CN104119551A - 钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法;在明胶溶液中加入锶盐和钙盐,搅拌使充分溶解,得到混合均匀的溶液;将等离子处理表面改性的人工韧带浸入所述溶液中,加入磷酸盐,搅拌形成混合溶液后,在太阳光或模拟太阳光照射下20~60min,用滤纸吸干;重复第三步,直至达到预设的矿化循环次数,即可。本发明方法模拟自然骨的生物矿化机制,将天然高分子或明胶作为基质或模版沉积磷灰石无机盐层,在材料表面进行复合涂层,使得人工韧带载有纳米级的锶羟基磷灰石,从而改善材料的生物相容性及骨传导性,使之在生物活性和力学性能方面满足临床医学的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法。
背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带作为膝关节交叉韧带损伤重建的移植物,已在临床上得到广泛应用,其中短期疗效及安全性较为满意,但是仍存在腱骨愈合不佳和并发滑膜炎等问题。因此,提高PET材料的生物相容性,促进人工韧带骨道部腱骨愈合尤为重要。
对PET人工韧带移植物表面进行涂层(surface coating)处理,以增进生物材料的亲水性、生物相容性及骨传导性已成为骨科生物材料的发展重点。合理利用多种成分复合构建生物医用材料,将大分子蛋白质或酶等有机高分子物质以及HAp或Ca-P物等无机材料同时引入材料表面,使复合涂层材料兼备两者的优势,已经成为骨科领域促进植入物与宿主骨愈合的理想涂层方法。
既往有应用固定剂交联固定和去抗原处理过的动物韧带或肌腱所形成的基材制备生物性的人工韧带(如专利号CN1903144A),也有应用臭氧化作用表面接枝法使得PET材料表面直接形成自由基,改性后的聚对苯二甲酸乙二醇酯生物相容性好(如专利号CN103289020A),但此改性修饰的PET人工韧带仅仅改良了PET材料表面的亲水性,而对于对于成骨细胞的黏附、增殖和分化作用有限。这样的表面修饰并不能满足临床日益增高的需要。
锶元素是人体骨中必需元素之一,在人体内99%蓄积于骨骼,在骨中的含量约占骨重量的0.01%。目前研究表明,少量增加的锶离子浓度可以显著促进成骨细胞的生长复制,刺激新骨形成;并抑制破骨细胞活性,减少新形成骨的再吸收。羟基磷灰石具有很强的活性,其中的钙易于被其他元素替代,用锶替代钙可以得到掺锶羟基磷灰石。锶的加入可以增加羟基磷灰石的机械性能;锶的加入可引起晶格畸变,提高羟基磷灰石的降解性能,由于锶本身就是人体重要的微量元素,加入锶可以增加了生物相容性和安全性。研究发现,植入物中含有和/或释放锶离子的表面氧化物层则可诱导成骨细胞中的碱性磷酸酶的生成增加,其对于进一步的分化和矿化至关重要。
目前一些研究表明通过应用明胶溶液复合羟基磷灰石(HAP)人工涂覆方法对PET人工韧带材料表面进行涂层,可良好的改变PET材料人工韧带的性能。但研究结果也显示人工直接涂覆法存在涂层不均匀、缺乏稳定性、实验结果可重复性较差以及成骨分化速率不高等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中的存在缺陷,提供一种钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法。通过利用仿生矿化的方法,在人工韧带表面以明胶作为矿化模板,形成矿化结构均匀且性能稳定的HAP(羟基磷石灰)掺合锶复合涂层,实现对人工韧带的表面改性,促进人工韧带在膝关节交叉韧带重建中的腱骨愈合。本发明方法操作简单,条件温和,成本低且环境友好,仿生矿化涂层修饰后的人工韧带稳定性和生物相容明显改善,是一种对目前人工韧带技术改进的简单方法,拥有巨大的市场应用价值。
