CN100358543C - 一种治疗骨质疏松症的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗骨质疏松症的药物组合物，它是由补骨脂、葛根为原料制备而成的药剂。本发明还提供了其活性成分补骨脂总香豆素、补骨脂总黄酮、葛根黄酮为原料制备而成的药剂。本发明还提供了该药物组合物的制备方法。本发明选择原料达到协同增效的作用，制备成中药缓释剂型，使缓释功效充分适于本发明的适应症，达到长效目的，药效明确，质量稳定，可控性强，为临床提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗骨质疏松症的药物组合物，具体地，它是由补骨脂、葛根为原料制备而成的药物组合物。
背景技术
骨质疏松症是最常见的老年病之一，目前世界上大约有2亿人患有骨质疏松症，其发病率已跃居世界各种常见病的第7位，医学专家已将其列为21世纪影响人类健康的严重疾病之一。骨质疏松的发病过程是缓慢、渐进的，比较隐蔽的，不易被觉察，直接后果是骨折，可因创伤诱发，严重时甚至在步行、咳嗽和提重物时发生脊锥或髋部骨折，脊锥骨折可导致持续性神经痛或瘫痪，数个锥体塌陷可导致胸腹腔容积减小，压迫内脏器官而影响其功能。
目前治疗骨质疏松的药主要分为以下三类，抗骨质吸收类，主要通过抑制破骨细胞的活性减少钙排泄，如雌激素类、双磷酸盐类、降钙素；促骨质形成类：如氟化物、同化激素等；促进骨矿化类：如维生素D、钙及硼制剂等。
激素替代疗法用于防治妇女绝经后骨质疏松已有多年历史，而长期单独使用雌激素有增加子宫癌发生的危险。选择性雌激素受体调节剂(Selgtive Estrogen ReceptorModulators，SEMRs)，是一类具有芳环结构可与雌激素受体结合的化合物，其中雷洛昔芬(Raloxifene)已上市试用于骨质疏松症，虽不增加致癌危险，但随着临床研究规模的扩大和时间的延长，发现雷洛昔芬防治骨质疏松的效果并不明显。双磷酸盐类可通过降低破骨细胞的作用，诱导破骨细胞调亡而减少骨吸收，减轻骨痛，改善骨组织征象，主要用于治疗有明显骨吸收增强的疾病。长期服用此类药可抑制骨矿化，第一代磷酸盐通常治疗1-2年后，骨量增加到一稳定值后，不再有进展，少数患者用药后出现高磷酸盐血症和骨软化症等不良反应。第二、三代磷酸盐类有胃肠道不适、低血钙及低磷血症及皮疹等不良反应。钙制剂品种多达200种以上，钙源不同，理化性质不同，各种制剂的吸收率差异大，疗效不确切，L-苏糖酸钙及氨基酸螯合钙疗效较好，但价格昂贵。维生素D及其衍生物在体内容易蓄积，易发生维生素D中毒，表现为高钙血症、高尿钙、甚至脏器结石，服用此类药应有严格指征，并定期测定尿钙。
目前临床上治疗骨质疏松的中药大多疗效不确切，作用不可靠，剂型相对落后，多为一、二代剂型，日服剂量大，且服用次数多，给患者带来极大的不便。申请号02154159.0公开了一种预防、治疗骨质疏松症的药物，它是由骨碎补、肉苁蓉、补骨脂、淫羊藿、西洋参等天然植物(中药)为原料制备而成的药剂。由于原料选择不同，用量不同，治法治则不同，目前尚无由补骨脂、葛根为原料制备的治疗骨质疏松的药物的报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种治疗骨质疏松症的药物组合物，它是由补骨脂、葛根为原料制备而成药剂。本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。
本发明提供的治疗骨质疏松症的药物组合物，是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：
补骨脂6～9份、葛根9～15份。
优选的方案是，它由下述重量配比的原料制备而成的药剂：
补骨脂10份、葛根10份。
是由补骨脂总香豆素、补骨脂总黄酮，葛根总黄酮为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
其中，所述的补骨脂总香豆素以补骨脂素计，重量百分比不低于24％、补骨脂总黄酮以补骨脂甲素计，重量百分比不低于26％；葛根总黄酮以葛根素计，重量百分比不低于70％。
所述治疗骨质疏松症的药物组合物是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份。
因补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮较难分离，因此，将其同时提取。
进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成药剂：补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1份、葛根总黄酮1份。
所述的药剂是：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、缓释制剂。
所述的缓释制剂是由下述重量配比的原料及辅料制备而成的：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份、缓释制剂用辅料：1～10份。
所述的缓释制剂用辅料为：乙基纤维素EC、羟丙甲基纤维素HPMC、苏丽丝surelease、乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、醋酸纤维素、胶联聚维酮、聚丙烯酸树脂中的一种或任意两种或两种以上混合。
优选方案，缓释制剂由下述重量配比的原料及辅料制备而成：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份、EC0.5～10份、HPMC0.2～1.0份。
进一步地，它是由下述重量配比的原料及辅料制备而成：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1份、葛根总黄酮1份、EC0.5份、HPMC0.5份。
本发明提供的制备治疗骨质疏松症的药物组合物的方法，包括如下步骤：
a、取补骨脂，加有机溶剂提取，得补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物；
b、取葛根，用30～90％乙醇回流提取，乙醇提取液减压回收乙醇，滤过，通过吸附树脂柱，以30％～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，即得葛根总黄酮；
c、将b、c步骤制备的补骨脂总香豆素、葛根总黄酮按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的剂型：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份。
其中，b步骤所述的回流提取乙醇浓度为30％乙醇；乙醇洗脱的浓度为70％乙醇。
补骨脂最早记载于《雷公炮炙论》，主治五劳七伤，骨髓伤败。《药性论》、《开宝本草》、《本草图经》、《本草纲目》中均有记载。李时珍曰：补骨脂言其功也；破固纸属火，可收剑神明，能使心包之火与命门之火相通，故元阳坚固，骨髓充实，补骨脂丸可壮筋骨，益元气。《经验后方》记载，补骨脂炒为末，温酒服下，治肾虚腰痛，神妙。《和剂局方》记载，青娥丸治肾气虚弱，腰痛如折，妇人淡醋汤下，常服壮筋骨，活血脉。葛根始载于《本经》，列为中品，味甘，平，“主诸痹”。葛根所治之痹，为“麻木不仁”之痹，其临床表现与骨质疏松所致的症状相似。《日华子本草》有葛根“破血”的明确记载，葛根可以活血通络。《肘后方》记载，肾腰疼痛，生葛根嚼之咽汁，取效乃止。《朱良春用药经验》记载，“以益肾壮骨治其本”，必用葛根，认为葛根能“疗骨痹，解痉通脉”。胡希恕的《经方传真》中记载葛根汤，他认为“腰肌劳损，本无表证之明征，用本方治之屡效”。胡老曾用葛根汤加减治疗骨痿，取得较好的临床疗效。现代研究表明，葛根总黄酮能有效防治骨质疏松。谈志龙等研究葛根对去卵巢大鼠骨代谢生化指标的影响，结果表明，葛根能增加雌二醇(E2)、抑制骨吸收、促进骨形成，从而发挥治疗骨质疏松的作用。
通过药效学试验说明，本发明药物原料补骨脂、葛根配伍，能有效的治疗骨质疏松症，达到协同增效的作用，其中进一步将补骨脂的活性成分补骨脂总香豆素、补骨脂总黄酮及葛根活性成分葛根总黄酮配比使用，同样发挥协同增效的作用，且由于有效部位确定，减少服用剂量，便于制剂及制备成中药缓释剂型，使缓释功效充分适于本发明的适应症，达到长效目的；另外补骨脂和葛根均为药食同源的品种，该制剂不仅有治疗作用，还有预防保健作用，共同达到防治结合，标本同治的目的。综上，本发明药物原料补骨脂总香豆素、补骨脂总黄酮、葛根总黄酮配伍使用，达到协同增效的作用，药效明确，质量稳定，可控性强，为临床提供了一种新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以作出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明药物胶囊剂的制备
