CN104147100A - 一种葛根总黄酮的医药用途 - Google Patents
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Abstract
一种葛根总黄酮的医药用途是在制备治疗骨质疏松症、特别是妇女绝经后原发性骨质疏松症药物中的应用。所述的葛根总黄酮是自野葛藤、根中由乙醇回流提取得到的提取物,该提取物中总黄酮含量>60%。本发明经去势手术这一标准模型动物实验表明,对骨质疏松症具有一定的治疗作用。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种植物中草药中活性成分的医药用途。具体地说一种是葛根总黄酮的医药
用途。
二、背景技术
葛根是一种药食两用的野生植物。通常用其块根或加工食用的葛根粉或提取药用活性成分。
申请人于2006年10月20日申请了一件治疗心脑血管疾病的药物组合物发明专利(200610113893.6)。该组合物有十三种组分,均取自葛根。并公开以下方法。
首先申请人用公知的乙醇提取法自葛根块根中制备提取液体,提取液浓缩后上D101大孔吸附树脂柱,乙醇洗脱,洗脱液浓缩后用硅胶层析柱、以氯仿一甲醇梯度洗脱,吸集各流份,再以凝胶SephadexLH-20柱纯化,从而得到芒柄花素-7-0-葡萄糖苷等十三种黄酮等活性成分。将该十三种活性组份按一定比例配伍后得到组合物以治疗心脑血管疾病。
黄酮类化合物的生物活性除心脑血管方面外,还有镇咳、祛痰活性、保肝活性、降低应激反应和对中枢神经系统的作用、抗菌、抗病毒活性、抗癌活性、抗氧化活性和性激素样作用等(《植物化学成分》、陈业高主编、化工业版社2004年4月出版、第240页)。
骨质疏松是一种伴随着骨量降低和骨微观结构退化从而导致骨易碎性,骨折发生增加的系统性骨骼性疾病。研究表明,骨质疏松的发生与雌激素水平降低密切相关,绝经后的骨质疏松是一种常见的严重的原发性骨质疏松,从绝经前2年开始到绝经后3年达到骨丢失的峰值,然后每年以骨量的3%-5%慢慢丢失。雌激素替代疗法是目前市面上最有效最常用的治疗绝经后骨质疏松的药物。然而,长期服用雌激素会造成严重的副作用,如增加子宫内膜癌、乳腺癌和卵巢癌的发病率。因此寻找高效低毒的抗骨质疏松药物成为现代药理学研究的重点内容之一。
三、发明内容
本发明旨在为骨质疏松症、特别是妇女绝经后原发性骨质疏松症患者提供一种有效的天然药物,所要解决的技术问题是通过标准模型动物实验以确认葛根总黄酮具有预防和治疗骨质疏松的作用,从而为进一步临床试验提供理论依据。
本发明所称的葛根总黄酮是自野葛藤、根中由乙醇提取得到的提取物,该提取物中含全部提取得到的黄酮类化合物。
将干燥的葛根藤、根粉碎后用70%-80%的乙醇提取,再回流提取1小时,提取2~4次,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至相至稠膏,加水,搅拌使溶解,滤过,滤液缓缓通过D8型大孔吸附树脂柱;用水缓缓洗脱,弃去水洗液,再用90%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,减压回收乙醇并浓缩至稠膏,最后干燥得到粉末状的提取物。提取物中总黄酮含量>60%。
总黄酮含量用公知的标准曲线法检测。
(1)对照品溶液的制备取葛根素对照品10mg,精密称定,置100ml量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含葛根素0.1mg)。
(2)标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml,分别置10ml量瓶中,加乙醇至1ml,再加水稀释至刻度,摇匀,以相应的试剂为空白,照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录V A)试验,在250nm的波长处测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
(3)供试品溶液的制备将本品研细,取细粉约10mg,精密称定,置50ml量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。
(4)测定法精密吸取供试品溶液1ml,置25ml量瓶中,加乙醇至2.5ml,照标准曲线项下的方法自“再加水稀释至刻度”起依法测定吸收度,从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮相当于葛根素的重量,计算,即得。
本发明所述的葛根总黄酮的医药用途就是葛根总黄酮在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。特别是在制备治疗妇女绝经后原发性骨质疏松症药物中的应用。
本发明以替勃龙片为对照,通过标准模型动物实验证明葛根总黄酮对骨质疏松症、特别是妇女绝经后原发性骨质疏松症有保护和预防性治疗作用。
四、附图说明
图1是葛根总黄酮对去势大鼠左胫骨微观结构的影响HE染色*40光学显微镜照片
