CN114681561A - 贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物提取制备领域，提供了一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括步骤粉碎、首次提取、首次脱溶、二次提取、二次脱溶、混合。本发明的有益效果在于，两次不同条件的超临界提取针对不同溶解性的活性成分分别提取，使得提取产物能够尽量保留各类有效成分。

Description

贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法
技术领域
本发明属于植物提取制备领域，具体涉及一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法。
背景技术
贞蓉丹合剂是一种长久历史的中药组方，主治养血、补益肝肾、滋阴养神。特别针对于中老年妇女因肝肾不足，气血不调所导致的腰膝酸软、神疲乏力、烦躁易怒、失眠健忘、精神不振、头晕耳鸣。
贞蓉丹合剂来源于ZL95104292.0所公开的一种调节女性性机能的口服液(商品名为坤柔液)，与前述专利在成分上的区别在于额外添加了牡丹皮。而前述专利对于贞蓉丹合剂在工艺上的并没有过多的研究，其制备方法仅为生药加水煎煮3次后醇提。
ZL200710045682.8公开了一种超临界二氧化碳梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法；此方法提取当归和川芎混合物中的总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类成分。此方法缺点在于，除了前述三类成分以外的活性成分被去除；也没有涉及到甾醇类和黄酮类成分的相关提取。
而由于目前贞蓉丹合剂的治疗有效性不错，故没有进一步研究其成分和制备工艺的动力。相关文献也仅有《指纹图谱结合一测多评模式在贞蓉丹合剂质量评价中的应用》、《贞蓉丹合剂对小树更年期综合症的影响》两篇，也不涉及其成分和制备工艺优化的研究。
发明内容
针对现有方法中对贞蓉丹合剂研究的不足，提出了一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法。
贞蓉丹合剂中一共具有16种中药成分，分别为熟地黄、白芍、当归、川芎、牡丹皮、丹参、鸡血藤、肉苁蓉、女贞子、淫羊霍、续断、黄柏、知母、酸枣仁(炒)、山茱萸和枸杞子。而在《指纹图谱结合一测多评模式在贞蓉丹合剂质量评价中的应用》中，以肉苁蓉、川芎、丹参、淫羊藿的主要成分松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷作为指标性成分去建立贞蓉丹合剂的指纹图谱；而其他12种中药的主要(活性)成分是什么；而且如何提取/炮制能够提高16种中药中的活性成分的含量在此文中均没有涉及到。
本发明的目的就在于，根据贞蓉丹合剂中16种组分的理化特性，有针对性的分类提取/炮制，在不改变药物来源的基础上通过工艺的改进从而提高贞蓉丹合剂中活性成分的含量。
贞蓉丹合剂的功能主治有三个，分别是养血、补益肝肾、滋阴养神；根据本发明的研究，其中：
熟地黄主要功能为养血，依靠其中的熟地黄多糖类；
白芍主要功能为养血，依靠其中的没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷类；
当归和川芎为经典药对，主要功能为养血，共同主要活性成分为β-谷甾醇、豆甾醇，阿魏酸；川芎还独有谷甾醇、叶酸、亚油酸乙酯、杨梅酮、川芎哚、川芎萘呋内酯、洋川芎醌碱等；
牡丹皮和山茱萸为经典药对，主要功能为补益肝肾(抗肝损伤)，共同主要活性成分为黄酮和甾醇类；
丹参主要功能为补益肝肾，依靠其中的丹参酮类；
鸡血藤主要功能为补益肝肾、活血；依靠其中的β-谷甾醇、木樨草素、豆甾醇、芒柄花素等；
肉苁蓉主要功能为补益肝肾(抗肝损伤)，依靠其中的松果菊苷、苯乙醇苷、毛蕊花糖苷；
淫羊霍和女贞子为经典药对，主要功能为补益肝肾(补肾)；共同主要活性成分为山奈酚、槲皮素；淫羊霍还独有淫羊藿苷、去水淫羊藿黄素、木犀草素；
续断主要功能为滋阴养神和养血；依靠其中的β-谷甾醇、龙胆黄素、谷甾醇、林生续断苷Ⅲ、当药糖苷、威岩仙皂苷A；
黄柏和知母为经典药对，主要功能为补益肝肾(养肾)和养血；共同主要活性成分为槲皮素、豆甾醇；黄柏还独有小檗碱、异山梨胺；知母还独有山奈酚、巴马汀。
酸枣仁(炒)主要功能为滋阴养神(治疗失眠)，依靠其中的斯皮诺素黄酮类；
枸杞子主要功能为养血、滋阴养神(免疫调节)，依靠其中的槲皮素、β-谷甾醇、阿托品、谷甾醇、多糖类。
经本发明研究利用网络药理学分析可知，贞蓉丹合剂中各种中药成分中最主要的成分为槲皮素等黄酮类；谷甾醇、豆甾醇等甾醇；还有多糖类、苷类和少量的生物碱等；
本发明为了最大限度的保留其中的黄酮类成分和甾醇类成分，采取以下的方法：
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
粉碎：将各组分称取后干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末；
提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取；
脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A；
二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取；
二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B；
混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
特别地，所述粉碎步骤中，干燥方法为冰冻干燥，冰冻干燥的条件为温度-50至-60℃，真空度为10-30pa；干燥至各组分的含水量为10-20％。