取原料补骨脂9kg、葛根9kg，分别加50％乙醇回流提取，回收乙醇，浓缩成稠浸膏，加15-50％的辅料制粒，装胶囊。
实施例2本发明药物片剂的制备
补骨脂6kg、葛根9kg，分别加90％乙醇回流提取，回收乙醇，浓缩成稠浸膏，加15-50％的辅料制粒，压片。
实施例3本发明药物颗粒剂的制备
补骨脂9kg、葛根15kg，分别加30％乙醇渗漉，回收乙醇，浓缩成稠浸膏，加15-50％的辅料制成颗粒。
实施例4本发明药物微丸的制备
补骨脂6kg、葛根15kg，分别加50％乙醇回流提取，回收乙醇，喷雾干燥，喷干粉加10-50％的辅料于高效包衣锅中滚圆，筛选20-40目的微丸。
实施例5 本发明药物原料的提取方法
补骨脂加6倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次1h，合并滤液，浓缩至浓度为0.5g/ml时，加3倍量水沉淀，静置24小时，弃上清液，取沉淀，加3倍量的正己烷萃取脱脂，弃去正己烷，沉淀真空减压干燥，得补骨脂总黄酮和补骨脂总香豆素混合的补骨脂治疗骨质疏松的有效部位。
葛根加9倍量30％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并滤液，浓缩至浓度为0.5g/ml，以60倍树脂床体积的量加于SP207大孔树脂柱顶，药液PH为5-6，吸附速率为2BV/h，用4倍树脂床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至相对密度为1.02-1.05，进行喷雾干燥，进料速度为50-50ml/min，进风温度为135-145℃，出风温度为75-85℃，得到葛根治疗骨质疏松的有效部位葛根总黄酮。
实施例6本发明药物胶囊剂的制备
取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1kg、葛根总黄酮1kg，加10-50％的辅料制粒，60℃干燥，整粒，装胶囊，即得。
实施例7本发明药物片剂的制备
取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物5kg、葛根总黄酮1kg，加10-50％的辅料制粒，压片。
实施例8本发明药物颗粒剂的制备
取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物5kg、葛根总黄酮3kg，加10-50％的辅料制成颗粒，包装。
实施例9本发明药物微丸的制备
取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物4kg、葛根总黄酮3kg，加10-50％的辅料制粒，加10-50％的辅料于高效包衣锅中滚圆，筛选20-40目的微丸。
实施例10提供本发明缓释制剂的制备方法
缓释微丸：取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物2kg、葛根总黄酮1kg，加15％的粒粉滚动成20-40目的微丸，用15％的苏丽丝进行包衣，使微丸增重7-15％，即得缓释微丸。
缓释片：取补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1kg、葛根总黄酮1kg，制粒，压片，用15％的苏丽丝进行包衣，使片剂增重5-10％，即得缓释片。
实施例11 本发明缓释药物辅料种类的选择试验
乙基纤维素(EC)为不溶性骨架材料，化学性质稳定，无毒，无药理活性，为常用的不溶性骨架材料，也可作为缓释包衣液用，已广泛用于缓释剂的制备中，缓释效果好；羟丙甲基纤维素(HPMC)为亲水凝胶骨架材料，遇水或消化液膨胀，形成凝胶屏障而具有控制药物溶出的性质，羟丙甲基纤维素用量少时，与乙基纤维素合用进行包衣，有一定的致孔剂的作用，从而改善药物的溶出效果。苏丽丝(surelease)是一种使用乙基纤维素作为控释材料，含成膜剂、增塑剂和稳定剂的水性分散体，是一种简单易用的全水包衣系统，而且药物的释放不受PH值的影响，可用于颗粒、小丸及片剂的包衣。苏丽丝避免自配包衣处方的筛选难度和时间，降低操作难度，提高生产效率。
固体分散法
按表1的处方配比，将骨架剂分别溶于80％的乙醇中，按处方量加入中间体使之溶解，回收乙醇，50℃干燥1小时，研细，装胶囊，测定葛根总黄酮的体外释放度。体外释放度测定方法为转篮法，转速100±1r/min，温度37±0.5℃，释放介质为900mlpH＝7.4的磷酸盐缓冲液，在上述条件下，于不同时间点取样5ml(取样后立即补加5ml溶出介质)，加稀盐酸调pH至5-6，水浴蒸干，加5ml氯仿超声10min，弃去氯仿液，残渣再加10ml甲醇溶解，过滤，滤液加甲醇定容至25ml，于250nm处测定吸光度，计算葛根总黄酮的累积释放度。
表1 固体分散法处方表
| 处方号 | 中间体(％) | EC(％) | HPMC<sub>K50</sub>(％) |
| 123 | 959595 | 5--2.5 | --52.5 |
表2 不同辅料的缓释胶囊中葛根总黄酮的累积释放度(％)(n＝3)
从表2可以看出，当辅料用量为5％时，在第1小时溶出即达80％左右，未能达到缓释的效果，考虑将辅料比例增大，以期获得缓释效果。
表3辅料用量考查处方表
| 处方号 | 中间体(％) | EC(％) | HPMC<sub>K50</sub>(％) |
| 123456 | 808080505050 | 20--1050--25 | --2010--5025 |
表4不同辅料的缓释胶囊中葛根总黄酮的累积释放度(％)(n＝3)
从表3、4可以看出，只有当辅料增至50％时，可以获得缓释效果，日服剂量为3.1g，不能满足制剂剂量的需要，辅料用量过大，且增加成本，故考虑选用其它制备方法。
骨架型缓释微丸
按表5的处方，将药物细粉与阻滞剂混合，过100目筛，取部分混合粉置于包衣锅中起模，剩余混合粉加大成型，制得骨架微丸，装胶囊，按上述条件测定葛根总黄酮的累积释放度。
表5骨架型微丸处方表
| 处方号 | 药物组合物(％) | EC(％) | HPMC(％) |
| 123456 | 505050303030 | 50--2570--35 | --5025--7035 |
表6骨架型微丸葛根总黄酮累积释放度测定结果
从表5、6可以看出，药物的释放量随阻滞剂用量的增加而减少，而当辅料的用量高达药粉的2.3倍时，还没有达到理想的缓释效果，再增加辅料的用量，有可能达到较好的缓释效果，但同时也增加了服用剂量和生产成本。而膜控型微丸辅料用量相对较少，故改制膜控型微丸。
膜控型缓释微丸
膜控型微丸是将药物首先制成丸心后，再在丸芯外包不同厚度的缓释衣，达到药物缓慢释效的目的，而且还具有改善外观、味道、增加药物稳定性的特点。
素丸的制备
本药物组合物遇水易粘结，制丸操作困难，可加入适量辅料来加以改善，选用价廉易得的淀粉，与药物组合物混匀，用部分混合粉泛制丸心，剩余粉层层加大滚圆，筛取20-40目的微丸。
将不同量的淀粉与药粉混匀，过100目筛，置于包衣锅中，以80％的乙醇作粘合剂，取部分混合粉泛丸心，剩余粉加大，以操作的难易程度、丸的圆整度为评价标准，以此确定辅料的用量。
当辅料用量为15％时，操作容易进行，微丸较圆整，丸间只有少量粘连，故把淀粉的用量定为15％。
骨架型缓释片
将药物组合物与骨架材料按表7混合，过100目筛，用70％乙醇制粒，过14目筛，50℃干燥1小时，用16目筛整粒，加入助流剂及润滑剂混匀，压成0.4g重的片子，按上述方法测定释放度。
表7药物组合物与辅料不同配比表
| 处方号 | 药物组合物(％) | EC(％) | HPMC<sub>K50</sub>(％) |
| 123456 | 808080505050 | 20--1050--25 | --2010--5025 |
表8骨架型缓释片释放度测定结果
从表8可以看出，随着骨架剂用量的增加，释放速度减慢，但当骨架剂用量为20％时，未能达到缓释的目的，而当辅料用量为50％时，虽能达到一定的缓释效果，但辅料用量很大，日服剂量超过3g，不能满足制剂的要求。故改成膜控型缓释片，以期能减少辅料的用量。
膜控型缓释片
填充剂的选择
将浸膏粉与不同比例的淀粉混合过100目筛，置于包衣锅中，喷入50％乙醇转动制粒，继续在锅中转动至干燥，压片，比较所制备的各种片子的外观、硬度、可压性，结果标明，所制备的药片的各项性能指标无明显差异，从降低成本、简化工艺的角度考虑，可以不加填充剂。
润滑剂种类的考查
润滑剂能增加颗粒的流动性，减少片重差异，具有抗粘附性的特点，避免粘冲，使片剂表面光洁美观，还可以降低片剂与模孔间的摩擦力，易于出片，降低冲模的磨损。
