CN104126528A

CN104126528A - 一种控制卤虫携带的总细菌数的方法

Info

Publication number: CN104126528A
Application number: CN201410269823.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 郭衍彪
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开一种控制卤虫携带的总细菌数的方法。该方法的步骤为：制备浓度为2×10²～2×10⁵PFU/mL的蛭弧菌稀释液，再将蛭弧菌稀释液与谷氨酸钠和蔗糖的混合溶液按体积比1:1混合，得到蛭弧菌制剂；将蛭弧菌制剂与预处理过的含卤虫的水样进行混合。本发明提供的方法简单易行，适于工业化大批量生产，其中所含有的谷氨酸钠和蔗糖，对水体及卤虫本身无毒副作用，并不会引起水体的污染和卤虫等有益水生浮游生物的死亡。通过本发明的方法可有效控制卤虫携带的总菌，在9h内即可控制总菌数在10²～10³cfu/mL以内，并在较长时间内减缓其再生。

Description

一种控制卤虫携带的总细菌数的方法

技术领域

本发明属于蛭弧菌技术领域，具体涉及一种控制卤虫携带的纵细菌数的方法。

背景技术

卤虫(Artemia)属于甲壳动物亚门鳃足(Branchiopoda)，也称盐水丰年虫。卤虫体长约1～1.3cm，体积大的卤虫其体长可达1.5cm。卤虫也有两性之分，就个头而言，雌性大于雌性，游泳时为仰泳(腹部朝上)，身体的颜色可随水体盐度的变化而变化。卤虫主要生活于盐度较高的高盐水体中，分布于内陆盐湖和海岸盐田。就全世界范围内，目前发现的卤虫栖息地有300多处。最适盐度为30‰～100‰左右，盐度高时虫体呈红褐色。虫体可分为头、胸、腹3个部分。卤虫是水产养殖中一种重要的饵料生物。1977年的研究数据就曾表明，85％的已被养殖的海洋动物都需要投喂卤虫。我国卤虫资源非常丰富。包括沿海盐田的孤雌生殖卤虫和内陆盐湖的两性生殖卤虫，卤虫在未被作为水产动物饵料前，产地附近的居民捞取卤虫成体和幼体作为家禽饵料。但是，卤虫作为某些病原菌和病毒的传播载体，进而为养殖业带来不可估量的危害。因此，控制卤虫自身携带总菌数量，即对卤虫自身健康起着至关重要的影作用，也对防止某些病原菌和病毒的传播载体起着至关重要的影响。对于卤虫自身总菌的控制而言，在水产育苗过程中，养殖户们通常会对引入卤虫饵料使用抗菌素类药物等药物投喂，以达到减少其总菌的效果。但是这些方法有其致命的一面，它不但会导致卤虫自身携带总菌产生抗药性，而且卤虫会将这些带有抗药性的细菌传递到养殖产业，从而对水产生物的育苗产生不利影响。

因此，在使用卤虫作为水产饵料养殖时，我们应当对卤虫自身携带的总菌引起高度重视。目前国内新出现了一种新型的控制卤虫总菌方法。利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，将蛭弧菌制剂施用于水体之中，可有效抵抗病原菌对水产生物的侵害，从源头上控制水产生物病害的发生。但是，目前国内将蛭弧菌制剂应用于控制高浓度卤虫自身携带总菌的研究目前尚无报道。因此，利用蛭弧菌制剂控制卤虫自身总菌，从而从源头上对水产养殖中可能存在的致病细菌进行控制，这具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种控制卤虫携带的总细菌数的方法。该方法创新性提出了一种蛭弧菌制剂在控制有益浮游生物卤虫所携带的总菌的方式；并可以适当的延长其制剂中的菌体活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种控制卤虫携带的总细菌数的方法，包括以下步骤：

(1)制备蛭弧菌稀释液；

(2)将步骤(1)制备的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合，即得到蛭弧菌制剂；

(3)含卤虫(Artemia saline)的水样的预处理；

(4)将步骤(2)的蛭弧菌制剂与步骤(3)的含卤虫的水样进行混合。

所述的蛭弧菌优选为咸水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066；对所述的蛭弧菌进行负染后透射电镜观察可知：BDM01呈单细胞，弧形，菌体大小为：1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长3.5μm。BDM01采用双层平板培养的方法于28℃培养3天可形成直径3～4mm的透明的圆形噬菌斑；