进一步地，干燥后将各组分过筛；筛的目数为≥24。
特别地，所述首次提取步骤中，所述中性夹带剂为75-95％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15-30ml/min；萃取温度为50-75℃；压力为45-60Mpa；萃取时间为90-120min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的6-12％。
特别地，二次提取步骤中，所述碱性夹带剂为含有1％-3％金属氢氧化物的30-50％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15-30ml/min；萃取温度为40-60℃；压力为30-45Mpa；萃取时间为90-120min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的6-12％。
所述的金属氢氧化物为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
本发明发现，在贞蓉丹合剂中，如熟地黄、牡丹皮、丹参等以黄酮类物质为主要活性物的成分，其容易溶于有机溶剂中和碱性水溶液中；而如川芎、当归、鸡血藤等以植物性甾醇则不溶于水、一般性酸和一般性碱；溶于有机溶剂中。
本发明与其他单一提取类的方法最大的不同在于，单一提取类的方法目的仅在于提取植物/微生物中的某一类成分，而其他成分与植物/微生物均作为副产品或者废料处理；而本发明则是需要尽可能保留中药材中的所有活性成分；更具体而言，如川芎中含有β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、叶酸、亚油酸乙酯、杨梅酮、川芎哚、川芎萘呋内酯、洋川芎醌碱等多种活性成分，本发明的目的就在于尽可能保留贞蓉丹所有活性成分，同时减少水分等溶剂的含量，从而达到浓缩的目的。
由于黄酮类成分和甾醇类成分的在水/有机溶剂中的溶解度不一样，而且黄酮类成分的溶解度根据其羟基数目、甲基化程度的不同会有所区别；黄酮类成分中的羟基与糖结合成苷后水溶性会提高，有机溶剂溶解性会减少；所以为了保留同时黄酮类成分和甾醇类成分，所以本发明采用二次超临界提取方法，分别针对黄酮和甾醇提取。
本发明的首次提取采用偏高压偏高温，高浓度的乙醇作为夹带剂进行二氧化碳超临界提取，针对的是甾醇类物质和其它溶于中性有机溶剂的物质；二次提取采用相对低压低温，低浓度的乙醇水溶液作为夹带剂进行二氧化碳超临界提取，针对的是黄酮类物质和其它易溶于水的物质。由于二次提取的夹带剂会中带有强碱，如果首次提取和二次提取的顺序颠倒，则有可能因为首次脱溶后的固形物(药渣)带有碱性，而甾醇类物质不溶于碱性中；容易导致无法正常提取。
本发明的粉碎采用的是冰冻干燥，因为本发明发现，如果采用风干、热干等干燥步骤对各组分进行预干燥的话，使得甾醇类容易被氧化；另外本发明发现，虽然一般情况下黄酮类不容易被氧化，但是采用风干、热干等方法时，依然会导致黄酮类物质被氧化。
而本发明的干燥程度后含水量依然较高，其目的就在于，本发明发现如果干燥程度较高，会导致部分黄酮类或者甾醇类物质也随着水分挥发，同时其他如多糖类、有机酸类会析出，也导致后续的损失。如果本发明不经干燥、粉碎直接提取，其提取率会大大降低；而不干燥直接粉碎，容易药材含水量较高，其内含的活性物质容易随着粉碎过程液体的流出而损失。
本发明首次脱溶或者二次脱溶的夹带剂可以回收循环利用，首次提取的夹带剂还可以调整比例作为二次提取的夹带剂使用，但二次提取的夹带剂不可再加工作为首次提取的夹带剂使用，是为了防止二次提取的碱性粒子夹杂在其中。
本发明的有益效果在于，两次不同条件的超临界提取针对不同溶解性的活性成分分别提取，使得提取产物能够尽量保留各类有效成分。
本发明两次提取后的产物为粉末状固体，可以加水加辅料后作为口服液体药，在不改变原来中药成分的情况下提高有效成分的含量；同时粉末状固体也方便运输、测量含量和加工。
下表1为本发明针对贞蓉丹合剂中各中药有可能起效的活性成分的相关检测项目和检测标准；其中检测方法为《保健食品检验与评价技术规范》中总黄酮的测定和相关的方法。
下表1为《药典》中针对药材的检测项目和检测标准。
表1
Figure BDA0003611776590000051
Figure BDA0003611776590000061
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在具体实施例中，没有详细说明的步骤、材料选择、数值参数均为现有技术中的常规选择，或者任何现有公开的现有技术。
实施例1
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末；
冰冻干燥温度为-50℃，真空度为≤20pa；干燥至各组分的含水量为20％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为95％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为30ml/min；萃取温度为75℃；压力为45Mpa；萃取时间为90min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的12％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有3％金属氢氧化物的50％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为30ml/min；萃取温度为60℃；压力为45Mpa；萃取时间为120min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的6％。
金属氢氧化物为氢氧化钠。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
实施例2