取干颗粒适量，分别加入0.5％的硬脂酸镁、0.5％的滑石粉、以及0.5％的微粉硅胶混匀，按固定漏斗法测定颗粒的休止角，结果标明，加入硬脂酸镁后，该颗粒休止角为37.1°，助流性较其他两种润滑剂更好，故选择硬脂酸镁作为润滑剂。
润滑剂用量的考查
取干颗粒适量，分别加入颗粒量0.25％、0.5％、1％的硬脂酸镁混匀，测定休止角；当润滑剂用量为颗粒重量的0.5％时，已有较好的流动性。
各种制备方法综合比较
从制备工艺的操作难度，辅料的用量以及释放情况对上述各种制备方法进行综合比较，选出适合本处方的剂型。比较结果见表9。
表9 各种制备方法综合比较结果
| 剂型 | 制备方法 | 辅料用量 | 操作难易 | 外观 | 释放度 |
| 胶囊剂片剂 | 固体分散法微 骨架型丸 膜控型骨架型膜控型 | ＞50％＞70％＜25％＞50％＜10％ | 易较难较难易易 | 颗粒状较圆较圆，表面光滑表面光洁表面光亮 | 快快缓慢，符合要求快缓慢，符合要求 |
从表9可以看出，该处方可以制成膜控型缓释微丸和缓释片，但制备片剂比微丸操作更简便，辅料用量更少，服用量小，成本低，符合大生产的要求，故将其制成膜控型缓释片最佳选择。
实施例12 本发明药物制剂的质量控制方法
一、采用紫外分光光度法测定制剂中补骨脂香豆素类和补骨脂黄酮的含量：
供试品溶液的制备
取本发明药物缓释片剂10片，研细，取0.25g，精密称定，加20ml氯仿超声提取30min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇溶解，定容至100ml，精密吸取1ml，加甲醇稀释成50ml，作为测定总香豆素含量的供试品溶液。取0.25g，精密称定，加20ml甲醇超声提取30min，滤过，加甲醇定容至100ml，精密吸取1ml，加甲醇稀释成50ml，作为测定总黄酮含量的供试品溶液。
吸收波长的选择
补骨脂中香豆素类成分有共同的呋喃母核结构，紫外吸收基本一致，故选用补骨脂素为对照品，总香豆素的含量以补骨脂素计。取补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，在200-400nm处进行紫外扫描，测定最大吸收波长为243nm，将供试品溶液紫外扫描的最大吸收波长也为243nm，故选择总香豆素的测定波长为243nm。
补骨脂中黄酮类成分紫外吸收有较大的差别，无法以某单一黄酮的吸收波长作为测定波长，通过预试试验，用NaOH显色后，黄酮的吸收峰均红移至440nm，供试品溶液紫外扫描最大吸收波长也在440nm，故选择440nm作为总黄酮的测定波长，又药效学试验证明补骨脂甲素为其中的有效成分之一，故以补骨脂甲素为对照品测定总黄酮的含量。
标准曲线的绘制
取补骨脂素对照品6.3mg，精密称定，加甲醇溶解成25ml，再精密吸取1ml，加甲醇稀释成25ml，然后分别精密吸取稀释液1、2、3、4、5，加甲醇定容至10ml，于243nm处测定吸光度。
取补骨脂甲素对照品2.05mg，精密称定，加甲醇溶解成50ml，然后分别精密吸取稀释液1、1.5、2、2.5、3ml，加1ml10％NaOH甲醇液，用甲醇定容至10ml，50℃水浴加热2h，放冷，于440nm处测定吸光度。
结果补骨脂素、补骨脂甲素的回归方程分别为y＝0.1304x+0.0138 R2＝0.9998；y＝0.0543x+0.0784 R2＝0.9996，分别在1.008-5.04μg.ml-1及4.10-12.30μg.ml-1间线性关系良好。
精密度考查
取补骨脂素对照品2.52mg，精密称定，加甲醇溶解成50ml，再精密吸取5ml，加甲醇稀释至10ml，于243nm处测定吸光度，连续测定5次。精密吸取补骨脂甲素对照品溶液1ml，加1ml10％NaOH甲醇液，再加甲醇定容至10ml，50℃水浴加热2h，放冷，于440nm处测定吸光度，连续测定5次，计算RSD。结果RSD均小于1％，表明仪器有较高的精度。
稳定性考查
将精密度考查项下补骨脂素对照品、补骨脂甲素对照品于不同时间分别在243nm、440nm处测定吸光度，计算RSD，考查对照品的稳定性。取批号为041201的样品，按拟定的条件于不同时间分别测定总香豆素和总黄酮的吸光度，计算RSD，考查样品的稳定性，结果补骨脂素对照品、补骨脂甲素对照品及样品在48小时内吸光度基本稳定，RSD均小于2％。
重现性考查
取同一批号的样品(批号：041201)5份，按拟定的方法分别测定总香豆素和总黄酮的含量，考查该方法的重现性，结果各次试验含量差别不大，RSD均小于2％，表明总香豆素、总黄酮的含量测定方法具有较好的重现性。
回收率试验
取已知含量(批号：041201)的缓释片10片，研细，取0.25g，精密称定，分别精密加入补骨脂素对照品溶液、补骨脂甲素对照品溶液适量(三种不同水平，各二份)，按供试品溶液制备方法处理，进行含量测定，计算回收率，结果补骨脂素、补骨脂甲素的回收率均在95％-105％之间，回收率较高，表明该方法是可行的。
二、HPLC法测定制剂中补骨脂香豆素类和黄酮类成分的含量
供试品溶液及对照品溶液的制备
取缓释片10片，研细，取0.5g，精密称定，加20ml甲醇超声提取30min，滤过，加甲醇定容至100ml，过45μm滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
分别精密称取补骨脂素3.8mg、异补骨脂素3.3mg、异补骨脂黄酮1.7mg、补骨脂甲素3.4mg、补骨脂宁3.9mg、补骨脂乙素6.1mg、补骨脂双氢黄酮甲醚6.3mg、补骨脂定4.5mg、补骨脂查耳酮1.1mg，加甲醇溶解成25ml，作为混合对照品溶液。
色谱条件
色谱柱：SUPELCO DiscoveryC18(25cm×4.6mm，5μm)；保护柱：SUPELCOSupelguardTM Discovery18(2cm×4.0mm，5μm)；流动相：甲醇∶水＝50∶50(0-5min)；50∶50-100∶0(5min-60min)；F：1ml/min；λ：320nm；T：30℃
标准曲线的绘制
分别精密吸取混合对照品溶液4μl，8μl，10μl，16μl，20μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，绘制标准曲线，结果补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂黄酮、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂双氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂查耳酮的回归方程分别为y＝26976x-87855，R＝0.9999、y＝20264x-61347，R＝0.9999、y＝9934.2x-26333，R＝0.9999、y＝13141x-38675，R＝0.9999、y＝7415.3x-23117，R＝0.9999、y＝27383x-151821，R＝0.9999、y＝11886x-70524，R＝0.9999、y＝18643x-106054，R＝0.9999、y＝27783x-103537，R＝0.9999，线性范围分别为0.608～3.040μg、0.528～2.640μg、0.272～1.320μg、0.544～2.720μg、0.624～3.120μg、0.976～4.880μg、1.008～5.040μg、0.720～3.600μg、0.176～0.880μg之间。
精密度的考查
精密吸取混合对照品10μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，连续进样5次，计算RSD，考查仪器的精密度。结果各对照品的RSD均小于1％，表明仪器的精度较高。
稳定性考查
将混合对照品于不同时间进样10μl，测定峰面积，计算RSD，考查对照品的稳定性。结果各对照品在48小时内基本稳定，在不同时间点测得的峰面积RSD小于2％。
重现性考查
取同一批号的样品(批号：041201)5份，按拟定的测定方法测定含量，结果各次试验含量差别不大，RSD小于3％，该法有较好的重现性。
回收率的测定
取已知含量(批号：041201)的缓释片10片，研细，取0.25g，精密称定，分别精密加入补骨脂素对照品溶液、补骨脂甲素对照品溶液适量(三种不同水平，各二份)，按供试品溶液制备方法处理，进行含量测定，计算回收率，结果补骨脂素、补骨脂甲素的回收率在95％-105％之间，表明该测定方法是合理可行的。
三、紫外分光光度法测定制剂中葛根总黄酮的含量
供试品溶液的制备
取缓释片10片，研细，取0.25g，精密称定，加20ml氯仿超声提取2次，每次10min，弃去氯仿液，残渣加甲醇溶解，过滤定容至100ml，取0.1ml稀释至100ml，作为供试品溶液。
吸收波长的选择
取葛根素对照品适量，加甲醇溶解，在紫外可见分光光度计上扫描，测定最大吸收波长，同时，供试品溶液进行紫外扫描，本发明药物缓释片剂与葛根素对照品有相同的紫外吸收，最大吸收波长均为250nm，故选择250nm为测定波长。
