CN104107188A - 苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途及其制备方法，具体为苹果多糖及其制剂在预防或治疗肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌治疗的药品、保健品、食品中的应用。苹果多糖来源于苹果或苹果渣，如果使用苹果渣提取苹果多糖，一方面绿色环保，另一方面没有副作用，并克服了直接服用苹果所带来的高糖、引起龋齿的副作用，同时克服了现有的来源于牛乳的低聚糖所带来的腹泻等产品的缺陷。

Description

苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途及其制备方法

技术领域

本发明涉及功能性提取物技术领域，具体涉及一种调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖、制剂及其制备方法。

背景技术

肠道菌群紊乱与因肠道菌群紊乱导致的便秘与肥胖、胰岛素抵抗、便秘、炎性肠病、结肠癌、肝癌密切相关。研究表明，肥胖者肠道硬壁门菌丰度明显升高，而拟杆菌门丰度显著减少，结肠癌患者粪便的具核梭菌显著增多，炎性肠病患者的肠道菌群比例显著失调。

调节肠道菌群的紊乱可纠正肥胖、治疗便秘，并改善II型糖尿病患者的胰岛素抵抗，预防肿瘤的发生。目前的研究表明，来源于牛乳的低聚半乳糖能被双歧杆菌选择性的酵解利用，调节肠道微生态平衡。

苹果具有润肠通便作用，但是物质基础和作用机制却不清楚，苹果是否具有调节肠道菌群的作用尚无文献记载，尤其是，苹果多糖(低聚糖、寡糖)可调节肠道菌群并用于改善便秘和肥胖的预防和治疗尚无报道。提取苹果中可调节肠道菌群、润肠通便的多糖（低聚糖、寡糖）成分，并研究其在预防及治疗便秘和肥胖、改善胰岛素抵抗、预防肿瘤的发生等临床问题中的应用效果非常必要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途。

本发明的目的之二在于提供一种调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖的制备方法。

本发明采用的技术方案是：苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，所述苹果多糖及其制剂在预防或治疗肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌治疗的药品中的应用。

进一步，所述苹果多糖制成胶囊剂、或片剂、或颗粒剂、或口服液、或散剂；所述苹果多糖单独使用或与其他成分配合使用，与其他成分配合使用时配方中苹果多糖质量含量为50~90%。

苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，所述苹果多糖及其制剂在预防或治疗肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌的保健品及食品中的应用。

进一步，所述苹果多糖的添加量为质量分数50~90%。

进一步，所述的肠道菌群紊乱是指肠腔内菌群的益生菌与有害菌比例失调而导致的结肠功能紊乱，所述的肥胖是由于饮食导致肠道菌群紊乱所导致的肥胖，所述的胰岛素抵抗是肠道菌群紊乱所导致的胰岛素抵抗。

进一步，所述苹果多糖为多糖、低聚糖、寡糖中的一种或多种的混合物。

用于调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖的制备方法，依次包括如下步骤：

步骤1）取新鲜苹果榨汁后的苹果渣，用体积比为50%~100%的酒精浸泡3~30天，料液比为3:1，单位g/L；

步骤2）步骤1）中的浸提液采用回流塔浓缩，收集回流液；苹果渣采用无水乙醇回流3~7次，料液比为4:1，单位g/L，每次2~8h，收集上清液；残渣晾干至完全干燥，再用自来水或纯净水回流3~4次，料液比为4:1，单位g/L，每次3~8小时，收集并合并三次收集的回流液；

步骤3）回流液采用回流塔浓缩，获得浓缩液即苹果多糖提取液；苹果多糖提取液用体积比为70~85%的乙醇沉淀，收集沉淀并干燥，得到苹果粗多糖；

步骤4）步骤3）中的苹果粗多糖用水溶解，添加苹果粗多糖质量2%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶装解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，收集沉淀并干燥，获得分子量为3000~500000的苹果低聚糖；

步骤5）步骤4）中的苹果低聚糖用水溶解，添加苹果低聚糖质量1%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，通过SephadexG-200装填充柱，柱长10~200cm，柱内径为5~50cm，以0.1~0.5当量的氯化钠溶液洗脱，分段收集，获得分子量为500~3000的苹果寡糖。

本发明的有益效果：本发明的一种调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖，将其制备成药物制剂或应用于保健品、特殊用途食品及普通食品，人服用后能够有效的预防或治疗肠道菌群紊乱及便秘，或者因肠道菌群紊乱及便秘带来的肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌等。且苹果多糖来源于苹果或苹果渣，如果使用苹果渣提取苹果多糖（低聚糖、寡糖），一方面绿色环保，另一方面没有副作用，并克服了直接服用苹果所带来的高糖、引起龋齿的副作用，同时克服了现有的来源于牛乳的低聚糖所带来的腹泻等产品的缺陷。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但它们不对本发明构成限定。