本发明采用明胶诱导HAp掺杂锶的矿化方法形成有机/无机杂化体的结构和性能。这种技术模拟自然骨的生物矿化机制,将天然高分子或明胶作为基质或模版沉积磷灰石无机盐层,在材料表面进行复合涂层,使得人工韧带载有纳米级的锶羟基磷灰石,从而改善材料的生物相容性及骨传导性,使之在生物活性和力学性能方面满足临床医学的要求。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法,所述方法包含如下步骤:
第一步,配置明胶溶液:在50℃~60℃的温度下,将明胶溶解于离子水,配制成质量浓度为2%~10%的明胶溶液;
第二步,人工韧带材料表面改性:对人工韧带材料表面用等离子体处理,取出,投入嫁接剂溶液浸泡2~6h,最后纯水清洗并真空干燥,得到表面改性的人工韧带;
第三步,在所述明胶溶液中加入钙盐和锶盐,搅拌使充分溶解,得到混合均匀的溶液;将表面改性的人工韧带浸入所述溶液中,取出晾干,再浸泡于60mM~90mM磷酸盐溶液中,在太阳光或模拟太阳光照射下20~60min,取出,吸干;所述钙盐和锶盐的摩尔比为2~4∶1;
第四步,重复第三步(即:将韧带重新浸入上述第三步的含钙盐、锶盐的明胶溶液后,取出晾干,再浸泡于上述第三步的磷酸盐溶液),直至达到预设的矿化循环次数,得到所述钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带。即厚度在20nm~500nm之间的羟基磷灰石掺杂锶复合明胶矿化涂层修饰的新型人工韧带。
优选地,所述等离子体处理为:在本底真空5×1010-2~8×1010-2Pa、功率200~400W条件下,用H2或Ar2等离子体对人工韧带材料表面处理8~20min。
优选地,所述嫁接剂选自丙烯酸单体、聚乙二醇、肝素、胰素和白蛋白中的一种或者几种的混合物。
优选地,所述嫁接剂溶液的浓度为10mM~100mM。
优选地,所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸钾、磷酸二氢铵、磷酸铵中的一种或几种的混合物。
优选地,所述锶盐选自硝酸锶、氯化锶和二氯化锶中的一种或几种的混合物。
优选地,所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙和碳酸钙中的一种或几种的混合物。
优选地,所述人工韧带材料为PET人工韧带材料。
优选地,所述矿化循环次数为20~30次,所预设的矿化循环次数以钙锶/明胶仿生涂层达到20nm~500nm时为止。
优选地,加入锶盐和钙盐后,溶液的pH调至7~8。
本发明通过对PET移植物表面进行锶/明胶仿生涂层(surface coating)处理,不仅能有效改善PET表面的亲水性,也能进一步促进表面黏附成骨细胞的增殖和分化。与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
(1)仿生无机磷灰石层沉积于类似人体组织内环境条件,其成分更接近于人体骨无机质,从而提高材料的生物相容性和骨结合能力;
(2)锶离子可进一步改善人工韧带的生物相容性、骨传导性及良好力学性能,促进腱骨愈合;
(3)明胶结构单元为甘氨酸-脯氨酸和羟脯氨酸与赖氨(Gly-Pro-Hyp-Hyl),为柔性两性电解质,利于细胞粘连;用明胶作为钙磷盐生长模板,可模拟生物矿化体系;
(4)该工艺在低温下进行,为共沉积蛋白质等生物大分子提供了可能性;
(5)该方法可使人工韧带制备成较为均匀的仿生矿化纳米涂层,可解决前期研究中通过在材料表面应用直接人工涂覆的方法而造成的涂层不均匀、稳定性较差的问题,通过改性增加人工韧带的组织相容性,增加腱骨愈合的几率。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为扫描电镜SEM观测示意图;其中,a为新鲜制备的涂层修饰PET人工韧带的SEM图,b为在人体模拟液浸泡14天后的涂层修饰PET人工韧带的SEM图;
图2为PET人工韧带表面涂层修饰前后的接触角对比示意图;
图3为表面处理前后的PET人工韧带与293T细胞共培养48小时后MTT检测结果示意图;