标准曲线的绘制
精密称取葛根素对照品7.43mg，加甲醇溶解成25ml，再精密吸取2.5ml，加甲醇稀释成25ml稀释液，分别精密吸取上述稀释液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml于10ml量瓶中，加甲醇至刻度，于250nm处测定吸光度，结果葛根素的回归方程为：A＝0.0705C+0.1038r＝0.9999，浓度在2.972与8.916μg.ml-1之间线性关系良好。
精密度考查
精密称取葛根素对照品2.23mg，加甲醇溶解成50ml，再精密吸取1ml，加甲醇定容至25ml，于250nm处测定吸光度，连续测定5次，计算RSD，结果RSD小于1％，表明仪器精度较高。
稳定性考查
将精密度考查项下的对照品，分别在0h、4h、8h、12h、24h于250nm处测定吸光度，计算RSD。取批号为041201的样品，按拟定的条件测定，于不同时间测定吸光度，计算RSD。结果表明葛根素对照品及本发明药物缓释片剂的吸光度在24小时内较稳定，RSD小于1％。
重现性考查
取同一批号的样品(批号041201)5份，按拟定的测定方法进行含量测定，各次试验的含量RSD小于2％，表明该方法具有较好的重现性。
回收率试验
取本发明药物缓释片剂(批号：041201)10片，研细，取20mg，精密称定，精密加入葛根素对照品溶液适量(三种不同水平，各二份)，按供试品溶液制备方法处理，进行含量测定，计算回收率，结果回收率在95％-105％之间，表明该测定方法具有可行性。
四、HPLC法测定制剂中葛根素的含量
供试品溶液的制备
取缓释片10片，研细，取0.25g，精密称定，加甲醇超声溶解，过滤定容至50ml，取1ml稀释至100ml，作为供试品溶液。
色谱条件
色谱柱：ODS柱；流动相：甲醇∶水＝25∶75；F：1ml.min-1；λ：250nm；T：30℃
标准曲线的绘制
精密称取葛根素对照品7.43mg，加甲醇溶解成25mL，精密吸取2ml于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别精密吸取稀释液2、4、8、12、20、25μl注入高效液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，将峰面积与进样量进行线性回归，计算回归方程为A＝4E+06C-84328 r＝0.99999，葛根素对照品进样量在0.11888-1.4860μg之间线性关系良好。
精密度考查
精密吸取标准曲线绘制项下的对照品溶液10μl注入高效液相色谱仪，连续进样5次，按拟定的色谱条件测定，各次试验峰面积RSD小于1％，表明仪器精度较高。
稳定性考查
精密吸取对照品溶液10μl，分别在0h、4h、8h、12h、24h进样，测定峰面积，计算RSD，结果，葛根素24小时内基本稳定。
重现性考查
取同一批号的样品(批号041201)5份，按拟定的测定方法进行含量测定，结果各次试验结果RSD小于2％，该方法具有较好的重现性。
回收率试验
取缓释片(批号：041201)10片，研细，取50mg，精密称定，精密加入葛根素对照品溶液适量(三种不同水平，各二份)，按供试品溶液制备方法处理，进行含量测定，计算回收率，结果葛根素的回收率在98％-104％之间，表明该方法可行。
本发明药物缓释片剂的含量测定
按拟定的方法测定3批中试样品中补骨脂香豆素和黄酮的含量、葛根总黄酮及葛根素的含量，结果见表10。
表10 本发明药物缓释片剂含量测定结果
| 含量测定 | 批 号 | 041201 | 041202 | 041203 | |
| 补骨脂 | UV 总香豆素(mg/片)法 总黄酮(mg/片)HPLC 香豆素类(mg/片)法 黄酮类(mg/片) | 26.2226.9214.1815.99 | 26.0426.5213.2315.84 | 25.5726.4113.1815.15 | |
| 葛根 | 总黄酮(mg/片)葛根素(mg/片) | 200.2263.07 | 205.4968.56 | 194.5466.54 |
根据测定结果，结合药材和提取物的质量以及制备过程等因素，定本品每片含补骨脂香豆素和黄酮的量，用紫外分光光度法测，总香豆素以补骨脂素计不得低于20mg，补骨脂总黄酮以补骨脂甲素计不得低于20mg；以HPLC法测，香豆素类成分每片不得低于10mg、补骨脂黄酮每片不得低于12mg葛根总黄酮每片不得低于150mg、葛根素每片不得低于50mg。
以下通过药效学、药代动力学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物原料配比协同增效作用试验
方法：维甲酸致大鼠骨质疏松动物模型
表11 补骨脂、葛根对骨质疏松大鼠骨密度的影响
| 组别 | 剂量(g/kg) | 动物数(只) | 椎骨骨密度(g/cm<sup>2</sup>) | 股骨骨密度(g/cm<sup>2</sup>) |
| 补骨脂葛根补骨脂+葛根模型组正常对照组 | 999+9// | 66656 | 0.1349±0.0112*0.1373±0.0055*0.1413 ±0.0081*0.1089±0.0080*0.1552±0.0144* | 0.1370±0.0079*0.1334±0.0049*0.1401±0.0065*0.1099±0.0216*0.1501±0.0158* |
从上表可以看出，补骨脂组、葛根组及补骨脂+葛根组都能明显地增加维甲酸大鼠骨质疏松的骨密度，且两药合用效果更明显。
通过维甲酸致大鼠骨质疏松动物模型，补骨脂、葛根单独运用或合并用药，均能明显地增加大鼠椎骨骨密度、股骨骨密度，但当补骨脂与葛根用量为各9g/kg时，其增加骨密度的作用强于单独运用。
试验例2 本发明药物缓释片剂体外累积释放度
释放介质及测定方法的选择：
本品有效物质为葛根总黄酮、补骨脂香豆素类和黄酮类成分，为弱酸性物质或有内酯结构，在水中和酸性介质中的溶解度小，达不到漏槽条件(投入药量不得过溶解度的10％-20％)，而在稍偏碱性的溶液中能较好的溶解，故选择PH＝7.4的磷酸盐缓冲液作为溶出介质。
在实验中比较了转篮法和浆法，用转篮法测定释放度的重现性较浆法好，用浆法时，片剂易粘于杯底，搅拌效果不好，药片运动不规律，导致测定结果重现性较差，故选用转篮法测定本品的释放度。
样品释放度的测定
取已知含量的3批中试样品，每批6片，按《中华人民共和国药典》二部溶出度测定法第一法(转篮法)操作，分别于1、2、3、4、6、8、10、12小时取样5ml，加稀盐酸调pH5-6，水浴蒸干，残渣加10ml氯仿超声提取2次，每次10min，收集氯仿液，残渣加甲醇溶解定容至25ml，于250nm处测定吸光度，计算葛根总黄酮的累积释放度。氯仿液蒸干，残渣加甲醇溶解定容至25ml，于243nm处测定总香豆素的累积释放度，结果见表12、13。
表12本发明药物缓释片剂中葛根总黄酮累积溶出百分率测定结果
| 批号 | 序号 | 累积释放百分率(％) | |||||||
| 1h | 2h | 3h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | ||
| 041201 | 123456平均 | 16.3218.2420.3121.0818.9919.3719.05 | 27.3129.6432.1835.4731.8532.1131.42 | 40.6341.8545.3247.3343.2438.7242.84 | 53.1555.3457.2856.1950.4449.6253.67 | 68.1470.5172.2069.8464.9765.8368.58 | 80.4381.6280.9977.4774.6176.3878.58 | 87.6189.2786.4583.1184.2081.0485.28 | 92.4994.6192.1091.8890.7489.2391.84 |
| 041202 | 123456平均 | 18.5418.9919.2820.1018.4617.9918.89 | 27.3932.4133.1332.8730.5428.6630.83 | 38.1843.7346.8244.3143.8637.2545.36 | 53.4356.2459.3155.4756.3350.8656.27 | 68.5571.2970.3467.2769.4465.7868.77 | 81.5383.4680.9176.3079.2477.0179.74 | 88.0089.7187.1687.0283.1182.0786.18 | 95.3793.4495.1992.7789.8787.6392.38 |