A:正常组;B:假手术组;C:模型组;D:葛根总黄酮(50mg/kg)组;E:葛根总黄酮(100mg/kg)组;F:葛根总黄酮(200mg/kg)组;G:替勃龙(1.25mg/kg)组。
图2是葛根总黄酮对去势大鼠下丘脑GnRH mRNA的影响(n=3,)
M:Marker;1:正常组;2:假手术组;3:模型组;4:葛根总黄酮(50mg/kg)组;5:葛根总黄酮(100mg/kg)组;6:葛根总黄酮(200mg/kg)组;7:替勃龙(1.25mg/kg)组与正常组比较,△△P<0.01;与假手术组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01
五、具体实施方式
(一).标准模型动物实验
1材料与方法
1.1实验动物
雌性SPF级SD大鼠42只,体重(200±20)g,由安徽医科大学实验动物中心提供。
1.2药物与主要仪器
葛根总黄酮由安徽九方制药有限公司提供,总黄酮含量>60%,产品批号:120902;醋酸泼尼松购自浙江仙琚制药股份有限公司,产品批号:1211155;替勃龙片购自荷兰奥斯欧加农公司,产品批号:270163;Lunar iDXA双能X射线骨密度仪购自美国GE公司;E3000万能材料试验机购自英国英斯特朗公司;IX71光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。
1.3方法
1.3.1去势手术诱导骨质疏松模型制备及分组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.33ml/100g),在无菌条件下背部双侧切开皮肤,钝性分离,切除双侧卵巢,切口逐层缝合。假手术组暴露但不切除卵巢,正常组大鼠不予手术。术后恢复5d后,将去势大鼠随机分为5组,即去势模型组,阳性药替勃龙组(1.25mg/kg),
葛根总黄酮高剂量(200mg/kg),中剂量组(100mg/kg),低剂量组(50mg/kg)。
各组按上述剂量灌胃给药,每天1次,持续12周。正常组、假手术组及模型组灌胃给予等体积溶媒。实验室温度控制在20~25℃,湿度在50%~60%,各组大鼠自由饮水和摄食。
1.3.2测定指标
1.3.2.1子宫湿重和子宫指数的测定给药12周后处死大鼠,分离子宫,称重,并计算子宫指数。子宫指数=子宫重量(mg)/体重(g)
1.3.2.2右股骨骨密度(bone mineral density,BMD)和骨矿物含量(bone mineral content,BMC)含量的测定实验第12周,大鼠被10%水合氯醛(0.33ml/100g)麻醉后,用双能X射线骨密度仪测其右股骨BMD和BMC。
1.3.2.3左股骨生物力学及右肱骨干重和灰重的测定左股骨与肉组织分离干净,用万能实验材料机进行三点弯曲实验。跨距15mm,加载速度10mm/min[4]。右肱骨分离放入坩埚中放到马弗炉120℃烤8h后称其干重,然后继续放到马弗炉,800℃充分灰化6h后称其灰重。
1.3.2.4左胫骨组织形态学测定左胫骨分离用4%多聚甲醛固定5d,然后10%EDTA脱钙6周后用牙科电锯从矢状面剖开,暴露骨髓腔并取左胫骨近端,制备常规脱钙骨组织蜡块,用日本滑动式切片机切3μm厚骨组织切,HE染色,光镜下观察骨形态改变,并用Image-Pro Plus6.0软件计算骨形态指标:平均骨小梁间距(Tb.Sp),平均骨小梁厚度(Tb.Th)和平均骨体积分数(BV/TV)。
1.3.2.5尿液羟脯氨酸(hydroxyproline,HOP)、血清骨特异性碱性磷酸酶(bone-specificalkaline phosphatase,BALP)、卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和雌激素(estrogen,E2)含量测定结束治疗前1天,用代谢笼收集大鼠的尿液。第2天股动脉取血,4℃3000r/min离心10min,收集血清,血清和尿液放入-80℃待用ELISA法检测生化指标。
1.3.2.6下丘脑GnRH的mRNA表达大鼠处死后,分离下丘脑,称重,用TRIzol试剂裂解后分别提取各组总RNA,采用Fermentas逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,RT-PCR方法测定各组大鼠下丘脑GnRH的mRNA表达。引物序列:
GnRH,forward:5’-ATGGCAGAACCCCAGAACTT-3’,reverse:5’-AAATGCGGAA
GCCCACAC-3’,片段大小为214bp;β-actin,forward:
5’-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3’,reverse:5’-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3’,片段大小为266bp。GnRH PCR扩增条件为:95℃,40s;59℃,30s;72℃,60s;72℃,10min,35个循环。β-actin PCR扩增条件为:95℃,40s;62.9℃,30s;72℃,60s;72℃,10min,35个循环。
