CN104131096A

CN104131096A - 一种检测肉牛ucp3基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN104131096A
Application number: CN201410361884.3A
Authority: CN
Inventors: 甘乾福; 乔慧; 梁学武; 陈佳钦
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: NANPING CITY JIANYANG DISTRICT JIXIANG ANIMAL HUSBANDRY CO., LTD.
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-07-28
Also published as: CN104131096B

Abstract

本发明公开了牛UCP3基因单核苷酸多态性位点及其检测方法，以包含UCP3基因的待测牛全基因组DNA为模版，以引物对P1为引物，PCR扩增牛UCP3基因，然后进行SSCP多态性检测。其基因多态性位点包括：在牛的UCP3基因第5191位为A或G的碱基多态性。本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。

Description

一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，

以牛的肉用性状基因的单核苷酸多态性（SNP）作为分子遗传标记，特别涉及牛的UCP3（解偶联蛋白3）基因的单核苷酸多态性位点及其应用。

背景技术

随着经济的发展，人们对于牛肉的数量和品质要求日益提高。虽然我国已成为第三大养牛与牛肉生产国，但是高档大部分依赖于进口。因此提高肉用性能势在必行，途径主要有改善饲料营养，加强饲养管理水平和培育优良品种等，而良种是肉牛业发展的先决条件和物质基础。人们在了解肉用性状的遗传规律和相应的生长发育、脂肪沉积等生命活动调控规律的基础上，结合分子生物学方面的研究，发现了与肉用性状有密切联系的功能基因和主效基因以及和这些基因连锁的分子遗传标记，根据目标性状与候选基因基因型间的关联性进行选择，提高了育种方向的准确性，缩短了育种年限。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

分子生物学的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因某位点的多态性，对不同基因型个体与其生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，为选种提供依据，这一过程中检测多态性和基因分型的准确是很关键的。目前主要的方法有PCR-RFLP技术或PCR-SSCP技术结合DNA测序。

UCP3基因编码解偶联蛋白3（uncoupling protein 3，UCP3），该蛋白是解偶联蛋白超家族成员之一，最早是1997年Boss在人类骨骼肌中发现的。解偶联蛋白镶嵌在线粒体内膜上，是哺乳动物线粒体的质子载体，在氧化磷酸化解偶联、抗氧化和能量代谢调控中发挥重要作用。在猪的分子育种中已经发现，猪UCP3基因对日增重、脂肪沉积、饲料转化率和小猪初生重有重要影响。牛UCP3基因定位于牛15号常染色体。Sherman等（2008）发现牛UCP3基因内含子3一个A/G多态与欧洲牛与大不列颠杂交牛的平均日增重和局部生长效率显著相关。Li等（2010）发现南阳牛、鲁西牛、延边牛中UCP3基因BglI 酶切多态等位基因A比等位基因B频率更高。关联分析显示鲁西牛中AA型比AB型β-球蛋白含量更优。结果还显示UCP3基因BglI 酶切多态与南阳牛的生长性状显著相关，AB基因型个体优于其他个体，表明这一多态位点与牛的生长性状相关。Brennan等（2009）发现UCP3基因的mRNA水平表达量的提高与脂肪酸β-氧化和牛体重损失产生的脂肪酸副产物有关。本发明提供的检测方法为UCP3基因SNP与肉质性状关系的建立奠定了基础，以便用于肉牛肉质性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛UCP3基因SNP的筛查和检测方法，利用PCR产物混合测序的方法筛查牛UCP3基因的多态性位点。通过关联分析寻找与牛肉质性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为牛分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提高种群品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明根据UCP3基因的外显子设计引物，分别以8种牛品种的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，对PCR产物混合并纯化，测序后得到牛UCP3的部分序列。

一种用于检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的引物，所述的引物对P1为：

正向引物 5'-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3'；

反向引物5'-ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3'。

一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

⑴ 以包含UCP3基因的待测牛基因组DNA为模版，以引物对P1为引物，PCR扩增牛UCP3基因；

⑵ 对步骤⑴的扩增产物进行PCR目的片段检测；

⑶ 对步骤⑵的目的片段进行PCR-SSCP检测：首先对目的片段分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性位点。

所述多态性位点包括：在牛的UCP3基因第5191位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA、AG、GG三种基因型。

所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火40s；72℃延伸30s；72℃延伸7min；4℃保存。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。

用变性剂对PCR扩增产物进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定牛UCP3基因是否有多态性。