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末。
冰冻干燥温度为-60℃，真空度为≤10pa；干燥至各组分的含水量为15％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为75％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15ml/min；萃取温度为50℃；压力为60Mpa；萃取时间为90min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的6％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有1％金属氢氧化物的30％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为30ml/min；萃取温度为40℃；压力为30Mpa；萃取时间为100min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的12％。
金属氢氧化物为氢氧化钾。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
实施例3
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末。
冰冻干燥温度为-50℃，真空度为≤20pa；干燥至各组分的含水量为10％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为80％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为20ml/min；萃取温度为50℃；压力为60Mpa；萃取时间为90min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的9％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有1.5％金属氢氧化物的40％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为18ml/min；萃取温度为50℃；压力为38Mpa；萃取时间为90min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的8％。
金属氢氧化物为氢氧化钠。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
实施例4
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末。
冰冻干燥温度为-55℃，真空度为≤30pa；干燥至各组分的含水量为15％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为75％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为18ml/min；萃取温度为50℃；压力为45Mpa；萃取时间为120min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的12％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有3％金属氢氧化物的30％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为30ml/min；萃取温度为60℃；压力为45Mpa；萃取时间为120min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的6％。
金属氢氧化物为氢氧化钾。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
实施例5
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末。
冰冻干燥温度为-40℃，真空度为≤10pa；干燥至各组分的含水量为10％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为95％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15ml/min；萃取温度为75℃；压力为60Mpa；萃取时间为90min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的10％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有2.5％金属氢氧化物的50％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为26ml/min；萃取温度为55℃；压力为38Mpa；萃取时间为120min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的8％。
金属氢氧化物为氢氧化钾。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
实施例6
一种贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将各组分称取后冰冻干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末。
冰冻干燥温度为-40℃，真空度为≤20pa；干燥至各组分的含水量为10％；粉碎并过24目筛。
(2)首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取。