图4为未处理的PET人工韧带和表面涂层修饰后的PET人工韧带与骨髓间充质细胞共同培养14天后碱式磷酸酶的活性示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中的原料均为现有常用原料,可以直接通过商家购买获得。本发明以下实施例中没有特别说明的操作,均可以采用现有常规技术手段。
实施例1
在本底真空5×1010-2Pa、功率200W条件下用H2等离子体对PET人工韧带处理8min,后投入10mM丙烯酸单体嫁接溶液浸泡2h,最后纯水清洗并真空干燥备用;
将骨明胶颗粒2g加入到100ml去离子水中溶胀,而后加热至55℃形成2wt.%的骨明胶溶液,摩尔浓度为;然后将6ml 40mM的CaCO3和6ml 20mM SrNO3加入明胶溶液中,调节pH值到7,25℃下搅拌10min,得到混合均匀的溶液;将预处理后的人工韧带浸泡于此混合液中,使游离的Ca和Sr离子和明胶与韧带充分结合,将韧带取出滤纸晾干,最后浸泡于500ml 60mM新鲜制备的Na2HPO4溶液,在太阳光照射下20min,重复以上步骤20次,得到羟基磷灰石掺杂锶复合明胶20nm~500nm之间的矿化涂层修饰的新型人工韧带。
通过利用扫描电镜观测涂层修饰的PET人工韧带如下图1.a,可以观测到所制备的涂层均一,表面光滑。此外将所制备的材料静置与人体模拟液14天后,所制备的涂层仍均有比较好的稳定性,没有出现崩解的现象(图1.b),说明所制备的涂层具有很好的均一性和稳定性。
同时,通过接触角测试,发现PET材料表面由疏水转为亲水(图2)。同时,将高压湿热灭菌的新型人工韧带加入10mL MEM完全培养基,37℃浸提36h,离心取上清为原始材料浸提液。复苏293T细胞,DMEM培养基生长至对数生长期,消化传代,接种96孔板。24h后待细胞贴壁长好,加入原始材料浸提液,同时设置PET人工韧带浸提液处理细胞作为对照组。继续培养48小时后,MTT法测定细胞成活率。如图3,也证实相较于未处理的PET人工韧带,本发明所制备的涂层修饰人工韧带具有更好的生物相容性(图3)。
进一步的细胞实验,通过培养骨髓间充质(BMCS)细胞,DMEM培养基生长至对数生长期,消化传代,24h后待细胞贴壁长好,加入原始材料浸提液,同时设置未表面处理PET人工韧带浸提液处理细胞作为对照组。继续培养不同时间后,通过碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定细胞的ALP活性。如图4,也表明碱式磷酸酶(ALP)在羟基磷灰石/锶/明胶涂层修饰PET人工韧带组中表达明显高于未处理的PET人工韧带组,说明所制备的涂层能有效促进骨髓间充质细胞的成骨分化,有利于腱骨愈合。
其他实施例中,相关实验检测结果类似,在此就不一一例举。
实施例2
在本底真空8×1010-2Pa、功率400W条件下用Ar2等离子体对PET人工韧带处理20min后投入100mM聚乙二醇单体嫁接溶液浸泡3h,最后纯水清洗并真空干燥备用;
将骨明胶颗粒10g加入到100ml去离子水中溶胀,而后加热至50℃形成10%骨明胶溶液,然后将6ml 120mM的CaCO3和6ml 30mM二氯化锶加入明胶溶液中,调节pH值到8,25摄氏度下搅拌20min,得到混合均匀的溶液;将预处理后的人工韧带浸泡于此混合液中,搅拌反应45min。使游离的Ca和Sr离子和明胶与韧带充分结合,将韧带取出滤纸晾干,最后浸泡于600ml 90mM新鲜制备的磷酸钠溶液,在模拟太阳光照射下30min,重复以上步骤30次,得到羟基磷灰石掺杂锶复合明胶20nm~500nm之间的矿化涂层修饰的新型人工韧带。
实施例3
将骨明胶颗粒10g加入到200ml去离子水中溶胀,而后加热至60℃形成5%骨明胶溶液,将6ml 300mM的硝酸钙和碳酸钙混合液,以及6ml 50mM硝酸锶和氯化锶的混合液加入5%明胶溶液中,调节pH值到7.4,25℃下搅拌30min,得到混合均匀的溶液;然后在本底真空7×1010-2Pa、功率350W条件下用H2等离子体对PET人工韧带处理15min后投入55mM肝素单体嫁接溶液浸泡6h,最后纯水清洗并真空干燥;将预处理后的人工韧带浸泡于此混和液中,搅拌反应50min,使游离的Ca和Sr离子和明胶与韧带充分结合,将韧带取出滤纸晾干,最后浸泡于250ml 75mM新鲜制备的磷酸二氢钾和磷酸钾混合溶液,在模拟太阳光照射下60min,重复以上步骤25次,得到羟基磷灰石掺杂锶复合明胶20nm~500nm之间的矿化涂层修饰的新型人工韧带。