| 041203 | 123456平均 | 15.2918.1620.4816.0119.0715.5417.43 | 32.2733.5536.3233.3135.3331.8733.78 | 43.5446.8345.2750.5447.3642.7546.05 | 56.7859.3655.7254.3760.2955.5057.00 | 73.3276.4871.1174.2477.4769.4973.69 | 85.4383.6481.2586.7785.8180.3483.87 | 92.9086.2687.1390.4986.6886.2288.28 | 95.6392.8190.2696.0397.2490.7193.78 |
表13本发明药物缓释片剂中补骨脂总香豆素累积溶出百分率测定结果
| 批号 | 序号 | 累积溶出百分率(％) | |||||||
| 1h | 2h | 3h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | ||
| 041201 | 123456平均 | 10.8312.6714.3210.199.8713.4611.89 | 22.3824.6328.7126.1524.3327.3025.58 | 37.4139.2041.3738.8837.7440.2639.14 | 46.3850.0152.6449.5045.9748.8148.89 | 59.0763.4363.5862.0059.6760.8461.43 | 70.3172.4773.0170.1867.5069.5670.51 | 79.9377.8081.3479.5275.0678.7778.74 | 88.3790.6589.4887.6088.9485.7188.46 |
| 041202 | 123456平均 | 12.4111.0813.4810.0311.879.9211.46 | 26.3524.6829.0625.4927.8323.0426.08 | 41.7539.0245.3738.4440.1037.6340.38 | 51.5950.7954.2548.0449.2346.8550.13 | 62.5464.5763.5861.2463.0359.3763.06 | 74.4971.8272.6469.3371.2668.9771.42 | 84.6180.7683.1480.5183.0778.5981.78 | 92.7789.3189.3186.4588.2785.4688.60 |
| 041203 | 123456平均 | 13.4113.8714.2512.1613.9915.3713.84 | 22.1825.7224.1120.7622.8523.1723.13 | 37.6839.5537.4035.5138.4136.3837.49 | 51.5453.2950.1848.7449.3350.1450.54 | 61.0765.3662.1160.4362.3860.9762.05 | 73.6375.4272.0470.8473.6869.6172.54 | 83.0582.7383.3176.1580.0778.6480.65 | 89.4390.7489.6786.3592.4890.1789.80 |
本发明药物缓释片剂释药规律
目前用于药物释放的数学模型有零级模型、一级模型、Higuchi模型和Ritger-Pappas模型，用上述药物释放动力学模型对本发明药物缓释片剂的释放过程进行拟合，探讨缓释片的释药机理。
将三批中试样品的平均累积释放度与时间用不同的释药模型进行拟合，结果见表14、15。
表14 葛根总黄酮释药模型拟合结果
| 批号 | 拟合模型 | 拟合方程 | 相关系数 |
| 041201 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.0649t+0.2161Ln[1-F(t)]＝-0.2033t+0.0391F(t)＝3.2672t<sup>1/2</sup>+0.3317Ln F(t)＝0.6395 Ln t-1.5895Ln{-Ln[1-F(t)]}＝0.994 Ln t-1.6238 | R<sup>2</sup>＝0.9423R<sup>2</sup>＝0.9951R<sup>2</sup>＝0.9902R<sup>2</sup>＝0.9874R<sup>2</sup>＝0.9971 |
| 041202 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.065t+0.2243Ln[1-F(t)]＝-0.2091t+0.037F(t)＝3.233t<sup>1/2</sup>+0.3229LnF(t)＝0.6445 Lnt-1.5833Ln{-Ln[1-F(t)]}＝1.0082 Lnt-1.6176 | R<sup>2</sup>＝0.9308R<sup>2</sup>＝0.9952R<sup>2</sup>＝0.9852R<sup>2</sup>＝0.9797R<sup>2</sup>＝0.9970 |
| 041203 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.0669t+0.2327Ln[1-F(t)]＝-0.2309t+0.0592F(t)＝3.0938t<sup>1/2</sup>+0.3463Ln F(t)＝0.6694Ln t-1.5954Ln{-Ln[1-F(t)]}＝1.0667Ln t-1.643 | R<sup>2</sup>＝0.9115R<sup>2</sup>＝0.9969R<sup>2</sup>＝0.9763R<sup>2</sup>＝0.9683R<sup>2</sup>＝0.9992 |
表15补骨脂总香豆素释药模型拟合结果
| 批号 | 拟合模型 | 拟合方程 | 相关系数 |
| 041201 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.0654t+0.1549Ln[1-F(t)]＝-0.1718t+0.054F(t)＝3.2505t<sup>1/2</sup>+0.5309Ln F(t)＝0.7765 Ln t-1.942Ln{-Ln[1-F(t)]}＝1.0886Lnt-1.989 | R<sup>2</sup>＝0.9459R<sup>2</sup>＝0.9849R<sup>2</sup>＝0.9917R<sup>2</sup>＝0.9668R<sup>2</sup>＝0.9940 |
| 041202 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.0664t+0.1595Ln[1-F(t)]＝-0.1783t+0.0553F(t)＝3.1835t<sup>1/2</sup>+0.5336Ln F(t)＝0.7909 Lnt-1.9487Ln{-Ln[1-F(t)]}＝1.1149 Ln t-1.9992 | R<sup>2</sup>＝0.9377R<sup>2</sup>＝0.9927R<sup>2</sup>＝0.9889R<sup>2</sup>＝0.9589R<sup>2</sup>＝0.9931 |
| 041203 | 零级一级HiguchiRitger-Pappas威布尔(weibull) | F(t)＝0.0675t+0.1496Ln[1-F(t)]-0.1843t+0.0881F(t)＝3.1529t<sup>1/2</sup>+0.5615Ln F(t)＝0.7614 Ln t-1.9048Ln{-Ln[1-F(t)]}＝1.0907 Ln t-1.9637 | R<sup>2</sup>＝0.9492R<sup>2</sup>＝0.9853R<sup>2</sup>＝0.9900R<sup>2</sup>＝0.9784R<sup>2</sup>＝0.9932 |
从表14、表15中相关系数可以看出，采用以上各模型，释放度与时间均有较好的相关性，其中威布尔(weibull)模型拟合最好，表明本发明药物缓释片剂体外释药规律符合威布尔模型。
试验例3本发明药物缓释片剂在狗体内的药代动力学试验
实验材料与仪器
本发明药物缓释片剂、本发明药物普通片剂(均为自制)，甲醇(色谱纯)，水(去离子水)，乙腈(色谱纯)其他试剂均为分析纯。
Beagle犬6只，体重10±0.1Kg；雌雄各半，由重庆市中药研究院实验动物中心提供。
Waters 2695 separations module高效液相色谱仪，Waters 2996 photodiode arraydetector检测器，Waters empowder化学工作站；TGL-16C台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂)。
