CN104127400A - 花生四烯酸在制备抗hiv疫苗或药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了花生四烯酸（Arachidonicacid）在制备抗HIV疫苗或药物中的应用。本发明的花生四烯酸能抑制HIV中6-螺旋束的形成，具有较好的抗病毒活性，其IC₅₀值为31.42±1.08μg/ml。该化合物细胞毒性较小，其CC₅₀值为124.43±3.31μg/ml。该抗HIV化合物可在较大浓度范围内对病毒感染产生抑制作用，而不对细胞造成较大的毒性。

Description

花生四烯酸在制备抗HIV疫苗或药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及花生四烯酸在制备抗HIV疫苗或药物中的应用。

背景技术

花生四烯酸（Arachidonic acid, AA或ARA），是全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸，是ω- 6系列的一种人体重要的多不饱和脂肪酸，在维持机体细胞膜的结构与功能方面具有重要的作用,与亚油酸、亚麻酸一起被称为必需脂肪酸。广泛分布于动物界，少量存在于某个种的甘油酯中，也能在甘油磷脂类中找到。AA及其代谢衍生物不仅具有很强的生物活性，如促进大脑发育、充当第二信使、调节免疫功能、增加血管弹性、保护皮肤等，而且在许多疾病的病理生理过程中起着重要作用。AA及其衍生物在抗击炎症、降低血脂、预防与治疗冠心病和糖尿病方面均有重要作用。AA具有的明显的药理作用和广泛的生物活性，使其被誉为“21世纪功能性食品的主角”，已经广泛应用于保健食品、化妆品、医药等领域（蒋加拉，等，花生四烯酸的生理学功能及利用真菌生产的研究进展【J】.食品工业科技，2007，6 (31)：389）。然而，AA在抗HIV方面的研究目前尚无报道。

艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染引起的一种严重传染性疾病。HIV有HIV-1和HIV-2型，在全球流行的主要是HIV-1型。HIV-1表面糖蛋白gp41在介导病毒膜和宿主细胞膜融合过程中具有关键作用。在病毒进入细胞过程中，gp41上的三个C末端重复序列（CHR）功能区能够与内核的N末端重复序列（NHR）三聚体相互作用，形成六束螺旋体结构 (6-HB)，拉近病毒与宿主细胞膜，进而发生膜融合，使病毒进入细胞。目前已上市或在研究中的作用于gp41的抗HIV的药物主要是多肽类。多肽类在肠道内易被酶水解失活，不能口服，只能注射给药，给患者带来痛苦和不便。因此，研制可口服的作用于gp41的抗HIV药物成为研究的热点和目标（Haqqani et al，Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral research 2013，98: 158-70)。

发明内容

本发明的目的在于提供花生四烯酸在制备抗HIV疫苗及药物中的应用。其化学结构如（I）所示。

本发明所提供的抗HIV化合物的CC₅₀值为124.43±3.31 μg/ml，其细胞毒性较小；其IC₅₀值为31.42±1.08 μg/ml。本发明所提供的抗HIV化合物的CC₅₀值比其抗R5病毒感染活性的IC₅₀值大得多，表明其可在较大浓度范围内对病毒感染产生抑制作用，而不对细胞造成较大的毒性。

附图说明

图1是花生四烯酸与N36结合的HPCE电泳图，其中， A为花生四烯酸的电泳图，B为花生四烯酸与N36（100 μg/ml）结合的电泳图，C为花生四烯酸与N36（200 μg/ml）结合的电泳图；

图2 是对照药TF与N36结合的HPCE电泳图，其中，D为TF的电泳图，E为TF与N36结合的电泳图；

图3是花生四烯酸与TF抑制HIV六螺旋束核心结构形成的N-PAGE电泳图，其中，1是C34的电泳结果，2是N36和C34共孵育后的电泳结果，3是终浓度为454 μg/ml的花生四烯酸与N36和C34共孵育后的电泳结果，4是终浓度为454 μg/ml的TF与N36和C34共孵育后的电泳结果，5是终浓度为454 μg/ml的阴性对照药与N36和C34共孵育后的电泳结果；

图4是花生四烯酸与TF抑制HIV六螺旋束核心结构形成的N-PAGE电泳图，其中，1是C34的电泳结果，2是N36和C34共孵育后的电泳结果，3-5是终浓度分别为227 μg/ml、114 μg/ml、45 μg/ml的花生四烯酸与N36和C34共孵育后的电泳结果。

具体实施方式

花生四烯酸作用于HIVgp41六螺旋束核心结构，为了证明其所具有的技术效果，我们采用高纯度（>97.0%）的花生四烯酸进行了以下实验。以下实验所用N36是合成的具有36个氨基酸的多肽，是HIV gp41 N 末端重复序列（SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL，SEQ ID NO.1）；C34是合成的具有34个氨基酸的多肽，是HIV gp41 C 末端重复序列（WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL，SEQ ID NO.2）。

一、高效毛细管电泳（HPCE）柱端微反应器对花生四烯酸与N36结合的检测

1.实验方法

1）配制磷酸盐缓冲液（PBS），其组成为：30 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, pH 7.2。 

2）花生四烯酸标准品用无水乙醇溶解，用PBS稀释成2 mg/ml的溶液；茶黄素（TF，阳性对照）用PBS配成浓度为1 mg/ml的溶液；N36 用PBS配成浓度为100 和200 μg/ml的溶液。

3）以PBS为缓冲液，电压为17 kV，重力进样，花生四烯酸及TF样品进样时间为10秒，N36溶液的进样时间为3分钟，用HW-2000色谱工作站进行谱图采集。首先分别获得花生四烯酸、TF和N36单独进样时的谱图，然后再获得花生四烯酸和N36结合的谱图以及TF和N36结合的谱图。