所述的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10%。

所述的根据PCR-SSCP分析结合DNA测序结果显示，UCP3基因片段5086-5354（命名为UC-3片段）有AA、AG、GG3种基因型。

检测牛UCP3基因单核苷酸多态性位点的方法在牛辅助选择和分子育种上的应用。

本发明对8个牛品种上述SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也对SSCP多态位点与牛肉质性状之间进行了关联分析。

本发明的优点在于：

与现有技术相比，本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变点的漏检，提供了一种简单、快速、精确度高的方法，便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。

附图说明

图1是引物P1扩增不同牛个体（牛UCP3基因第5191位多态位点）PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为600bp Marker，1-9为PCR产物

图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的牛UCP3基因序列第5191为A或G突变测序结果图。

图3是本发明牛UCP3基因第5191位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中 1为AG型，2、4、5为AA型，3为GG型。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明进一步说明。

本发明根据UCP3基因的外显子和内含子设计引物，分别以8个牛群体的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和肉质性状的关联分析，筛选出与牛肉质性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是本发明的解释而不是限定。

实施例1

一、牛UCP3基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测

1、牛样品的采集和处理

本发明采用8个牛群体共计318个个体，具体为：（1）安格斯（Angus）牛血液样品18份，晋南牛（Jinnan）血液样品23份，利木赞（Limousin）牛血液样品22份，鲁西黄牛（Luxi）血液样品29份，秦川牛（Qinchuan）血液样品27份，西门塔尔（Simmental）牛血液样品30份，夏洛莱（Charolais）牛血液样品29份，采自河北大厂县华安肉牛育肥场；（2）安格斯（Angus）牛血液样品30份，海福特（Hereford）牛血液样品30份，西门塔尔（Simmental）牛血液样品28份，采自内蒙古通辽三元肉牛育肥场；（3）西门塔尔（Simmental）牛血液样品，采自内蒙古通辽宝龙山肉牛育肥场。从每头牛的颈静脉采血8 mL于10 mL管中，加ACD抗凝剂（血液与ACD体积比为6：1）摇匀，将血样用加冰块的泡沫箱带回实验室，于-80℃超低温冰箱保存备用。

2、基因组DNA的提取

（1）冰冻血样室温下融化、摇匀，用移液枪吸取1.5mL全血加入5mL离心管中，加入1.5mL（或与血样等体积）PBS缓冲液，颠倒混匀10min，12000r/min离心10min，结束后可看到离心管底部白细胞沉淀。

（2）弃上清液，重复（1）的步骤1～2次，至下层白细胞内无红细胞。

（3）弃上清液，加入1mL裂解液SET，40μL 10% SDS，20μL蛋白酶K溶液，振荡器振荡2～3min，使之充分混匀，至于恒温水浴振荡器中55℃水浴，消化过夜至不见粘稠团块。

（4）向管中加入与管内液体等体积的Tris饱和酚（约1.5mL），盖紧管盖，缓慢连续颠倒混合不少于10min，12000r/min离心10min。

（5）小心吸取上清液至新的5 mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混和液，缓慢颠倒离心管不少于10min，使溶液两相充分混匀，12000r/min离心10min。

（6）转移上清液至另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12000r/min离心10min。

（7）转移上清液至新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，盖紧管盖，顺一个方向水平摇晃数次即可看到白色絮状DNA沉淀，离心4min，使DNA贴附在离心管管壁下部。

（8）用预冷的75%乙醇洗涤两次，小心倒出乙醇，室温放置。

（9）乙醇挥发后，加入100μL ddH₂O溶解，4℃放置，24h后，将DNA溶液转移至灭菌的1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

3、DNA浓度和纯度检测

（1）琼脂糖凝胶电泳检测

取5μL DNA溶液，与1μL上样缓冲液（6×loading buffer）混匀，于1%的琼脂糖凝胶中以100V电压电泳30min左右，结束后利用凝胶成像系统拍照，初步观察DNA的纯度。详见图1。

（2）紫外分光光度计检测

将5μl待测DNA溶液充分溶于ddH₂O，并定容至1ml。利用紫外分光光度计测得其260nm和280nm波长处的OD值。根据以下公式计算DNA纯度和浓度：

DNA浓度= OD₂₆₀×50ng/μl×200

DNA纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀

若DNA纯度在1.8-2.0之间，则DNA纯度较高；若小于1.8，则样品中可能存在RNA污染；若大于2.0，则样品中可能存在蛋白质污染。经紫外分光光度计测定OD值为1.72，纯度较高。