血药浓度测定方法的建立
本发明采用了HPLC色谱法，能在同一条件下将待测成分分开，分离效果好。色谱条件为：色谱柱：SUPELCO DiscoveryC18色谱柱；SUPELCO SupelguardTMDiscovery18保护柱；流动相：梯度洗脱0min乙腈∶水(5∶95)，20min乙腈∶水(15∶85)，40min乙腈∶水(10∶60)，60min乙腈∶水(70∶30)80min乙腈∶水(5∶95)；流速：1ml/min，柱温：30℃，检测波长：250nm。
葛根素为葛根黄酮中的主要有效成分，含量高，补骨脂素、异补骨脂素为补骨脂中的有效成分，含量也相对较高，故选择葛根素、补骨脂素、异补骨脂素为代表，考查其在犬体内的动力学。并对对其线性范围、日内精密度、日间精密度、回收率进行了考查，以证明该测定方法的可行性。
空白血清样品及含药血清样品的制备
精密吸取空白血清0.5ml，加入甲醇3.5ml，旋涡振荡1min，离心10min(10000r/min)，上清液用N2吹干，残渣加1ml甲醇溶解，离心10min(10000r/min)，取上清液进样，测定色谱图。
精密吸取空白血清0.5ml，加入葛根素对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，再加甲醇3.5ml，按空白血清样品制备法依法操作，取上清液进样，测定色谱图。
最小检测限的测定
以机器噪声的3倍(S/N＝3)为界，葛根素、补骨脂素、异补骨脂素的最低检测限分别为0.05ng、0.1ng、0.1ng。
标准曲线的绘制
取空白血清0.5ml 5份，分别加入葛根素对照品溶液(336μg/ml)、补骨脂素对照品溶液(2.84μg/ml)、异补骨脂素对照品溶液(2.6μg/ml)各100μl、80μl、60μl、40μl、20μl，再加3.5ml甲醇，涡流混匀1min，高速离心(10000转)10min，倾取上清液，50℃N2吹干，加1ml甲醇溶解，高速离心(10000r/min)10min，取上清液，分别精密吸取10μl注入高效液相，测定峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，进样量X为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
表16 对照品在血清中的标准曲线测定结果
| 葛根素对照品 | 补骨脂素对照品 | 异补骨脂素对照品 | |||
| 进样量(μg) | 峰面积 | 进样量(ng) | 峰面积 | 进样量(ng) | 峰面积 |
| 0.3360.26880.20160.13440.0672 | 807601644372485272328523156938 | 2.842.2721.7041.1360.568 | 18583146801077876194088 | 2.62.081.561.040.52 | 1518812226896359993285 |
从表16可以计算出，葛根素的回归方程为Y＝2405393.75X-611.3(R2＝9998)，在0.0672μg-0.336μg范围内线性关系良好；补骨脂素的回归方程为Y＝6347X+334.3(R2＝0.9983)，在0.568-2.84ng范围内线性关系良好；异补骨脂素的回归方程为Y＝5775.6X+122.3(R2＝0.9991)，在0.52-2.6ng范围内线性关系良好。
精密度试验
葛根素、补骨脂素、异补骨脂素的日内精密度均较小于5％，日间精密度均小于10％，表明仪器有较高的精度，并且样品在两天内基本稳定。
回收率试验
取空白血清0.5ml，分别加入不同量的葛根素、补骨脂素、异补骨脂素对照品溶液，旋涡混合均匀，分别加入甲醇3.5ml，旋涡振荡1min，离心10min(10000r/min)，上清液用N2吹干，残渣加1ml甲醇溶解，离心10min(10000r/min)，取上清液进样。
各对照品的回收率在要求范围内，表明该方法合理可行。
体内试验方法及结果分析
取Beagle犬6只，随机分成2组，每组3只，试验前禁食12h，分别灌胃给予本发明药物缓释片剂与普通片(1片/kg)，于给药后10min，20min，0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，8h，10h从股静脉取血，静置2h后离心，取上层血清备用。按拟定的方法与条件测定血药浓度，采用3P87药动学程序对表17～19的数据进行处理，选择室模型，计算拟合优度参数。
表17本发明药物普通片剂与缓释片中葛根素平均经时血药浓度的拟合优度参数
| 组别 | NoComp. | WT | RSquares | Goodnessof Fit | Max.ErrorC-CL | Max.Error％ | AIC | RunTest |
| 补骨质普通片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.98940.98980.99790.99710.99930.99940.99930.99980.9997 | 0.25900.30120.17780.13530.07680.09770.06720.04550.0613 | 0.48300.48050.18760.47160.20440.20040.55170.20510.2233 | 18.2318.1018.7412.545.445.3311.025.455.94 | -0.31573.3008-9.9098-14.6064-26.7514-23.0864-29.9965-38.2550-33.3255 | 436455655 |
| 补骨质缓释片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.89800.91400.88900.96180.95720.98690.98110.99000.9819 | 0.55780.58100.78080.34150.40960.26860.23990.23450.2667 | 1.14540.96770.75141.41201.09900.75441.88361.19221.8508 | 76.8475.7773.9452.8164.8742.2038.8429.5938.16 | 21.386123.178630.48858.630214.08892.7402-0.5544-0.78522.9302 | 333333345 |
表18本发明药物普通片剂与缓释片中补骨脂素平均经时血药浓度的拟合优度参数
| 组别 | NoComp. | WT | RSquares | Goodnessof Fit | Max.ErrorC-CL | Max.Error％ | AIC | Run Test |
| 补骨质普通片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.87260.87150.93240.1035-0.40670.4414-6.1191-11.9217-12.1452 | 3.18410.03780.03540.08450.12520.10180.23800.34640.4940 | 0.06620.06640.03760.07840.04440.05630.09420.13060.0673 | 74.1870.9681.9436.1587.2243.7137.3751.8158.63 | -46.4288-42.3358-45.3937-24.9664-16.0108-22.1694-2.17196.383412.5720 | 444444434 |
| 补骨质缓释片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.83540.79990.8265-0.5230-0.49280.0389-15.0553-13.3191-11.3269 | 0.03030.03860.04410.09230.10550.10370.29970.32680.3321 | 0.04110.05260.05250.06170.06060.04380.08830.07740.0729 | 78.3256.7580.7740.2946.6657.9543.3037.9435.93 | -50.9311-44.5886-42.2988-24.2341-20.4745-21.75844.03046.65706.8592 | 333333333 |
表19本发明药物普通片剂中异补骨脂素平均经时血药浓度的拟合优度参数
| 组别 | NoComp. | WT | RSquares | Goodnessof Fit | Max.ErrorC-CL | Max.Error％ | AIC | Run Test |