中性夹带剂为95％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为22ml/min；萃取温度为68℃；压力为52Mpa；萃取时间为105min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的10％。
(3)首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A。
(4)二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取。
碱性夹带剂为含有1％金属氢氧化物的46％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为22ml/min；萃取温度为52℃；压力为36Mpa；萃取时间为100min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的8％。
金属氢氧化物为氢氧化钠。
(5)二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B。
(6)混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
对比例1
与实施例1的区别在于，(1)粉碎步骤为直接粉碎，不经干燥。
对比例2
与实施例1的区别在于，(1)粉碎步骤为55℃热风烘干后直接粉碎。
对比例3
与实施例1的区别在于，先进行二次提取和二次脱溶，然后再进行首次提取和首次脱溶；对比例2首次脱溶和二次脱溶的参数与实施例1所用的首次脱溶和二次脱溶的参数一致。
对比例4
与实施例1的区别在于，没有(4)二次提取和(5)二次脱溶两个步骤，且步骤(2)首次提取的提取时间为210min。
对实施例和对比例所得到的混合提取物进行含量测试，结果如表2所示。
含量测试的方法为《药典》中针对药材的检测项目、检测标准以及被认可的检测方法。
表2
实例 芍药苷 淫羊藿苷 阿魏酸 丹参酮 丹皮酚 芒果苷 酸枣仁皂苷 枸杞多糖
实施例1 1.32 0.16 0.04 0.11 0.46 0.45 0.01 0.77
实施例2 1.21 0.14 0.08 0.10 0.46 0.45 0.01 0.73
实施例3 1.38 0.16 0.05 0.11 0.43 0.41 0.01 0.71
实施例4 1.24 0.15 0.05 0.11 0.40 0.38 0.01 0.65
实施例5 1.21 0.18 0.05 0.13 0.37 0.38 0.01 0.60
实施例6 1.29 0.18 0.07 0.10 0.42 0.35 0.02 0.77
对比例1 0.15 0.07 0.02 0.06 0.28 0.25 0.01 0.32
对比例2 1.02 0.10 0.03 0.08 0.03 0.28 0.01 0.35
对比例3 0.08 0.05 0.02 0.07 0.25 0.23 0.01 0.35
对比例4 0.10 0.10 0.04 0.05 0.10 0.23 0.00 0.35
从表2可知，除了酸枣仁皂苷此成分外，实施例的含量均高于对比例，对比例2、对比例4的丹皮酚含量很低、对比例1、3、4的芍药苷含量很低，可见本发明分两步超声波萃取的必要性。且实施例1-6的检测含量均符合《药典》中的检测标准。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
粉碎：将各组分称取后干燥，干燥后粉碎过筛，得粉末；
首次提取：将粉末加入萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入中性夹带剂进行超临界萃取；
首次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤得固形物和溶液；溶液回收中性夹带剂得提取物A；
二次提取：将固形物再次加入至萃取釜中，CO2作为萃取剂，并加入碱性夹带剂进行超临界萃取；
二次脱溶：将萃取后的混合物进行气液分离，过滤，取液体，液体回收碱性夹带剂，得提取物B；
混合：将提取物A和提取物B混合，得混合提取物。
2.根据权利要求1所述的贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，
所述粉碎步骤中，干燥方法为冰冻干燥，冰冻干燥的条件为温度-50至-60℃，真空度为10-30pa；干燥至各组分的含水量为10-20％。
3.根据权利要求2所述的贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，干燥后将各组分过筛；筛的目数为≥24。
4.根据权利要求1所述的贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，
所述首次提取步骤中，所述中性夹带剂为75-95％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15-30ml/min；萃取温度为50-75℃；压力为45-60Mpa；萃取时间为90-120min；中性夹带剂的加入量为粉末质量的6-12％。
5.根据权利要求1所述的贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，
所述二次提取步骤中，所述碱性夹带剂为含有1％-3％金属氢氧化物的30-50％vol的乙醇水溶液；CO2的流量为15-30ml/min；萃取温度为40-60℃；压力为30-45Mpa；萃取时间为90-120min；碱性夹带剂的加入量为粉末质量的6-12％。
6.根据权利要求5所述的贞蓉丹合剂中活性成分的提纯方法，其特征在于，所述的金属氢氧化物为氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
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