1.4统计学处理采用SPSS 12.0统计分析软件进行分析,数据以表示,组间差异采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD方法。
2结果
2.1葛根总黄酮对去势大鼠子宫湿重和子宫指数的影响对子宫湿重和子宫指数进行方差分析,结果显示各指标在各组间差异有统计学意义(F=3.659,P=0.006;F=4.799,P=0.001)。与正常组及假手术组比较,去势模型组大鼠子宫湿重和子宫指数均显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组大鼠比较,葛根总黄酮(50、100、200mg/kg)给药组大鼠子宫湿重和子宫指数无显著改变,差异无统计学意义。而替勃龙组子宫湿重和子宫指数显著升高(P<0.05),差异有统计学意义。见表1。
表1 葛根总黄酮对去势大鼠子宫湿重和子宫指数的影响(n=6,)
组别 | 剂量(mg/kg) | 子宫湿重(g) | 子宫指数(mg/g) |
正常 | 0.669±0.193 | 2.580±0.731 | |
假手术 | 0.695±0.178 | 2.729±0.650 | |
模型 | 0.402±0.144△△** | 1.448±0.494△△** | |
葛根总黄酮 | 50 | 0.422±0.142 | 1.437±0.535 |
100 | 0.436±0.153 | 1.576±0.590 | |
200 | 0.463±0.150 | 1.634±0.507 |
替勃龙组 | 1.25 | 0.635±0.182## | 2.277±0.793# |
与正常组比较:△△P<0.01;与假手术组比较:**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01
2.2葛根总黄酮对去势大鼠右股骨BMD和BMC含量的影响对右股骨BMD和BMC进行方差分析,结果显示各指标在各组间差异有统计学意义(F=3.965,P=0.004;F=2.593,P=0.035)。与正常组及假手术组比较,去势模型组大鼠右股骨BMD和BMC均显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药组显著增加去势大鼠右股骨BMD和BMC(P<0.05),差异有统计学意义。提示葛根总黄酮可改善去势手术引起的BMD和BMC含量降低。见表2。
表2 葛根总黄酮对去势大鼠右股骨BMD和BMC含量的影响(n=6,)
组别 | 剂量(mg/kg) | BMD(g/cm2) | BMC(g) |
正常 | 0.142±0.009 | 0.950±0.138 | |
假手术 | 0.146±0.006 | 1.000±0.126 | |
模型 | 0.125±0.008△△** | 0.767±0.103△△** | |
葛根总黄酮 | 50 | 0.135±0.007 | 0.850±0.105 |
100 | 0.138±0.011# | 0.933±0.186# | |
200 | 0.140±0.012## | 0.950±0.105# | |
替勃龙 | 1.25 | 0.142±0.006## | 0.967±0.137## |
与正常组比较:△△P<0.01;与假手术组比较:**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01
2.3葛根总黄酮对去势大鼠左股骨生物力学、右肱骨干重、灰重及灰重/干重的影响对左股骨最大荷载、右肱骨干重、灰重及灰重/干重进行方差分析,结果显示各指标在各组间差异有统计学意义(F=2.911,P=0.021;F=2.552,P=0.037;F=3.292,P=0.011;F=2.94,P=0.02)。与正常组及假手术组比较,去势模型组大鼠左股骨最大荷载、右肱骨干重、灰重及灰重/干重均显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药组最大荷载显著上升(P<0.05),而葛根总黄酮(50、100、200mg/kg)给药组均能显著提高骨干重,骨灰重,骨灰重/骨干重(P<0.05),差异有统计学意义。见表3。
表3 葛根总黄酮对去势大鼠左股骨生物力学和右肱骨干重、灰重的影响(n=6,)
组别 | 剂量(mg/kg) | 最大负荷(N) | 干重(g) | 灰重(g) | 灰重/干重 |
正常 | 161.21±12.75 | 0.316±0.016 | 0.195±0.012 | 0.619±0.020 | |
假手术 | 165.66±10.51 | 0.319±0.016 | 0.201±0.018 | 0.629±0.030 | |
模型 | 139.06±15.73△△** | 0.290±0.009△△** | 0.165±0.011△△** | 0.570±0.025△△** |
葛根总黄酮 | 50 | 146.33±15.95 | 0.308±0.011# | 0.185±0.011# | 0.602±0.016# |