2．实验结果

花生四烯酸、TF与N36结合的效果如图1和图2的HPCE电泳图所示，从图中可以看出，在与N36结合的谱图中，花生四烯酸和TF的峰高明显降低，峰形发生了变化，可见，N36与样品在毛细管电泳过程中发生了相互作用；比较图1B和图1C，增大N36的浓度可使花生四烯酸的峰高降低更显著，峰形变化更明显，可见，花生四烯酸与N36的结合呈剂量依赖性。

二、天然凝胶电泳（N-PAGE）法对花生四烯酸抑制HIVgp41六股螺旋束结构形成活性的检测。

1.实验方法

1）配制不连续天然聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶为18%，积层胶为5%。

2）将配制好的药物10 μl与400 μg/ml的N36 6 μl 在37℃共同孵育30分钟，再加入400 μg/ml的C34 6 μl 在37℃共同孵育30分钟。

3）将孵育好的混合液与8 μl 2×Tris-甘氨酸天然凝胶上样缓冲液混匀，加样到10×0.1 cm的天然聚丙烯酰胺凝胶孔中（每孔20 μl），静置5分钟。室温下120 V电压电泳90 min，考马斯蓝R250染色，脱色后用佳能400D相机拍照记录。

2.实验分组

本发明实验组：称取花生四烯酸适量，用无水乙醇溶解，用PBS配成浓度为1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml和100 μg/ml的溶液。

阳性对照组：茶黄素（TF）用水溶解，用PBS配成浓度为1000 μg/ml的溶液。

阴性对照组：一种中药提取物，用无水乙醇溶解，用PBS配成浓度为1000 μg/ml的溶液。

 3.实验结果

花生四烯酸对HIVgp41六螺旋束结构形成的抑制效果如图3和图4的N-PAGE电泳图所示，从图中可以看出，在未加药物作用的的空白对照样品中，N36和C34混合物形成两条带，箭头A所指的是gp41六螺旋束的条带，箭头B所指的是过量的C34的条带，其形成是因为N36发生了部分聚集而不能充分与C34结合形成六螺旋束，导致C34过剩；加入花生四烯酸或TF的样品中，六螺旋束结构的条带消失或仅可见很浅的条带，说明六螺旋束结构的形成明显受到了抑制。花生四烯酸在终浓度为227 μg/ml时几乎能完全抑制六螺旋束结构的形成，在浓度为114 μg/ml时能抑制大部分六螺旋束结构的形成，在浓度为45 μg/ml时能抑制部分六螺旋束结构的形成，其抑制程度随剂量的递增而增加。本实验证明花生四烯酸能够抑制HIVgp41六螺旋束结构形成。由此可见，花生四烯酸具有抗HIV活性。

三、花生四烯酸抗HIV-1 _JRFL 假病毒感染活性的检测

1、化合物抗R5病毒感染活性的检测

    （1）实验方法

    按1×10⁴/孔细胞浓度接种TZMb-1细胞100 μl，次日细胞生长状态良好后，加入化合物（50 μl）与R5病毒（50 μl）于37 ℃预孵育30 min得到的混合物，感染过夜，更换新鲜培养基。48小时后，用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测化学发光。

抑制率的计算公式为：抑制率=(1－加药孔OD值/对照孔OD值)×100%，半数有效浓度（IC₅₀）采用CalcuSyn软件计算。

（2）实验结果

花生四烯酸的IC₅₀值为31.42±1.08 μg/ml，小于阳性对照药T-20的IC₅₀值（见表1和表2），说明花生四烯酸具有抗R5病毒感染的活性。

表1

表2

2、MTT法检测细胞毒性

（1）实验方法

①生长良好的U87.CD4.CCR5用胰酶消化，离心收集，用1 mL DMEM培养基吹打均匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至1 × 10⁵/ml，然后将细胞悬液按照100 μl/孔接种到96孔板，37℃，5% CO₂条件下培养过夜；

② 按照100 μl/孔加入梯度稀释的药物，继续培养48 h；

③按照100 μl/孔加入0.5 mg/ml MTT溶液，37^oC条件下孵育4 h；

④于倒置显微镜下观察有没有药物的结晶析出，或是否有其它杂质生成，做好标记。

⑤离心96孔板，轻轻吸去上清，按照150 μl /孔加入DMSO溶解结晶。轻轻振荡10 min，酶标仪读取A ₅₇₀值。

抑制率的计算公式为：抑制率=（1-加药孔OD值/对照孔OD值）×100%，半数细胞毒性浓度（CC₅₀）采用CalcuSyn软件计算。

（2）实验结果

见表3，由实验结果可知，花生四烯酸的CC₅₀值为124.43±3.31 μg/ml，说明其细胞毒性较小。花生四烯酸的CC₅₀值比其抗R5病毒感染活性的IC₅₀值大得多，说明其可在较大浓度范围内对病毒感染产生抑制作用，而不对细胞造成较大的毒性。

表3

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  南方医科大学

 

<120>  花生四烯酸在制备抗HIV疫苗或药物中的应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  36

<212>  PRT

<213>  HIV gp41

 

<400>  1

 

Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln

            20                  25                  30         

 

 

Ala Arg Ile Leu

        35     

 

 

<210>  2

<211>  34

<212>  PRT

<213>  HIV gp41

 

<400>  2

 

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

            20                  25                  30         

 

 

Leu Leu

Claims (1)

1.花生四烯酸在制备抗HIV疫苗或药物中的应用。