所述的蛭弧菌稀释液优选通过以下步骤获得：

①宿主菌浓缩液的制备：挑取枯草芽孢杆菌单菌落(枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIMT1.135)，接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB(diluted nutrient broth)液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

②蛭弧菌稀释液的制备：按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液过滤，滤液使用质量体积比(g/mL)3％盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，制备得到2×10²～2×10⁵PFU(plaque-formingunit)/mL的蛭弧菌稀释液；

所述的蛭弧菌优选为咸水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066；

步骤①中所述的营养肉汤液体培养基优选为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；

步骤①中所述的培养的条件优选为150rpm、28℃培养12h；

步骤①中所述的离心的条件优选为4℃、6000rpm离心10min；

步骤②中所述的恒温培养的条件优选为150rpm、28℃培养；

步骤②中所述的将培养液离心的条件优选为6000rpm、4℃离心20min；

步骤②中所述的过滤优选为用0.45μm醋酸纤维素膜进行过滤；

步骤①和②中所述的DNB液体培养基，优选通过如下步骤制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，30g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用；

步骤②中所述的质量体积比(g/mL)3％盐度的灭菌蒸馏水优选用海水晶制备得到；

步骤(2)中所述的保护剂优选为质量体积比(g/mL)5～25％谷氨酸钠和质量体积比(g/mL)5～25％蔗糖的混合溶液；

步骤(2)中所述的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合优选按照蛭弧菌稀释液与保护剂进行体积比1：1混合；

步骤(3)中所述的含卤虫的水样的预处理方法，包括如下步骤：采集自卤虫的养殖水体的水样，将从养殖水体取得的水样静置30～35min，取上层带有浮游卤虫的水样，除去沉淀在底部的泥沙等杂质，即为实验所使用含卤虫的水样；经观察计数，其卤虫数目为1～2个/mL；

步骤(4)中所述的混合优选将蛭弧菌制剂与含卤虫的水样按照体积比1:(10～100)混合；

本发明的机理是：通过向培养好的蛭弧菌中添加谷氨酸钠及蔗糖，制备成为一种蛭弧菌制剂，分别探讨不同浓度的蛭弧菌制剂对于卤虫所携带的总菌的控制效果。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明获得了一种蛭弧菌制剂的制备方法，通过该方法制备得到的蛭弧菌制剂可以在较长的时间内维持其制剂中蛭弧菌裂解活性。

(2)本发明制备的蛭弧菌制剂中含有保护剂(谷氨酸钠和蔗糖的混合液)，而谷氨酸钠和蔗糖的混合液对水体及卤虫本身无毒副作用，同时不会引起水体的污染和卤虫等有益水生浮游生物的死亡。

(3)本发明提供的蛭弧菌制剂的制备方法简单易行，适于工业化大批量生产，其中所含有的谷氨酸钠和蔗糖，选材广泛价格低廉，适用于推广使用。

(4)本发明提供的该种蛭弧菌制剂可以有效的控制卤虫所携带的的总菌，在9h内即可控制总菌数目在10³cfu/mL以内，并在较长的时间内减缓其再生。

(5)本发明中所述的蛭弧菌制剂的浓度可以根据实际应用的需要进行适当的调整，以达到最佳的控制卤虫所携带的总菌目的效果。

附图说明

图1是实验组A、实验组B、实验组C和实验组C1的实验效果比对图。

图2是实验组A、实验组B、实验组D和实验组D1的实验效果比对图。

图3是实验组A、实验组B、实验组E和实验组E1的实验效果比对图。

图4是实验组A、实验组B、实验组F和实验组F1的实验效果比对图。

图5是实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E和实验组F的实验效果比对图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。

咸水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M208066；对所述的蛭弧菌进行负染后透射电镜观察可知：BDM01呈单细胞，弧形，菌体大小为：1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长3.5μm。BDM01采用双层平板培养的方法于28℃培养3天可形成直径3～4mm的透明的圆形噬菌斑。蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01在中国专利申请文件“申请号：201010268459.1，名称为：蛭弧菌游泳体在制备防治大菱虾红嘴病菌剂中的应用”中公开。