100 | 156.28±14.53# | 0.308±0.010# | 0.186±0.013# | 0.605±0.031# | |
200 | 160.22±10.22## | 0.310±0.012# | 0.189±0.020# | 0.607±0.035# | |
替勃龙 | 1.25 | 159.36±13.37# | 0.317±0.020## | 0.194±0.021## | 0.610±0.022# |
与正常组比较,△△P<0.01;与假手术组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01
2.4葛根总黄酮对去势大鼠左胫骨组织形态的影响HE染色结果提示,去势模型大鼠左胫骨骨小梁变细、断裂,数量减少,排列疏松紊乱。葛根总黄酮(100,200mg/kg)给药组使骨小梁变粗变密,骨的连续性好,排列尚规则,成网状结构。见图1。对平均骨小梁间距、平均骨小梁体积、平均骨体积分数进行方差分析,结果显示各指标在各组间差异有统计学意义(F=30.387,P<0.001;F=4.037,P=0.004;F=25.317,P<0.001)。与正常组及假手术组比较,去势模型组大鼠左胫骨平均骨小梁厚度、平均骨体积分数均显著降低(P<0.01),平均骨小梁间距显著升高(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药后可显著升高去势大鼠左胫骨平均骨小梁厚度和平均骨体积分数(P<0.05),并降低平均骨小梁间距(P<0.05),差异有统计学意义。见表4。
表4 葛根总黄酮对去势大鼠左胫骨组织形态的影响(n=6,)
组别 | 剂量(mg/kg) | Tb.Th(mm) | Tb.Sp(mm) | BV/TV |
正常 | 0.074±0.009 | 0.140±0.015 | 0.501±0.026 | |
假手术 | 0.076±0.006 | 0.144±0.021 | 0.492±0.028 | |
模型 | 0.031±0.005△△** | 0.176±0.014△△** | 0.298±0.029△△** | |
葛根总黄酮 | 50 | 0.035±0.007 | 0.172±0.018 | 0.321±0.038 |
100 | 0.056±0.005## | 0.156±0.016# | 0.407±0.022## | |
200 | 0.067±0.012## | 0.150±0.021# | 0.434±0.025## | |
替勃龙 | 1.25 | 0.068±0.010## | 0.147±0.012## | 0.451±0.016## |
与正常组比较:△△P<0.01;与假手术组比较:**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01
2.5葛根总黄酮对去势大鼠尿HOP、血清BALP、FSH、LH和E2的影响尿HOP、血清BALP、FSH、LH和E2水平进行方差分析,结果显示各指标在各组间差异有统计学意义(F=13.089,P<0.001;F=4.863,P=0.010;F=11.230,P<0.001;F=7.433,P<0.001;F=20.983,P<0.001)。与正常组及假手术组比较,去势模型组大鼠尿液HOP,血清BALP、FSH、LH水平均显著升高(P<0.01),血清E2水平显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。葛根总黄酮(100、200mg/kg)治疗后尿HOP和血清BALP、FSH和LH水平显著降低(P<0.05),差异有统计学意义。见表5。
表5 葛根总黄酮对去势大鼠尿HOP、血清BALP、FSH、LH和E2的影响(n=6,)
组别 | 剂量(mg/kg) | HOP(μg/ml) | BALP(ng/ml) | FSH(IU/L) | LH(mIU/ml) | E2(pg/ml) |
正常 | 13.85±2.88 | 3.08±0.31 | 2.61±0.26 | 13.36±0.84 | 36.60±4.21 | |
假手术 | 14.79±2.18 | 3.19±0.35 | 2.79±0.28 | 13.46±0.52 | 35.56±5.84 | |
模型 | 25.59±3.77△△** | 3.84±0.20△△** | 3.91±0.39△△** | 15.82±1.00△△** | 22.90±2.92△△** | |
葛根总黄酮 | 50 | 24.53±3.60 | 3.69±0.35 | 3.56±0.36 | 15.15±0.99 | 24.11±3.157 |
100 | 19.84±3.68## | 3.44±0.25# | 3.26±0.42## | 14.54±0.73# | 24.41±2.96 | |
200 | 17.136±2.77## | 3.250±0.29## | 3.028±0.25## | 13.65±1.12## | 24.76±3.30 | |