图1、图2为苹果多糖对高脂饲料导致肠道菌群紊乱的调节作用。

图3、图4为苹果寡糖对高脂饲料导致肠道菌群紊乱的调节作用。

图5、图6为苹果低聚糖对高脂饲料导致肠道菌群紊乱的调节作用。

具体实施方式：

苹果多糖的制备和纯化 

实施例1  用于调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖的制备方法，包括如下步骤：

步骤1）取新鲜苹果榨汁后的苹果渣，用体积比为50%~100%的酒精浸泡3~30天，料液比为3:1，单位g/L；

步骤2）步骤1）中的浸提液采用回流塔浓缩，收集回流液；苹果渣采用无水乙醇回流3~7次，料液比为4:1，单位g/L，每次2~8h，收集上清液；残渣晾干至完全干燥，再用自来水或纯净水回流3~4次，料液比为4:1，单位g/L，每次3~8小时，收集并合并三次收集的回流液；

步骤3）回流液采用回流塔浓缩，获得浓缩液即苹果多糖提取液；苹果多糖提取液用体积比为70~85%的乙醇沉淀，收集沉淀并干燥，得到苹果多糖；

步骤4）步骤3）中的苹果粗多糖用水溶解，添加苹果粗多糖质量2%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，收集沉淀并干燥，获得分子量为3000~500000的苹果低聚糖；

步骤5）步骤4）中的苹果低聚糖用水溶解，添加苹果低聚糖质量1%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，通过SephadexG-200装填充柱，柱长10~200cm，柱内径为5~50cm，以0.1~0.5当量的氯化钠溶液洗脱，分段收集，获得分子量为500~3000的苹果寡糖。

步骤1）中，苹果渣为新鲜苹果榨汁后的果渣，可以采用苹果汁生产企业榨汁后的副产物苹果渣作为提取原料，来源稳定且提高了苹果渣的附加产值。

步骤2）中沉淀采用无水乙醇回流3次，或4次，或5次，或6次，或7次，料液比为4:1，单位g/L，每次2h，或3h，或4h，或5h，或6h，或7h，或8h，上清液浓缩收集待用。残渣晾干后，用纯净水回流3次，或4次，每次3h，或4h，或5h，或6h，或7h，或8h，上清液浓缩收集。作为一种优选，沉淀采用无水乙醇回流3次，料液比为4:1，单位g/L，每次3h，上清液浓缩收集待用。残渣晾干后，用纯净水回流3次，每次3h，上清液浓缩收集。

步骤3）中采用体积分数70%，或75%，或80%，或85%的乙醇沉淀，收集沉淀并干燥，作为一种优选，采用体积分数80%的乙醇沉淀3次，收集沉淀，冷冻干燥，得到苹果多糖。

步骤4）步骤3）中的苹果粗多糖用水溶解，作为一种优选，步骤3）中的苹果粗多糖用水恰好溶解，作为另一种优选，步骤3）中的每一质量份的苹果粗多糖用1~10质量份的水溶解。

添加半乳糖苷酶，添加量为苹果粗多糖质量为2%，或3%，或4%，或5%，或6%，或7%，或8%，或9%，或10%，温度为25℃，，或30℃，或35℃，或40℃，或45℃，或50℃，孵育30min，或1h，或1.5h，或2h，或2.5h，或3h，或3.5h，或4h，浓缩，采用体积分数70%，或75%，或80%，或85%的乙醇沉淀，沉淀次数为1次，或2次，或3次，或4次，或5次，获得3000~500000分子量的低聚糖，为苹果低聚糖。

作为一种优选，步骤3）中获得的苹果多糖，采用半乳糖苷酶，添加量为5.5%，40℃，孵育1h，浓缩，采用体积分数80%的乙醇沉淀3次，获得3000~500000分子量的低聚糖，为苹果低聚糖。

步骤5）步骤4）中获得的苹果低聚糖用水溶解，作为一种优选，步骤3）中的苹果粗多糖用水恰好溶解，作为另一种优选，步骤3）中的每一质量份的苹果低聚糖用1~10质量份的水溶解。

