CN104140494B - 有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的制备方法，以对氧磷过渡态类似物(4-硝基苄基)磷酸二乙酯为模板分子，1-乙烯基咪唑、甲基丙烯酸为功能单体，利用分子印迹技术，采用沉淀聚合法，制备成分散性好、粒径大小均一的有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球。本发明制备的分子印迹聚合物微球的对氧磷水解酶活性与对氧磷自发水解相比，水解效率最大可提高188倍，比不加模板分子条件下合成的非印迹聚合物的催化效能也提高了2.3倍，测得的Km和Vmax值分别为0.064mmol/L·min和2.41mmol/L，Kcat为0.237S-1。本发明制备的有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球既可用于有机磷农药的高效降解，也可用于有机磷神经性毒剂类化学武器的降解和销毁。
Description
技术领域
本发明属于有机磷化合物的降解技术领域，具体涉及一种有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的制备方法。
背景技术
有机磷农药因化学性质不稳定，易分解，半衰期短，不易在作物、动物和人体内蓄积，因而得到广泛使用。但由于有机磷使用范围越来越广，使用频率越来越高，施用量越来越大，已成为污染食品最为严重的问题。同时，有机磷化合物也可作为神经性毒剂用于战争和恐怖袭击。为了有效控制有机磷农药残留和有机磷化学武器，除了加强农药和神经性毒剂的管理和限制外，找到能加速催化有机磷化合物降解的物质和方法更是一个重要的挑战。目前，针对有机磷农药残留和有机磷神经性毒剂问题，科学家已研发出高产的有机磷水解酶(OPH)生产工程菌，但OPH在天然及重组菌株中含量太低，且不稳定、易失活，难以制备。
2003年，SodeK研究组以4(5)-乙烯基咪唑、甲基丙烯酸为功能单体，以(4-硝基苄基)磷酸二乙酯为模板分子，采用本体聚合法，利用分子印迹技术合成模拟OPH，研究结果表明，与自发水解相比，其催化水解对氧磷的效率提高了105倍，水解对氧磷的Kcat＝7.4×10-2S-1，比不加模板条件下合成的非印迹聚合物的催化效能也提高了30％。但该方法所使用的功能单体4(5)-乙烯基咪唑没有商业供应，需要由尿刊酸合成，合成条件苛刻(需高温、真空条件)，4(5)-乙烯基咪唑的产率也较低，成本很高。此外，本体聚合法制备的聚合物模拟酶颗粒大，起催化作用的活性中心包埋在聚合物内部，由于传质阻力的影响，造成模拟酶的活性较低，因此，合成后需要对制备的聚合物模拟酶进行研磨、破碎及过筛处理，不仅过程繁琐，而且在研磨的过程中会产生大量的不规则颗粒，过筛后的过细颗粒还需要除去，既费工费时，产率又大大下降(一般低于50％)。另外，由于交联剂的浓度高，所得到的聚合物高度交联，导致模板分子包埋过深，使得模板分子的除去也非常困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述本体聚合法制备有机磷水解模拟酶存在的缺点，提供一种操作简单，原料易得、成本较低，采用沉淀聚合法制备有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的方法，该方法所得聚合物微球分散性好、粒径大小均匀，用于催化水解对氧磷的活性高。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：将ZnCl2、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、(4-硝基苄基)磷酸二乙酯按摩尔比为2～3:2～3:8～15:1溶解于乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合溶剂中，(4-硝基苄基)磷酸二乙酯与混合溶剂的体积比为1:100～200，再加入二乙烯基苯和2,2’-偶氮二异丁腈，二乙烯基苯、2,2’-偶氮二异丁腈、(4-硝基苄基)磷酸二乙酯的摩尔比为30～50:3～5:1，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射12～24小时，离心分离，所得固体用100mmol/L联吡啶的甲醇溶液振荡洗涤7小时，除去(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，然后用甲醇洗涤，再用100mmol/LZnCl2的甲醇溶液孵育4小时，离心分离，所得固体真空干燥，得到有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球。具体反应过程如下：
上述的ZnCl2、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、(4-硝基苄基)磷酸二乙酯的摩尔比最佳为2.5:2.5:10:1。