扩增引物设计

根据GeneBank数据库提供的牛UCP3基因的DNA序列（序列号：NC-007312.5）和mRNA序列(序列号：NM-174314.2)，利用DNAStar软件进行比对，确定外显子和内含子，利用Primer 5.0对引物进行设计和评价；

扩增引物为：

正向引物F: 5'-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3'；

反向引物R: 5'-ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3'。

二、 PCR扩增

分别以8个牛品种的DNA为模版，用上述引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为32μL，见表1；PCR总反应程序，见表2；

表1本发明的PCR反应体系

*2×Taq PCR MasterMix包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×，具体产品组成详见产品说明书

表2本发明的PCR反应程序

三、目的片段的检测

将PCR产物与核酸上样缓冲液以6:1体积比充分混匀，以600bp的DNA分子标记为对照，在浓度为1%的琼脂糖凝胶中以150v电压电泳20min左右，用凝胶成像仪拍照，根据PCR产物的大小初步判定是否为所需的目的片段。

四、 PCR-SSCP检测

1）制备聚丙烯酰胺凝胶（PAG）

配制丙烯酰胺凝胶溶液（各浓度的丙烯酰胺凝胶配方及使用见表3和表4），轻轻搅动使之混匀。

将玻璃板洗净烘干，在两边和底部夹好夹子，放入烘箱预热后拿出，迅速向两玻璃板之间的空隙注入刚配好的丙烯酰胺凝胶溶液，避免产生气泡，倒好凝胶后，将梳子轻轻插入玻璃板夹缝中，避免梳子齿周围出现气泡。

确认凝胶完全聚合后，拔掉梳子（注意保持胶孔完好），随即用0.5×TBE快速冲洗点样孔，并在顶部加入0.5×TBE，备用。

表3 DNA片段长度与所用丙烯酰胺的浓度

表4 PAG的配方

3）电泳

将玻璃板固定于垂直电泳槽内，下层倒入1×TBE，上层倒入0.5×TBE，液面应高于胶孔，100V电压预电泳10min。

将3.5μL PCR产物与8μL变性剂混匀，98℃变性10min后迅速置于碎冰中淬火约10min，防止DNA两条单链重新缔合。

变性后将样品上样于凝胶点样孔中，200V高压电泳5min，然后100V恒压电泳12h。

五、银染法洗胶

取胶：吸出电泳槽上层的TBE缓冲液，将玻璃板中的胶片小心取下，在胶上最先点样的一侧切下一角做好标记，用ddH₂O漂洗2～3次。

固定和染色：将配好的固定液和染色液混合，将胶片浸泡于混合液中，于摇床上轻摇45min后，用ddH₂O冲洗1～2次；

显影：加入刚配好的显色液，在摇床上轻摇10min，倒掉液体，用ddH₂O冲洗，凝胶成像仪或数码相机拍照保存图像，用作后续分析。详见图3。

六、测序

若聚丙烯酰胺凝胶上相同片段单链DNA的电泳图谱带型不同，则视为基因型有差异，每种带型各选取2个样本进行PCR扩增，由生物工程（上海）有限公司对PCR产物进行纯化和测序，将测序结果与GeneBank数据库上的DNA序列一一比对，以最终确定SNP位点的位置和突变种类。

由于牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，根据条带的个数判断是否发生了点突变，将不同基因型区分开，从而检测其SNP多态性。结果显示，在第5191位出现三种不同基因型（AG、GG、AA），如图3所示。

七、本发明制备的分子标记在不同牛群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对牛318份DNA样品分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2、SNP位点的频率统计分析

基因频率（gene frequency）表示在一个群体中某等位基因在该等位基因所在的特定基因座所有等位基因中所占的百分比。基因型频率（genotype frequency）表示某种特定基因型的个体占该群体全部个体的比例。计算方法如下：