实施例4
在本底真空5×1010-2Pa、功率285W条件下用H2等离子体对PET人工韧带处理15min后投入30mM聚乙二醇和胰素嫁接溶液浸泡2.3h,最后纯水清洗并真空干燥备用。
将骨明胶颗粒20g加入到200ml去离子水中溶胀,而后加热至55℃形成10%骨明胶溶液,将6ml 280mM的CaCl2和6ml 75mM氯化锶加入明胶溶液中,调节pH值到7.8,25℃下搅拌30min,得到混合均匀的溶液;然后将预处理后的人工韧带浸泡于明胶液中,搅拌反应25min。使游离的Ca和Sr离子和明胶与韧带充分结合,将韧带取出滤纸晾干,最后浸泡于500ml 90mM新鲜制备的磷酸铵溶液,在模拟太阳光照射下35min,重复以上步骤27次,得到羟基磷灰石掺杂锶复合明胶20nm-500nm之间的矿化涂层修饰的新型人工韧带。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带的制备方法,其特征在于,所述方法包含如下步骤:
第一步,配置明胶溶液:在50℃~60℃的温度下,将明胶溶解于离子水,配制成质量浓度为2%~10%的明胶溶液;
第二步,人工韧带材料表面改性:对人工韧带材料表面用等离子体处理,取出,投入嫁接剂溶液浸泡2~6h,最后纯水清洗并真空干燥,得到表面改性的人工韧带;
第三步,在所述明胶溶液中加入钙盐和锶盐,搅拌使充分溶解,得到混合均匀的溶液;将表面改性的人工韧带浸入所述溶液中,取出晾干,再浸泡于60mM~90mM磷酸盐溶液中,在太阳光或模拟太阳光照射下20~60min,取出,吸干;所述钙盐和锶盐的摩尔比为2~4∶1;
第四步,重复第三步,直至达到预设的矿化循环次数,得到所述钙锶/明胶仿生涂层修饰人工韧带。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述等离子体处理为:在本底真空5×1010-2~8×1010-2Pa、功率200~400W条件下,用H2或Ar2等离子体对人工韧带材料表面处理8~20min。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述嫁接剂选自丙烯酸单体、聚乙二醇、肝素、胰素和白蛋白中的一种或者几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述嫁接剂溶液的浓度为10Mm~100mM。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸钾、磷酸二氢铵、磷酸铵中的一种或几种的混合物。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述锶盐选自硝酸锶、氯化锶和二氯化锶中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙和碳酸钙中的一种或几种的混合物。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述人工韧带材料为PET人工韧带材料。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述预设的矿化循环次数以钙锶/明胶仿生涂层达到20nm~500nm时为止。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述预设的矿化循环次数为20~30次。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |