为3h；第二次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力30Mpa、温度50℃，CO2流量为30Kg/h，萃取时间为3h。
前述方法提取得到的黄酮类成分提取物。
超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2～3h，得第三次萃取液，对第三次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得皂苷类成分提取物。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法中，第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第三次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者70％～95％乙醇为夹带剂，压力为20～40MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h。
优选的，第一次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力40Mpa，温度为50℃，CO2流量为25L/h，萃取时间为3h；第二次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力30Mpa、温度50℃，CO2流量为30Kg/h，萃取时间为3h；第三次萃取过程中，采用70％～95％乙醇为夹带剂，压力40MPa，温度45℃，CO2流量为10Kg/h，萃取时间为2.5h。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法中，第三次萃取时，向夹带剂中加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05～0.09mol/L。
前述方法提取得到的皂苷类成分提取物。
超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2～3h，得第三次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第三次萃余物进行第四次萃取，萃取1～2.5h，得第四次萃取液，对第四次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得萜类成分提取物。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法中，第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第三次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者70％～95％乙醇为夹带剂，压力为20～40MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第四次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者85％～95％乙醇作为夹带剂，压力为15～30MPa，温度为35～45℃，二氧化碳流量控制在25～35Kg/h。
优选的，第一次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力40Mpa，温度为50℃，CO2流量为25L/h，萃取时间为3h；第二次萃取过程中，采用60％～80％乙醇为夹带剂，压力30Mpa、温度50℃，CO2流量为30Kg/h，萃取时间为3h；第三次萃取过程中，采用70％～95％乙醇为夹带剂，压力40MPa，温度45℃，CO2流量为10Kg/h，萃取时间为2.5h；第四次萃取过程中，采用85％～95％乙醇为夹带剂，压力20MPa，温度40℃，CO2流量为35Kg/h，萃取时间为2.5h。
前述的超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法中，第三次萃取时，向夹带剂中加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05～0.09mol/L。
前述方法提取得到的萜类成分提取物。
一种贞芪扶正药物，其有效成分包含前述的多糖类成分提取物和/或前述的黄酮类成分提取物和/或前述的皂苷类成分提取物和/或前述的萜类成分提取物。
所述的贞芪扶正药物可以是将前述方法提取得到的多糖类和/或黄酮类和/或皂苷类和/或萜类有效成分干燥物混合其他有效成分后，加入相应辅料制成的各种药物制剂，比如胶囊剂、滴丸剂、糖浆剂、片剂、颗粒剂、咀嚼剂等。
为确保贞芪组合物中有效成分的萃取率，申请人对萃取工艺条件进行了一系列的试验研究和筛选。
1、实验仪器(见表1)
表1
| 仪器名称 | 生产厂家 |
| HA221-50-60超临界流体萃取装置 | 南通华安超临界萃取有限公司 |
| 116摇摆式粉碎机 | 海南佳惠食品机械厂 |
| R-220旋转蒸发仪 | 瑞士布其公司 |
| 真空干燥箱 | 上海一恒实验仪器总厂 |
2、中药在提取与有效成分富集纯化工艺中多会使用有机溶剂，如乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等。为了保证制剂的质量，有机溶剂的残留量越低越好。超临界萃取的优点之一便是无有机溶剂残留。以乙醇残留量为例，采用顶空气相色谱法对几种常用提取方法中乙醇的残留量进行比较，结果如表2所示。
表2
| 提取方法 | 超临界萃取法 | 加热回流法 | 离心法 |
| 乙醇残留量(μg/g) | 未检出 | 703.66 | 623.85 |
3、夹带剂的选择
采用不同种类的夹带剂对各有效成分进行超临界萃取，多糖含量的测定可用蒽酮-硫酸法；皂苷类成分以黄芪皂苷为例，采用香草醛-硫酸比色法测定其含量；黄酮类成分以毛蕊异黄酮为例，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定其含量；萜类成分以齐墩果酸为例，采用5％香草醛-冰醋酸、高氯酸显色法测定其含量，萃取率计算公式均为：萃取率(％)＝(有效成分的质量/药材的质量)×100％，所得萃取率如表3所示。
表3
由表3可以看出，在超临界状态下，对各有效成分的萃取率由高到低排列为：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚。由于前述有效成分极性都较大，为了加强萃取环境的极性，一般加入乙醇等分子间引力大的物质作为夹带剂。从实验结果来看，在超临界状态下，以不同种类的有机溶剂作为夹带剂时，甲醇的萃取效率最高，其次是无水乙醇、乙酸乙酯和丙酮，石油醚的萃取效率最低。乙醇的极性不如甲醇，故萃取率也较之低，但是由于乙醇无毒且易与二氧化碳混合，综合考虑下，优选乙醇做夹带剂。
4、多糖类成分超临界萃取工艺条件筛选
为寻找多糖类成分较佳的萃取工艺条件，本研究选取不同的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂和CO2流量作为考察因素，结果见表4。
表4
由实验可知，多糖类成分的最佳超临界萃取工艺条件为：压力40Mpa、温度50℃、夹带剂为80％乙醇、CO2流量为25L/h，萃取时间为3h。
5、黄酮类成分超临界萃取工艺条件筛选
为寻找黄酮类成分较佳的萃取工艺条件，本研究选取不同的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂和CO2流量作为考察因素，以芒柄花素为检测指标，考察各条件下的萃取率，结果见表5。
表5
由实验可知，黄酮类成分的最佳超临界萃取工艺条件为：压力30Mpa、温度50℃、夹带剂为70％乙醇、CO2流量为30Kg/h，萃取时间为3h。
6、皂苷类成分超临界萃取工艺条件筛选
为寻找皂苷类成分较佳的萃取工艺条件，本研究选取不同的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂和CO2流量作为考察因素，以黄芪甲苷为检测指标，考察各条件下的萃取率，结果见表6。
表6
由实验可知，皂苷类成分的最佳超临界萃取工艺条件为：压力40MPa，温度45℃，夹带剂为95％乙醇，CO2流量为10Kg/h，萃取时间为2.5h。
为了进一步提高皂苷类成分的萃取率，选用上述最佳超临界萃取工艺条件，在夹带剂中加入一定浓度的表面活性剂。将辛基酚聚氧乙烯醚(OP-10)与琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)复配，使AOT与OP-10的物质的量比分别为20:1、10:1、4:1、3:1、2:1、1:1，考察复合表面活性剂对萃取率的影响，结果见表7。
表7
由上表可知，当AOT与OP-10的物质的量比为4:1时，皂苷类成分的萃取率最高，因此选用该物质的量比。
8、萜类成分超临界萃取工艺条件筛选
为寻找萜类成分较佳的萃取工艺条件，本研究选取不同的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂和CO2流量作为考察因素，以齐墩果酸为检测指标，考察各条件下的萃取率，结果见表8。
表8
由实验可知，萜类成分的最佳超临界萃取工艺条件为：压力20MPa，温度40℃，夹带剂为95％乙醇，CO2流量为35Kg/h，萃取时间为2.5h。
与现有技术相比，本发明采用超临界流体萃取法代替传统的贞芪提取工艺，具有以下优点：
1、根据原料药中各有效成分的极性和沸点，有针对性的指定适应的温度、压力、流体流量、时间、夹带剂等萃取条件，逐一萃取，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，提高了提取率，采用本发明的制备工艺制得的贞芪扶正制剂，患者的药物服用量减少了，治疗效果更好。
2、超临界流体萃取法操作简单方便；采用CO2作为萃取剂，有很多优点，比如：价格便宜，纯度高，容易制取，且可以重复循环使用，从而有效地降低了成本；CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无臭、无毒、安全性非常好。
具体实施方式
本发明实施例1：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至1.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为80％的乙醇，压力为40MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在25L/h，萃取3h，得萃取液，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物。
本发明实施例2：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为60％的乙醇，压力为30MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10L/h，萃取2h，得萃取液，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物。
本发明实施例3：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为70％的乙醇，压力为50MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30L/h，萃取4h，得萃取液，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物。
本发明实施例4：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至1.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为80％的乙醇，压力为40MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在25L/h，萃取3h，得第一次萃余物；再采用70％的乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取3h，得第二次萃取液，对第二次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得黄酮类成分提取物。
本发明实施例5：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为石油醚，压力为30MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10L/h，萃取2h，得第一次萃余物；再采用60％的乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2h，得第二次萃取液，对第二次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得黄酮类成分提取物。
本发明实施例6：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为甲醇，压力为50MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30L/h，萃取4h，得第一次萃余物；再采用80％的乙醇为夹带剂，压力为25MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在20Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取4h，得第二次萃取液，对第二次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得黄酮类成分提取物。
本发明实施例7：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至1.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为80％的乙醇，压力为40MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在25L/h，萃取3h，得第一次萃余物；再采用70％的乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取3h，得第二次萃余物；再采用95％乙醇为夹带剂，压力为40MPa，温度为45℃，二氧化碳流量控制在10Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2.5h，得第三次萃取液，对第三次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得皂苷类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.07mol/L。
本发明实施例8：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为丙酮，压力为30MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10L/h，萃取2h，得第一次萃余物；再采用60％的乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2h，得第二次萃余物；再采用70％乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在20Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2h，得第三次萃取液，对第三次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得皂苷类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05mol/L。
本发明实施例9：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为乙酸乙酯，压力为50MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30L/h，萃取4h，得第一次萃余物；再采用80％的乙醇为夹带剂，压力为25MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在20Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取4h，得第二次萃余物；再采用85％乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取3h，得第三次萃取液，对第三次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得皂苷类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.09mol/L。
本发明实施例10：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至1.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为80％的乙醇，压力为40MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在25L/h，萃取3h，得第一次萃余物；再采用70％的乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为50℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取3h，得第二次萃余物；再采用95％乙醇为夹带剂，压力为40MPa，温度为45℃，二氧化碳流量控制在10Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2.5h，得第三次萃余物；再以95％乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在35Kg/h，对第三次萃余物进行第四次萃取，萃取2.5h，得第四次萃取液，对第四次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得萜类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.07mol/L。
本发明实施例11：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至0.3mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为丙酮，压力为30MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10L/h，萃取2h，得第一次萃余物；再采用60％的乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在10Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，先萃取2h，得第二次萃余物；再采用70％乙醇为夹带剂，压力为20MPa，温度为40℃，二氧化碳流量控制在20Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2h，得第三次萃余物；再以85％乙醇为夹带剂，压力为15MPa，温度为35℃，二氧化碳流量控制在25Kg/h，对第三次萃余物进行第四次萃取，萃取2h，得第四次萃取液，对第四次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得萜类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05mol/L。
本发明实施例12：一种超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法为：将黄芪、女贞子粉碎至2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，夹带剂为乙酸乙酯，压力为50MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30L/h，萃取4h，得第一次萃余物；再采用80％的乙醇为夹带剂，压力为25MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在20Kg/h，对第一次萃余物进行第二次萃取，先静态萃取1.5h，再动态萃取1.5h，得第二次萃余物；再采用85％乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为60℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第二次萃余物进行第三次萃取，先静态萃取1.5h，再动态萃取1.5h，得第三次萃余物；再以90％乙醇为夹带剂，压力为30MPa，温度为45℃，二氧化碳流量控制在30Kg/h，对第三次萃余物进行第四次萃取，萃取时间2.5h，得第四次萃取液，对第四次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得萜类成分提取物。
第三次萃取时，夹带剂中可加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05mol/L。
本发明实施例13：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～3中任一项的多糖类成分提取物，另取采用方法C提取的萜类成分、方法B提取的黄酮类成分及皂苷类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。
本发明实施例14：一种贞芪扶正滴丸，通过以下方法制备而成：取实施例4～6中任一项的黄酮类成分提取物，另取采用方法E提取的皂苷类成分、方法C提取的萜类成分及方法A或D提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将所述的药粉与基质在60～80℃下均匀混合，以10～50滴/分钟的速度滴入0～20℃的冷却剂中，即得贞芪扶正滴丸。
本发明实施例15：一种贞芪扶正糖浆剂，通过以下方法制备而成：取实施例7～9中任一项的皂苷类成分提取物，另取采用方法D提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；取蔗糖，加水，煮沸溶解后，滤过，放冷，在滤液中加入药粉及防腐剂、助溶剂和稳定剂，搅匀，滤过，药液加水，即得贞芪扶正糖浆剂。
本发明实施例16：一种贞芪扶正滴丸，通过以下方法制备而成：取实施例4～6中任一项的黄酮类成分提取物，取实施例7～9中任一项的皂苷类成分提取物，另取采用方法A提取的多糖类成分及方法C提取的萜类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将所述的药粉与基质在60～80℃下均匀混合，以10～50滴/分钟的速度滴入0～20℃的冷却剂中，即得贞芪扶正滴丸。
本发明实施例17：一种贞芪扶正分散片，通过以下方法制备而成：取实施例10～12中任一项的萜类成分提取物，另取采用方法B提取的黄酮类及皂苷类成分、方法A提取的多糖类成分；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；将该药粉按照常规工艺制备成分散片。
本发明实施例18：一种贞芪扶正胶囊，通过以下方法制备而成：取实施例1～3中任一项的多糖类成分提取物，取实施例4～6中任一项的黄酮类成分提取物，取实施例7～9中任一项的皂苷类成分提取物，取实施例10～12中任一项的萜类成分提取物；将上述各有效成分的干燥物混合，粉碎成药粉；在药粉中加入崩解剂、润湿剂、助流剂和吸收剂，制备成贞芪扶正胶囊。
上述实施例13-18中所述的方法A、方法B、方法C、方法D、方法E同下述实验例中的方法A、方法B、方法C、方法D、方法E。
为确保本发明所得制剂产品的药效，申请人对其药效进行了对比实验研究。
1、实验材料
1.1实验药物：
(1)按照本发明实施例13-18分别制得的贞芪扶正制剂。
(2)按现有工艺方法(即发明专利200310122216.7、200510038194.5)提取黄芪和女贞子中的多糖类成分、黄酮类成分、皂苷类成分、萜类成分后制得的贞芪扶正制剂。现有技术提取工艺如下：
①发明专利200310122216.7：
多糖类成分(现有技术方法A)：取黄芪、女贞子药材粉碎，加水煎煮三次，每次加6倍量水，煎煮1.0小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩至相对密度为1.15(20℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅匀，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
黄酮类及皂苷类成分(现有技术方法B)：取黄芪，加水煎煮三次，每次加6倍量水，煎煮1.0小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩至相对密度为1.15(20℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅匀，静置24小时，滤过，所得滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.10(20℃)的清膏，滤过，滤液通过D-101大孔树脂柱，用3倍树脂体积的水洗涤，再用4倍树脂体积的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇后，浓缩，干燥，即得。
萜类成分(现有技术方法C)：取女贞子药材粉碎，加80％乙醇回流提取三次，每次加6倍量乙醇，回流提取1小时，滤过，合并三次滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.10(20℃)的清膏，搅拌下加入2倍量水，静置24小时，滤过，沉淀物干燥，即得。
②发明专利200510038194.5：
多糖类成分(现有技术方法D)：将黄芪、女贞子加6～15倍量水煎煮3次，合并提取液，滤过，减压浓缩成每1mL相当于1.5g生药的药液，加乙醇至含醇量达60％～80％，静置24h，滤过，沉淀减压低温干燥，加适量蒸馏水溶解，再加乙醇至含醇量达60％～90％，静置24h，滤过，沉淀加蒸馏水溶解成1％的溶液，过中空纤维柱超滤，其截留分子量大于6000，超滤液减压浓缩至干，即得；
皂苷类成分(现有技术方法E)：将黄芪、女贞子水提醇沉后的上清液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水使沉淀溶解，滤过，用乙酸乙酯、正丁醇或异戊醇萃取三次，合并萃取液，用1％的氢氧化钠水溶液洗涤二次，弃去碱水液，减压回收有机溶剂并浓缩至干，即得。
1.2实验动物：昆明种小鼠，♀各半，体重20±0.7g，由贵阳医学院实验动物中心提供；实验室光照充足，通气良好，室温18～22℃，湿度50％～70％，按常规定期消毒；自由饮水、饮食，小鼠饲养笼分笼饲养，动物实验前观察适应5天，复查合格后开始进入正式实验。
2、实验方法
2.1抗疲劳作用
对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响：取小鼠210只，雌雄各半，随机分成21组(本发明制剂组18个，现有贞芪扶正制剂组2个，生理盐水对照组1个)，每组10只，连续给药15天，末次给药30分钟后小鼠分别单个放入250mL的广口瓶中，内加适量钠石灰并加盖，用凡士林密封瓶口，观察动物死亡时间，统计分析采用q检验。
结果：试验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂可使成年小鼠耐缺氧的时间明显延长(P<0.01)，结果见表9。
表9 贞芪扶正制剂对成年小鼠耐常压缺氧作用的影响
注：与对照组比较，*P<0.01。
2.2抗炎免疫作用
对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)吞噬鸡红细胞(CRBC)能力的影响：取成年鼠220只，随机分为22组(本发明制剂组18个，现有贞芪扶正制剂组2个，NS组、LMS组各1个)，每组10只，雌雄各半，分别灌胃本发明制得的贞芪扶正制剂、现有贞芪扶正制剂、LMS及等容量NS，共7天。停药后2小时，给每只小鼠腹腔注射5％(V/V)CRBC0.4mL，12小时后将小白鼠脱臼处死，仰位固定于鼠板。剪开腹部皮肤，经腹腔注入NS2mL；转动鼠板1分钟，然后吸取腹腔洗液1mL，滴于载玻片上；每片0.2mL置于37℃孵暖箱内保育30分钟，干后用4％姬姆萨-瑞特氏液染色5小时，油镜下每片计数100个MΦ，按下式计算胸腺指数和脾脏指数，实验结果见表10。
吞噬率＝(吞噬CRBC的MΦ/100个MΦ)×100％
吞噬指数＝被吞噬的CRBC/100个MΦ
表10 贞芪扶正制剂对小鼠腹腔MΦ吞噬功能的影响(n＝22)
实验表明，采用本发明工艺方法提取的有效成分制得的贞芪扶正制剂和现有贞芪扶正制剂均可明显的增加小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能，与免疫增强剂LMS的作用近似，并且本发明制得的贞芪扶正制剂比现有贞芪扶正制剂更能增强小鼠腹腔MΦ吞噬CRBC的吞噬功能。
综上所述，采用本发明工艺方法提取的有效成分制备的贞芪扶正制剂对小鼠的抗疲劳以及免疫功能均有明显调节作用，并且效果优于现有贞芪扶正制剂。
Claims (15)
1.超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法，其特征在于：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得萃取液，对萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得多糖类成分提取物。
2.根据权利要求1所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中多糖类成分的方法，其特征在于：萃取过程中,采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h。
3.权利要求1或2所述方法提取得到的多糖类成分提取物。
4.超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃取液，对第二次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得黄酮类成分提取物。
5.根据权利要求4所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中黄酮类成分的方法，其特征在于：第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h。
6.权利要求4或5所述方法提取得到的黄酮类成分提取物。
7.超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2～3h，得第三次萃取液，对第三次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得皂苷类成分提取物。
8.根据权利要求7所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第三次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者70％～95％乙醇为夹带剂，压力为20～40MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h。
9.根据权利要求7所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中皂苷类成分的方法，其特征在于：第三次萃取时，向夹带剂中加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05～0.09mol/L。
10.权利要求7、8或9所述方法提取得到的皂苷类成分提取物。
11.超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法，其特征在于：将黄芪、女贞子粉碎至0.3～2.0mm，并低温干燥，按2:1的重量比称取黄芪粉和女贞子粉，二者单独或者混合后进行萃取；以超临界二氧化碳为萃取剂，萃取2～4h，得第一次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第一次萃余物进行第二次萃取，萃取2～4h，得第二次萃余物；以超临界二氧化碳为萃取剂，对第二次萃余物进行第三次萃取，萃取2～3h，得第三次萃余物；再以超临界二氧化碳为萃取剂，对第三次萃余物进行第四次萃取，萃取1～2.5h，得第四次萃取液，对第四次萃取液进行减压蒸发、真空干燥，得萜类成分提取物。
12.根据权利要求11所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法，其特征在于：第一次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为30～50MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30L/h；第二次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者60％～80％的乙醇作为夹带剂，压力为20～30MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第三次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者70％～95％乙醇为夹带剂，压力为20～40MPa，温度为40～60℃，二氧化碳流量控制在10～30Kg/h；第四次萃取过程中，采用石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯或者85％～95％乙醇作为夹带剂，压力为15～30MPa，温度为35～45℃，二氧化碳流量控制在25～35Kg/h。
13.根据权利要求11所述的超临界萃取法提取贞芪组合物中萜类成分的方法，其特征在于：第三次萃取时，向夹带剂中加入物质的量比为4:1的琥珀酸二辛酯磺酸钠/辛基酚聚氧乙烯醚组成的复合表面活性剂，琥珀酸二辛酯磺酸钠的浓度为0.05～0.09mol/L。
14.权利要求11、12或13所述方法提取得到的萜类成分提取物。
15.一种贞芪扶正药物，其特征在于：所述药物的有效成分包含权利要求3所述的多糖类成分提取物和/或权利要求6所述的黄酮类成分提取物和/或权利要求10所述的皂苷类成分提取物和/或权利要求14所述的萜类成分提取物。
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