| 补骨质普通片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.70890.73450.7823-1.7966-1.7098-1.2399-27.2595-27.9374-23.1917 | 0.03060.03460.04050.09500.11060.12980.30190.36150.4267 | 0.06210.05010.03650.07180.06850.06290.08530.08340.0749 | 78.5976.8987.7344.3247.4349.4352.6551.5046.25 | -47.2749-44.2863-42.4685-22.3869-18.7339-16.82823.05657.31699.3466 | 434444434 |
| 补骨质缓释片组 | 123123123 | 1111/C1/C1/C1/C/C1/C/C1/C/C | 0.75020.79450.8384-1.5024-1.4359-2.6069-35.9333-31.9222-17.0896 | 0.02450.02630.03010.07760.09060.14240.29830.33320.3189 | 0.04740.03700.03040.05040.04930.03510.06670.05920.0483 | 59.5458.8410050.9351.4610048.3642.8935.00 | -52.1671-50.3139-48.9577-26.8173-23.1138-14.79592.79305.52842.9415 | 434334333 |
根据AIC最小原则，从表17～19可以看出，葛根素在普通片及缓释片中均为二室模型，权重为1/C/C，补骨脂素、异补骨脂素在普通片与缓释片中均为一室模型，权重为1。根据室模型及权重计算各组药动学参数，结果见表20～23。
表20 本发明药物普通片剂及缓释片中葛根素的药动学参数
| Parameter | Common-release tablet | Sustained-release tablet | ||||||
| No.1 | No.2 | No.3 | mean | No.1 | No.2 | No.3 | mean | |
| A(μg/mL)Alpha(l/h)B(μg/mL)beta(l/h)Ka(l/h)T<sub>1/2</sub>alpha(h)T<sub>1/2</sub>eta(h)T<sub>1/2</sub>Ka(h)AUC(μg/mL)*hTpeak(h)Cmax(μg/mL)CL/F(s)mg/h/μg/mL | 6.29085.13818.03680.34415.88560.13492.01430.117822.14480.48146.4978189.66 | 5.95060.65763.21990.17616.54451.05403.93530.105925.92830.44096.9205161.98 | 6.59420.22930.06190.21042.02933.02243.29490.341625.76771.21674.4730162.99 | 6.27852.00833.77290.24354.81981.40383.08150.188424.61360.71305.9638171.54 | 2.08570.16155.28530.12970.38324.29155.34481.809034.43094.18542.6457121.98 | 2.53560.417314.43790.17420.34441.66123.97952.012939.67604.11883.3909105.85 | 9.64480.21118.48290.15970.31723.28294.34122.185241.65824.13733.5284100.82 | 4.75540.26339.40200.15450.34833.07894.55522.002438.58844.14723.1883109.55 |
表21本发明药物普通片剂及缓释片中补骨脂素的药动学参数
| Parameter | Common-release tablet | Sustained-release tablet | ||||||
| No.1 | No.2 | No.3 | mean | No.1 | No.2 | No.3 | mean | |
| A(μg/mL)Ke(l/h)Ka(l/h)T<sub>1/2</sub>Ke(h)T<sub>1/2</sub>Ka(h)Tpeak(h)Cmax(μg/mL)AUC(μg/mL)*hCL/F(s)mg/h/μg/mL | 0.44360.34270.92842.02300.74661.70160.15620.81685141.99 | 0.84430.40220.75921.72360.91301.77970.19410.98734254.09 | 0.80790.30400.62072.28031.11672.25400.20781.35623096.91 | 0.69860.34960.76942.00890.92541.91180.18601.05344164.33 | 0.68680.18850.32383.67642.14043.99810.13501.52202759.53 | 0.63760.17970.34673.85801.99933.93550.15151.70972456.60 | 0.73520.17270.33264.01462.08394.09910.17422.04772051.08 | 0.68650.18030.33443.84972.07454.01090.15361.75982422.40 |
表22本发明药物普通片剂与缓释片中异补骨脂素的药动学参数
| Parameter | Common-release tablet | Sustained-release tablet | ||||||
| No.1 | No.2 | No.3 | mean | No.1 | No.2 | No.3 | mean | |
| A(μg/mL)Ke(l/h)Ka(l/h)T<sub>1/2</sub>Ke(h)T<sub>1/2</sub>Ka(h)Tpeak(h)Cmax(μg/mL)AUC(μg/mL)*hCL/F(s)mg/h/μg/mL | 0.48420.37540.65211.84631.06291.99560.09710.54737674.61 | 0.61650.36060.61261.92201.13152.10290.11880.70305973.97 | 0.22430.31261.39432.21760.49711.38230.11300.5568774543.54 | 0.44170.34950.88631.99530.89721.82690.10960.60247064.04 | 0.30740.17360.36083.99191.92133.90770.08090.91824574.28 | 0.41140.17910.33913.86932.04423.98950.09501.08333877.12 | 0.44430.18010.33583.84822.06414.00100.10021.14363672.49 | 0.38770.17760.34523.90312.00983.96610.09201.04844041.29 |
表23本发明药物普通片剂与缓释片主要药动学参数比较
| component | Parameter | Common-releasetablet | Sustained-releasetablet | T test | P |
| puerariaepsoralenisopsoralen | AUC(0→∞)CmaxTmaxMRTAUCCmaxTmaxMRTAUCCmaxTmaxMRT | 24.61365.96380.71303.86231.05340.18601.91185.62000.60240.10961.82695.6288 | 41.65823.52844.13739.25771.75980.15364.01099.08131.04840.09203.96619.2411 | 5.6243.454013.5793.61103.19111.694111.72343.96375.30122.02809.44943.9637 | ＜0.01＜0.05＜0.01＜0.05＜0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05＜0.01＜0.01 |
t0.05＝2.1318，t0.01＝3.7470
从表23可以看出，本发明药物缓释片剂与普通片主要药动学参数有显著性差异，表明缓释片能在犬体内较长时间保持较高的血药浓度。