替勃龙 | 1.25 | 16.43±2.73## | 3.35±0.34## | 2.98±0.32## | 13.48±0.80## | 34.73±3.21## |
与正常组比较,△△P<0.01;与假手术组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01
2.6葛根总黄酮对去势大鼠下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)mRNA的影响
下丘脑GnRH mRNA相对表达量进行方差分析,结果显示其在各组间差异有统计学意义(F=28.759,P<0.001)。与正常组及假手术组比较,模型组下丘脑GnRH mRNA水平显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药组显著提高下丘脑GnRH mRNA水平的表达(P<0.01),差异有统计学意义。见图2。
3讨论
绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)是困扰围绝经期妇女的重要健康问题之一。其主要原因是由于卵巢功能低下导致雌激素明显减少,引发骨偶联过程失衡,导致破骨细胞性骨吸收作用超过了成骨细胞性骨形成作用,继而导致净骨量减少、骨强度降低、骨脆性增加。雌激素替代疗法可有效缓解PMO临床症状,提高患者生活质量,但可引发子宫出血及与雌激素水平升高相关的肿瘤发生风险增高。鉴于异黄酮类植物雌激素在防治糖皮质激素性骨质疏松、绝经后骨质疏松症等方面的作用,并且无雌激素样不良反应,本研究系统观察了葛根总黄酮对去势诱发的大鼠骨质疏松的治疗作用。
骨密度和骨量下降以及骨微结构是骨质疏松的主要病理改变,动物实验中采用去势手术可模拟这一临床改变,因而已成为研究PMO的“金标准”模型。本研究结果表明,去势大鼠血清雌激素水平、子宫湿重及子宫指数显著降低,右股骨BMD和BMC以及右肱骨干重、灰重及灰重/干重均显著降低,提示去势手术可诱发雌鼠PMO样改变。葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药12周可显著改善上述改变,HE染色结果进一步证实葛根总黄酮可改善去势诱导的大鼠骨小梁变细、断裂,数量减少,排列疏松紊乱等病理改变,提示葛根总黄酮可对去势手术诱导的雌鼠BMD和骨量下降、骨微结构改变有一定的治疗作用。
骨脆性是骨强度降低和骨微观结构退化共同作用的结果。本研究结果表明,葛根总黄酮(100、200mg/kg)不仅增加去势大鼠骨生物力学特性,还增加了骨小梁厚度和平均骨体积分数,抑制了骨小梁的降解,从而达到了骨保护作用。
骨质疏松是由于骨吸收大于骨形成造成的一种高转换负平衡状态。本研究结果表明,去势雌鼠骨吸收指标尿HOP和骨代谢指标血清BALP水平均显著升高,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药可明显降低羟脯氨酸和碱性磷酸酶水平,进一步证实葛根总黄酮可降低骨代谢,有效缓解去势手术诱导的骨质疏松。下丘脑-垂体-性腺轴的调节失衡是导致PMO的主要原因之一。研究表明,在骨组织骨盐沉淀的过程中ER-β起到正调节的作用,从而增加成骨细胞的增值,增加骨形成,抑制破骨细胞的功能,降低骨吸收。卵泡生成素在调节骨代谢方面也发挥至关重要的作用,雌激素水平的降低和卵泡生成素水平的升高将加速骨吸收和骨量的丢失。FSH直接增加破骨细胞生成和骨吸收,低含量的FSH在骨质疏松中直接调节骨量达到保护的作用。本研究结果表明,去势雌鼠血清雌激素水平及下丘脑GnRH的mRNA表达显著降低,血清FSH和LH水平升高,葛根总黄酮(100、200mg/kg)给药虽然对血清雌激素水平无显著影响,但可显著提高下丘脑GnRH mRNA表达,并使血清FSH和LH水平降低。提示葛根总黄酮对去势手术诱导的雌鼠骨质疏松的治疗作用可能与其对下丘脑-垂体-性腺轴的调节有关。
综上所述,本研究结果表明,葛根总黄酮可有效改善去势手术诱导的雌鼠骨质疏松,其作用机制可能与调节下丘脑-垂体-性腺轴有关。由于葛根总黄酮来源于药食同源植物葛藤,不良反应小,其临床开发和作用机制研究将为骨质疏松的治疗药物开发提供新的思路。
(二).制剂加工
1.口服片剂(1000片)
取葛根总黄酮100g(80目筛)、淀粉100g和糊精25g混合均匀,加15%淀粉浆适量制软材、湿粒,60~70℃干燥并整粒,加入25g羧甲淀粉钠和3g硬脂酸镁混合均匀后压片。
规格250mg、每片含葛根总黄酮100mg。
2.硬胶囊剂(1000粒)
取葛根总黄酮250g,混匀,装入胶囊,制成1000粒,即得。每粒含葛根总黄酮250mg。
Claims (2)
1.一种葛根总黄酮的的医药用途,其特征在于:葛根总黄酮治疗骨质疏松症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的葛根总黄酮的医药用途,其特征在于:葛根总黄酮在制备治疗妇女绝经后原发性骨质疏松症药物中的应用。
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