实施例1

具体实验方法如下：

一、材料、培养基和溶液

(1)材料

蛭弧菌：BDM01。

宿主菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GIMT1.135，购于广东省微生物所菌种保藏中心。

含卤虫(Artemia saline)的水样：采集自山东省的蓬莱抹直口海水养殖厂的含有旧金山湾卤虫(Artemia franciscana)的养殖水体的水样，经观察计数，其卤虫数目为约在2个/mL。

(2)培养基

2216E佐贝尔海洋细菌培养基：海水晶30g，蛋白胨5g，酵母浸膏1g，磷酸高铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.6～7.8，琼脂15g。121℃0.1MPa下灭菌20min后倾注平板保存备用。

TCBS琼脂培养基(弧菌选择性培养基)：TCBS琼脂89g，加入蒸馏水1000mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，倾注灭菌平板保存备用。

营养肉汤液体培养基：营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用。

DNB液体培养基：营养肉汤0.8g/L，酪蛋白酸水解物0.5g/L，酵母提取物0.1g/L，30g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用。

(3)溶液

PBS(磷酸缓冲液)缓冲液(0.1M)：量取0.2mol/L磷酸二氢钠(27.8g磷酸二氢钠定容至1000mL)28mL和0.2mol/L磷酸氢二钠(53.65g七水磷酸氢二钠定容至1000mL)72mL混合均匀，用蒸馏水定容至200mL，即为0.1mol/LPBS溶液，pH约为7.2。

二、实验方法

(1)宿主菌浓缩液的制备

挑取枯草芽孢杆菌单菌落(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIM1.355)，接种于营养肉汤液体培养基中，150rpm、28℃培养12h，得到培养液，然后将培养液4℃、6000rpm离心10min，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB(diluted nutrient broth)液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

(2)蛭弧菌稀释液的制备

按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，150rpm、28℃恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液6000rpm、4℃离心20min，取上清液用0.45μm醋酸纤维素膜进行过滤，滤液使用质量体积比(g/mL)3％盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，分别得到1×10²PFU(plaque-forming unit)/mL、1×10³PFU/mL、1×10⁴PFU/mL、1×10⁵PFU/mL和2×10²PFU(plaque-forming unit)/mL、2×10³PFU/mL、2×10⁴PFU/mL、2×10⁵PFU/mL的8种浓度的蛭弧菌稀释液。

(3)蛭弧菌制剂样品的制备

将步骤(2)中培养稀释后的2×10²PFU/mL、2×10³PFU/mL、2×10⁴PFU/mL和2×10⁵PFU/mL4种浓度的蛭弧菌稀释液按照体积比1:1的比例添加含有质量体积比(g/mL)6％(w/v)蔗糖和质量体积比(g/mL)6％(w/v)谷氨酸钠的混合溶液，从而得到制备出的均含有质量体积比(g/mL)3％(w/v)蔗糖和质量体积比(g/mL)3％(w/v)谷氨酸钠的4种浓度的蛭弧菌制剂。

使用DNB双层平板法检测其蛭弧菌制剂中蛭弧菌的活菌浓度并记录，即作为蛭弧菌制剂，并可将其应用于控制卤虫所携带的的总菌当中。

(4)实验用样品的处理及实验组设置

实验用水样的处理：从文献中知道，卤虫体长约1～1.3cm，体积大的卤虫其体长可达1.5cm，因此我们可以肉眼将其从养殖水体中挑选出来。在处理实验用水样时，将从养殖水体取得的水样若干静置30min，倾倒出上层带有浮游卤虫的水样，除去沉淀在底部的泥沙等杂质，即为实验所使用的水体样本。吸取10mL水样进行观察，记录其中的卤虫数目，即为实验用所含卤虫的水样。

实验组设置：对于所取养殖水体，通过设置对照组、不同浓度的蛭弧菌制剂进行实验，每个实验组别的具体设置如下，即实验组A～F1：

实验组A：每50mL实验水样中添加1mL灭菌的质量体积比(g/mL)3％盐度蒸馏水，作为对照组。

实验组B：每50mL实验水样中添加1mL含有质量体积比(g/mL)3％(w/v)谷氨酸钠和质量体积比(g/mL)3％(w/v)蔗糖的混合溶液。

实验组C：每50mL实验水样中添加1mL步骤(3)中制备的浓度为10²PFU/mL的蛭弧菌制剂。

实验组C1：每50mL实验水样中添加1mL步骤(2)中制备的浓度为10²PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。