本发明药物缓释片剂体内外相关性
体内外相关性是体外释放参数和体内吸收分数的函数，体内外相关性研究的目的在于建立一个可以说明生物利用度的质量标准和用作制剂批量生产时的质控指标。
以体外累积释放百分率(F)为自变量，以t时刻的体内吸收分数(f)为应变量，用最小二乘法进行线性回归，通过比较相关系数及r的临界值，考查体外累积释放百分率与体内吸收分数的相关性。
本发明药物缓释片剂中葛根素为二室模型，用公式Fa＝(Ct+K∫0 tCtdt+X(p)/VC)/kK∫0 ∞Ctdt*100％计算相关性，结果见表24。补骨脂素为一室模型，用公式Fa＝(Ct+K∫0 tCtdt)/kK∫0 ∞Ctdt*100％计算相关性，结果见表25。
表24本发明药物缓释片剂中葛根素体内吸收分数f(％)与体外累积释放百分率F(％)
| 时间(h) | Ct | K∫<sub>0</sub><sup>t</sup>Ctdt | X(p)/Vc | Ct+K∫<sub>0</sub><sup>t</sup>Ctdt+X(p)/VC | f％ | F％ |
| 1234681012 | 1.683.094.114.983.742.411.661.24 | 0.85702.91745.61478.572914.406719.450623.464426.5105 | 5.9162E-58.8371E-51.0997E-41.2149E-41.2509E-41.1295 E-49.6142E-57.8572E-5 | 2.10194.52636.87419.200410.832411.985513.211514.2911 | 12.5226.9540.9354.7864.5071.3778.6785.10 | 19.0531.4242.8453.6768.5878.5885.2891.84 |
表25本发明药物缓释片剂中补骨脂素体内吸收分数f(％)与体外累积释放百分率F(％)
| 时间(h) | Ct | K∫<sub>0</sub><sup>t</sup>Ctdt | Ct+K∫<sub>0</sub><sup>t</sup>Ctdt | f％ | F％ |
| 12344681012 | 0.0450.0980.1550.1930.1780.1080.0810.065 | 0.03770.12770.24420.37080.61970.83611.01161.1487 | 0.06180.15520.26430.35900.45540.48230.53390.8243 | 8.8222.0837.6151.0864.8168.6375.9782.43 | 11.8925.5839.1448.8961.4370.5178.7488.46 |
从表24可以计算出葛根黄酮的体内外相关性方程为：Y＝0.0097X-0.0273，R2＝0.9888；从表25可以计算出香豆素的相关性方程为：Y＝99.758X+1.7758，R2＝0.9867，结果表明葛根黄酮和补骨脂香豆素的体内吸收与体外释放有较好的相关性，表明体外释放度方法是合理可行的，可用于代替体内试验进行产品的质量控制。
Claims (13)
1、一种治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：
补骨脂6-10份、葛根9～15份。
2、根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：
补骨脂10份、葛根10份。
3、根据权利要求1或2所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：它是由补骨脂总香豆素、总黄酮，葛根总黄酮为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
4、根据权利要求3所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：所述的补骨脂总香豆素以补骨脂素计，重量百分比不低于24％、补骨脂总黄酮以补骨脂甲素计，重量百分比不低26％；葛根总黄酮以葛根素计，重量百分比不低于70％。
5、根据权利要求3或4所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：它是由补骨脂为原料提取制备的补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物，葛根为原料提取制备的葛根总黄酮，混合，制备而成的制剂，其中补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮的重量配比为：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份；
其中，补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物的制备方法为：取补骨脂，加有机溶剂提取；其中，所述的有机溶剂为：30-90％乙醇；
葛根总黄酮的制备方法为：取葛根，用50～90％乙醇回流提取，乙醇提取液减压回收乙醇，滤过，通过吸附树脂柱，以30％～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，即得葛根总黄酮。
6、根据权利要求5所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮的重量配比为：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1份、葛根总黄酮1份。
7、根据权利要求1-6任一项所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、缓释制剂。
8、根据权利要求7所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：所述的缓释制剂是由下述重量配比的补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮及辅料制备而成的：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份、缓释制剂用辅料：1～10份。
9、根据权利要求8所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：所述的缓释制剂用辅料为：乙基纤维素EC、羟丙甲基纤维索HPMC或苏丽丝surelease中的一种或任意两种以上混合。
10、根据权利要求9所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其物征在于：它是由下述重量配比的补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮用辅料制备而成：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份、EC 0.5～10份、HPMC 0.2～1.0份。
11、根据权利要求10所述的治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮及辅料制备而成：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1份、葛根总黄酮1份、EC 0.5份、HPMC0.5份。
12、一种制备权利要求1-11任一项所述的治疗骨质疏松症的药物组合物的方法，包括如下步骤：
a、取补骨脂，加30-90％乙醇回流提取，用正己烷或环己烷脱脂，干燥，即得补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物。
b、取葛根，用50～90％乙醇回流提取，乙醇提取液减压回收乙醇，滤过，通过吸附树脂柱，以30％～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，即得葛根总黄酮；
c、将b、c步骤制备的补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物、葛根总黄酮按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的剂型：
补骨脂总香豆素和补骨脂总黄酮混合物1～5份、葛根总黄酮1～5份。
13、根据权利要求12所述的治疗骨质疏松症的药物组合物的制备方法，其特征在于：a步骤所述的回流提取乙醇浓度为70％乙醇；b步骤所述的回流提取乙醇浓度为30％乙醇；乙醇洗脱的浓度为70％乙醇。
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