本发明利用分子印迹技术，以有机磷过渡态类似物(4-硝基苄基)磷酸二乙酯为模板，1-乙烯基咪唑、甲基丙烯酸为功能单体，模拟有机磷水解酶的催化中心结构，采用沉淀聚合法，合成了具有识别性和高选择性的能水解有机磷农药的有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球，并研究了其对底物对氧磷的催化水解活性，试验结果表明，与对氧磷自发水解相比，对氧磷的水解效率最大可提高188倍，比不加模板分子条件下合成的非印迹聚合物的催化效能也提高了2.3倍，测得的Km和Vmax值分别为0.064mmol/L·min和2.41mmol/L，Kcat为0.237S-1。本发明解决了有机磷水解酶在天然及重组菌株中含量太低，不稳定、易失活的缺点，能够有效地降解有机磷化合物，可降解处理有机磷农药残留和销毁有机磷神经性毒剂。
本发明与上述本体聚合法相比具有以下优点：
(1)本发明以商品化的1-乙烯基咪唑为功能单体，成本较低，而且1-乙烯基咪唑与4(5)-乙烯基咪唑相比更具有柔性，有利于活性中心的形成。
(2)本发明采用沉淀聚合法制备模拟酶聚合物微球，可直接得到单分散性的微球，不仅没有研磨、破碎及过筛等过程，而且所得到的聚合物微球具有颗粒均匀、粒径小、模板分子容易被洗脱、内部空腔结构和官能团作用位点利用率高、表面积大、吸附量大等优势，有利于提高酶活性。
(3)本发明制备的模拟酶聚合物微球有很高的酶活性，与SodeK的结果相比，有机磷水解模拟酶水解对氧磷的活性提高了3.2倍。
附图说明
图1是实施例1制备的有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的扫描电镜照片。
图2是对比实施例1制备的有机磷水解模拟酶非印迹聚合物微球的扫描电镜照片。
图3是不同条件水解对氧磷所得产物对硝基苯酚在400nm处的最大吸光度随时间变化曲线图。
图4是不同条件水解的对氧磷浓度随时间变化的曲线图。
图5是有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球水解不同浓度对氧磷所得产物对硝基苯酚在400nm处的最大吸光度随时间变化的曲线图。
图6是有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球水解对氧磷的初始速度与对氧磷浓度的关系曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
将0.1530g(1.125mmol)ZnCl2、96μL(1.125mmol)甲基丙烯酸、408μL(4.5mmol)1-乙烯基咪唑及99μL(0.45mmol)(4-硝基苄基)磷酸二乙酯溶解于80mL乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合溶剂中，再加入2.4mL(16.8mmol)二乙烯基苯和0.2624g(1.6mmol)2,2’-偶氮二异丁腈，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射12小时，再用离心机在8000转/分钟下离心分离10分钟，所得固体用100mmol/L联吡啶的甲醇溶液振荡洗涤7小时，除去(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，然后用甲醇洗涤3次，每次30分钟，再用100mmol/LZnCl2的甲醇溶液孵育4小时，8000转/分钟下离心分离10分钟，弃去上清液，在45℃下真空干燥，得到有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球，如图1所示，合成的聚合物颗粒呈微球形，且粒径大小均一，约为3.0μm，分散性良好。
对比实施例1
不添加(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，其他步骤与实施例1相同，得到有机磷水解模拟酶非印迹聚合物微球(见图2)。
实施例2
将0.1224g(0.9mmol)ZnCl2、77μL(0.9mmol)甲基丙烯酸、326μL(3.6mmol)1-乙烯基咪唑及99μL(0.45mmol)(4-硝基苄基)磷酸二乙酯溶解于50mL乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合溶剂中，再加入1.9mL(13.5mmol)二乙烯基苯和0.2214g(1.35mmol)2,2’-偶氮二异丁腈，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射12小时，再用离心机在8000转/分钟下离心分离10分钟，所得固体用100mmol/L联吡啶的甲醇溶液振荡洗涤7小时，除去(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，然后用甲醇洗涤3次，每次30分钟，再用100mmol/LZnCl2的甲醇溶液孵育4小时，8000转/分钟下离心分离10分钟，弃去上清液，在45℃下真空干燥，得到有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球，其粒径大小均一，约为4.0μm，分散性良好。