实验组D：每50mL实验水样中添加1mL步骤(3)中制备的浓度为10³PFU/mL的蛭弧菌制剂。

实验组D1：每50mL实验水样中添加1mL步骤(2)中制备的浓度为10³PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。

实验组E：每50mL实验水样中添加1mL步骤(3)中制备的浓度为10⁴PFU/mL的蛭弧菌制剂。

实验组E1：每50mL实验水样中添加1mL步骤(2)中制备的浓度为10⁴PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。

实验组F：每50mL实验水样中添加1mL步骤(3)中制备的浓度为10⁵PFU/mL的蛭弧菌制剂。

实验组F1：每50mL实验水样中添加1mL步骤(2)中制备的浓度为10⁵PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。

实验组A～F1的10个实验组别，每个做3个平行，每个平行样品水样为50mL使用三角烧瓶盛装，置于无菌恒温箱内，室温25℃放置1d后开始进行实验，容器上方覆盖灭菌塑料膜密封，防止灰尘等杂物污染，以使水体中的细菌菌群达到稳定。对于实验组A～F1，0h时添加一次对应的实验样品，按照后续的检测要求进行检测。

(5)取样检测

对于所有实验组别，在添加蛭弧菌制剂等后立即取样检测，即为0h的检测值，后续每隔3h取样进行检测，取样时间点分别为0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h和24h，取样的全过程都严格遵循无菌操作，具体操作方法如下：

对于卤虫的取样处理方式：使用小镊子夹取1个卤虫浮游生物个体放入灭菌培养皿，再通过研钵碾碎后，再通过1mL的质量体积比(g/mL)3％咸淡水反复冲洗多次，整个取样过程都严格遵循无菌操作，在超净台内进行，所得的液体即为待检测卤虫样品。

(6)总细菌数的检测

在到达设定的检测时间点时，将步骤(5)中的取样处理后的卤虫样品使用PBS缓冲液按10倍梯度进行稀释，取各梯度稀释液0.1mL，均匀涂布于2216E佐贝尔海洋细菌培养基平板，将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养4～5d，计算出样品中的总细菌浓度，单位为cfu/mL。

(7)数据分析

实验中各实验组3个平行样品菌数检测的数值取平均值，使用MS Excel进行显著性分析，可信度高，菌数检测结果均以平均数±标准差的形式表示。

三、实验结论

蛭弧菌制剂对卤虫所携带的总菌的控制

(1)浓度为10²PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对

图1可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.28×10⁷cfu/mL；添加质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.17×10⁷cfu/mL。添加浓度为10²PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组C1)，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至3.69×10⁶cfu/mL，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为10²PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组C)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至1.24×10⁴cfu/mL，并且在随后的12h内维持稳定，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3％谷氨酸钠+3％蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组存在显著差异。

(2)浓度为10³PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对

图2可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.28×10⁷cfu/mL；添加质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.17×10⁷cfu/mL。添加浓度为10³PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组D1)，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至6.78×10⁵cfu/mL，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为10³PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组D)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至6.31×10³cfu/mL，并且在随后的12h内维持稳定，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3％谷氨酸钠+3％蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组存在显著差异。

(3)浓度为10⁴PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对

图3可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.28×10⁷cfu/mL；添加质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.17×10⁷cfu/mL。添加浓度为10⁴PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组E1)，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至5.44×10⁵cfu/mL，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为10⁴PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～9h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至3.98×10²cfu/mL，并且在随后的15h内维持稳定，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3％谷氨酸钠+3％蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组存在显著差异。

(4)浓度为10⁵PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对

图4可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.28×10⁷cfu/mL；添加质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁶～10⁷cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到5.17×10⁷cfu/mL。添加浓度为10⁵PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组F1)，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～12h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至2.65×10⁶cfu/mL，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为10⁵PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组F)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，0～9h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的2.03×10⁷cfu/mL降至9.86×10³cfu/mL，并且在随后的15h内维持稳定，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3％谷氨酸钠+3％蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组存在显著差异。