（1）等位基因频率: P_i= (2ii+ij)/ 2N P_j=1-P_i

（2）基因型频率=基因型个体数/ N

其中，P_i和P_j表示i、j等位基因的频率，N表示群体总数，ii和ij表示群体中基因型为ii、ij个体的个数。

UC-3片段的等位基因频率和基因型频率见表5。就等位基因频率来看，在西门塔尔和夏洛莱群体中，G为优势等位基因，频率分别为0.7091和0.7759。其他6个群体中A基因为优势等位基因，频率很高，分别为：安格斯0.8125、海福特0.8833、晋南牛0.5652、利木赞0.6364、鲁西牛0.6034、秦川牛0.6852。从基因型频率来看，安格斯、海福特、鲁西牛群体呈现出AA >AG >GG的趋势，其中海福特群体中未检测出GG型个体；晋南牛、利木赞和秦川牛群体的基因型分布为AG>AA>GG；西门塔尔和夏洛莱群体则呈现出GG>AG>AA的趋势。

表5八种牛品种中UCP3基因5191位点的基因型和等位基因频率

3、UC-3片段的群体遗传特征

UC-3片段在所有8个群体中的多态性信息量（PIC）、遗传纯合度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）及χ²值见表6。由此表可知，海福特群体的PIC值小于0.25，说明海福特群体在该位点为低度多态；其余7个群体的PIC值都在0.25～0.5之间，表明这些群体在该位点为中度多态。

χ²适合性检验结果显示，所有8个群体在该位点的χ²值均小于5.991，说明这些群体在该位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表6 UC-3片段在8个牛群体中的多态性分析

注：χ_0.05 ²=5.991、χ_0.01 ²=9.21，χ²值肩标为**和*的数值显著水平分别为 P<0.01和P<0.05。下同。

4、UCP3基因A5191G多态性与牛肉用性状的关联分析

采用SAS9.1统计软件，对8个牛群体的不同基因型个体与性状数据进行了显著性检验（见表7）。

1）测定的主要性状包括：宰前活重、酮体重、屠宰率、净肉重、大理石花纹评分、眼肌面积、实测背膘厚、嫩度、大腿肉厚、腰部肉厚、酮体长。

2) 测定的群体：八个牛群体共318只。

关联分析一般线性的模型：调用SAS9.1软件一般线性模型GLM（genneral linear models procedure）对各基因型对肉质性状数据进行显著性检测。进行肉用性状与多态性关联分析的318个样本分别来自3个牛场的8个品种的肉牛，且月龄不同，在肉质性状数据处理中，除了考虑基因型的效应，还需要考虑到品种、场别、月龄等固定效应。本实验综合以上影响因素建立的统计模型如下：

Y_abc=μ+G_a+CR_b+M_c+e_abc

此公式中，Y_abc表示个体表型记录；μ为总体平均数；G_a为基因型效应，CR_b表示同期群效应，包括场效应和品种效应；M_c表示月龄效应，e_abc为随机误差。利用SAS 9.1统计软件依上述公式编辑运算程序，对数据进行分析，用最小二乘法拟合线性模型，各基因型间肉用性状的指标采用多重比较（邓肯法），结果用平均数±标准误（X±SE）表示，P值小于0.05为差异显著，P值小于0.01为差异极显著。

结果见表7：结果表明UCP3基因的A5191G突变位点不同基因型与净肉率、眼肌面积和平均日增重存在显著相关，其中AG型和AA型个体净肉率均极显著高于GG型个体（P<0.01）；AG型个体眼肌面积显著大于GG型个体（P<0.05）；AG型和AA型个体平均日增重分别极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）高于GG型个体。含A等位基因的个体在净肉率、眼肌面积和平均日增重方面显著优于其他个体。因此，在今后的育种工作中，应当选择含A等位基因的个体，加快具有优质肉质性状牛种群的建立。

表7 UCP3基因A5191G多态性与牛肉用性状的关联分析

注：平均数肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。P值肩标为*表示差异显著，**表示差异极显著。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术方案范围内，当可利用以上所述技术内容，而做出的些许更动、修饰、演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变，均属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcggaccgtg agtgctga 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgctggagt ctggagagga g 21

Claims

1.一种用于检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的引物，其特征在于：所述的引物对P1为：

正向引物F: 5'-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3'；

反向引物R: 5'-ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3'。

2.一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑵ 对步骤⑴的扩增产物进行PCR目的片段检测；

3.根据权利要求2所述的一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述多态性位点包括：在牛的UCP3基因第5191位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA、AG、GG三种基因型。

4.根据权利要求2所述的检测牛UCP3基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火40s；72℃延伸30s；72℃延伸7min；4℃保存。

5.根据权利要求2所述的检测牛UCP3基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。

6.一种如权利要求2所述的检测牛UCP3基因单核苷酸多态性位点的方法在牛辅助选择和分子育种上的应用。