实施例3
将0.1836g(1.35mmol)ZnCl2、115μL(1.35mmol)甲基丙烯酸、612μL(6.75mmol)1-乙烯基咪唑及99μL(0.45mmol)(4-硝基苄基)磷酸二乙酯溶解于100mL乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合溶剂中，再加入3.2mL(22.5mmol)二乙烯基苯和0.3690g(2.25mmol)2,2’-偶氮二异丁腈，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射24小时，再用离心机在8000转/分钟下离心分离10分钟，所得固体用100mmol/L联吡啶的甲醇溶液振荡洗涤7小时，除去(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，然后用甲醇洗涤3次，每次30分钟，再用100mmol/LZnCl2的甲醇溶液孵育4小时，8000转/分钟下离心分离10分钟，弃去上清液，在45℃下真空干燥，得到有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球，其粒径大小均一，约为4.0μm，分散性良好。
为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例1～3制备的有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球(以下简称MIP)和对比实施例1制备的有机磷水解模拟酶非印迹聚合物微球(以下简称NIP)分别水解对氧磷，水解反应方程式及具体试验情况如下：
1、MIP和NIP对对氧磷水解活性的影响
将10mg实施例1制备的MIP和10mg对比实施例1制备的NIP分别分散到500μL乙腈中，加入4.45mL20mmol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液及50μL100mmol/L对氧磷的乙腈溶液，振荡，每隔30分钟取100μL反应液，用900μL超纯水稀释，用离心机在10000转/分钟下离心分离10分钟，取450μL上清液，采用紫外可见吸收光谱仪测试对硝基苯酚在400nm处的吸光度。同时不添加加聚合物作空白对比试验。试验结果见图3～4。由图可见，与对氧磷自发水解相比，MIP和NIP催化水解对氧磷的活性明显提高。经计算，MIP和NIP催化水解对氧磷的活性比对氧磷自发水解分别提高了188倍和81倍，且MIP的催化效能是NIP的2.3倍。
2、MIP对不同浓度对氧磷水解活性的影响
将10mg实施例1制备的MIP分散到500μL乙腈中，加入4.45mL20mmol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液及不同体积的100mmol/L对氧磷的乙腈溶液，使反应体系中对氧磷的浓度分别为0.1、1.0、2.5、5、7.5mmol/L，采用紫外可见吸收光谱仪测试不同反应时间反应液中对硝基苯酚在400nm处的吸光度，试验结果见图5～6。由图5可见，当对氧磷浓度在0.1～7.5mmol/L之间时，随着对氧磷浓度的增加制备的MIP催化水解活性也增强。通过图6计算得，Vmax及Km值分别为0.064mmol/L·min和2.41mmol/L，Kcat为0.237S-1。
采用实施例2和3制备的MIP分别催化水解不同浓度对氧磷，经测试，实施例2和3制备的MIP催化水解对氧磷的Kcat分别为0.118S-1、0.154S-1。
Claims (1)
1.一种有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：将ZnCl2、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、(4-硝基苄基)磷酸二乙酯按摩尔比为2.5:2.5:10:1溶解于乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合溶剂中，(4-硝基苄基)磷酸二乙酯与混合溶剂的体积比为1:100～200，再加入二乙烯基苯和2,2’-偶氮二异丁腈，二乙烯基苯、2,2’-偶氮二异丁腈、(4-硝基苄基)磷酸二乙酯的摩尔比为30～50:3～5:1，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射12～24小时，离心分离，所得固体用100mmol/L联吡啶的甲醇溶液振荡洗涤7小时，除去(4-硝基苄基)磷酸二乙酯，然后用甲醇洗涤，再用100mmol/LZnCl2的甲醇溶液孵育4小时，离心分离，所得固体真空干燥，得到有机磷水解模拟酶分子印迹聚合物微球。
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