综上所述，对比发现，所有不含有3％谷氨酸钠+3％蔗糖的单纯蛭弧菌制剂在控制卤虫携带细菌中的效果均没有含有3％谷氨酸钠+3％蔗糖的混合蛭弧菌制剂的效果好，其2者存在显著差异，因此说明，添加了保护剂的蛭弧菌制剂在控制卤虫中总细菌数目的效果上，好于未添加的组别，因此后面的研究集中于对比不同浓度的含有保护剂蛭弧菌制剂对于卤虫携带细菌的控制效果。

(5)不同浓度蛭弧菌制剂效果比对

图5可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在0～24h内其总细菌数目维持在10⁷cfu/mL左右；添加质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组，其中的总细菌数的变化趋势与对照组相同，在0～24h内其总细菌数目对数值变化在±0.33个数量级，并且在24h时其终总菌数达到稳定。上述两个实验组，相同时间点差异不大，0～24h内总细菌数变化无显著差异，并且组内不同时间点时的总细菌数，在0～24h内无明显差异。添加含有保护剂的不同浓度蛭弧菌制剂的组别均对于卤虫所携带的的总菌有较好的控制效果，观察对比10²PFU/mL、10³PFU/mL、10⁴PFU/mL和10⁵PFU/mL4种浓度的蛭弧菌制剂的控制效果发现，10⁴PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂可以对卤虫所携带的的总菌有较好的控制效果，其在9h就可以使其中的总细菌数目下降5个数量级，而其他浓度的蛭弧菌制剂在9h时，对于卤虫所携带的的总菌的控制效果没有10⁴PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂好，在对于总菌对数值的控制上较10⁴PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂少2个数量级，但仍然具备一定的控制效果。

同时，对比对照组和质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖组发现，向含有卤虫的水体中投放浓度为质量体积比(g/mL)3％谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3％蔗糖的混合溶液并未使其中的总细菌数目有显著变化，并且不含有保护剂的蛭弧菌制剂具有一定的控制效果，但是没有与保护剂共同使用时的协同效果好，这表明在制备蛭弧菌制剂中添加的谷氨酸钠和蔗糖对于含有卤虫的水体及卤虫本身无污染及毒副作用，还可以获得更加优异的控制效果。因此，其可以用于蛭弧菌制剂的制备当中。

总之，浓度为10⁴PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂即可在9h快速的降低卤虫所携带的的总菌数目，对于卤虫所携带的总菌的控制效果可以在较长时间内得到维持，是一种良好的防控水体及卤虫所携带的总菌的有益菌制剂，将其投入大规模生产后，相信其可以对当前的水产养殖业及食品加工行业都产生重大深远的影响。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备蛭弧菌稀释液；

(3)含卤虫的水样的预处理；

(4)将步骤(2)蛭弧菌制剂与步骤(3)的含卤虫的水样进行混合。

2.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，为2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066。

3.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

所述的蛭弧菌稀释液的浓度为2×10²～2×10⁵PFU/mL。

4.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

所述的保护剂为质量体积比5～25％谷氨酸钠和质量体积比5～25％蔗糖的混合溶液。

5.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合按照蛭弧菌稀释液与保护剂进行体积比1：1混合。

6.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

所述的含卤虫的水样中的卤虫数目在1～2个/mL。

7.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的混合是将蛭弧菌制剂与含卤虫的水样按照体积比1:(10～100)混合。

8.根据权利要求1所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

所述的蛭弧菌稀释液通过以下步骤获得：

①宿主菌浓缩液的制备：挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

②蛭弧菌稀释液的制备：按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液过滤，滤液使用质量体积比3％盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，制备得到2×10²～2×10⁵PFU/mL的蛭弧菌稀释液。

9.根据权利要求8所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

步骤①中所述的营养肉汤液体培养基为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；

步骤①中所述的培养的条件为150rpm、28℃培养12h；

步骤①中所述的离心的条件为4℃、6000rpm离心10min；

步骤②中所述的恒温培养的条件为150rpm、28℃培养；

步骤②中所述的将培养液离心的条件为6000rpm、4℃离心20min；

步骤②中所述的过滤为用0.45μm醋酸纤维素膜进行过滤；

步骤②中所述的质量体积比3％盐度的灭菌蒸馏水用海水晶制备得到。

10.根据权利要求8所述的控制卤虫携带的总细菌数的方法，其特征在于：

步骤①和②中所述的DNB液体培养基，通过如下步骤制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，30g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min保存备用。