添加半乳糖苷酶，添加量为苹果低聚糖质量为1%，或2%，或3%，或4%，或5%，或6%，或7%，或8%，或9%，或10%，温度为25℃，或30℃，或35℃，或40℃，或45℃，或50℃，孵育30min，或1h，或1.5h，或2h，或2.5h，或3h，或3.5h，或4h，浓缩，采用体积分数70%，或75%，或80%，或85%的乙醇沉淀，沉淀次数为1次，或2次，或3次，或4次，或5次。作为一种优选，添加量为6.5%，40℃，孵育1h，浓缩，采用体积分数80%的乙醇沉淀3次。

通过SephadexG-200（Pharmacia）装填充柱，柱长10cm，或50cm，或100cm，或150cm，或200cm，柱内径为5 cm，或10 cm，或20 cm，或30 cm，或40 cm，或50cm，以0.1当量，或0.2当量，或0.3当量，或0.4当量，或0.5当量的氯化钠溶液洗脱，分段收集，获得分子量为500~3000的苹果寡糖。

步骤4）与步骤5）中，半乳糖苷酶可以为sigma，Amresco生产的β-半乳糖苷酶，级别为BR，分子量100～850KDa，活力为250～600单位，活力定义为在37℃、pH7.3的条件下，一个酶活力单位是指每分钟可转化1微摩尔底物的半乳糖苷酶量。

应用实施例 

实施例2

苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，所述苹果多糖及其制剂在预防或调节肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌治疗的药品中的应用。

所述苹果多糖制成胶囊剂、或片剂、或颗粒剂、或口服液、或散剂；所述苹果多糖单独使用或与其他成分配合使用，与其他成分配合使用时配方中苹果多糖质量含量为50~90%。

所述苹果多糖为多糖、低聚糖、寡糖中的一种或多种的混合物。

所述的肠道菌群紊乱是指肠腔内菌群的益生菌与有害菌比例失调而导致的结肠功能紊乱，所述的肥胖是由于饮食导致肠道菌群紊乱所导致的肥胖，所述的胰岛素抵抗是肠道菌群紊乱所导致的胰岛素抵抗。

所述的润肠通便指防治大便干燥，促进肠蠕动，防治便秘；所述的调节肠道菌群是指调节肠道益生菌的丰度，降低有害菌的丰度，调节二者的丰度比例。

本实施例中，所述的胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、散剂为本领域常规所述的含有苹果多糖（寡糖、低聚糖）的相关剂型，市售可得或按照本领域常规方法由苹果多糖（寡糖、低聚糖）原料提取获得。

本实施例中含有苹果多糖（寡糖、低聚糖）的胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、散剂还可以含有本领域常规胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、散剂中常规添加的各种其他添加剂和其他活性物质，只要其没有拮抗作用或不显著影响本发明效果即可。

本发明中含有苹果多糖（寡糖、低聚糖）的胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、散剂可按本领域常规方法制得。

较佳的片剂制备方法包括如下步骤：将苹果多糖（寡糖、低聚糖）与质量分数10%玉米淀粉浆、硬脂酸镁制成片剂。

较佳的胶囊剂制备方法包括如下步骤：将苹果多糖（寡糖、低聚糖）直接转入囊壳制成胶囊剂。

较佳的颗粒剂制备方法包括如下步骤：将苹果多糖（寡糖、低聚糖）加入糊精、乙醇，制成颗粒剂。

较佳的口服液制备方法包括如下步骤：将苹果多糖（寡糖、低聚糖）溶于水，加入水果味调味剂，制成口服液。

其中，所述的苹果多糖（寡糖、低聚糖）及其制剂的制备使用设备为本领域常规设备。

实施例3  苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，所述苹果多糖及其制剂在预防或调节肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌治疗的保健品、特殊用途食品、普通食品中的应用，所述苹果多糖的添加量为质量分数50~90%。

本实施例中，所述食品包括特殊用途食品及普通食品，其中特殊用途食品是指为满足某些人群的生理需要或某些疾病患者的需要，按特殊配方而专门加工的食品，这类食品的成分必须与现有类似性质的普通食品的成分有显著不同；普通食品是指非特殊用途食品。

所述苹果多糖为多糖、低聚糖、寡糖中的一种或多种的混合物。

所述的肠道菌群紊乱是指肠腔内菌群的益生菌与有害菌比例失调而导致的结肠功能紊乱，所述的肥胖是肠道菌群紊乱所导致的肥胖，所述的胰岛素抵抗是肠道菌群紊乱所导致的胰岛素抵抗。

所述的润肠通便指防治大便干燥，促进肠蠕动，防治便秘；所述的调节肠道菌群是指调节肠道益生菌的丰度，降低有害菌的丰度，调节二者的丰度比例。

本实施例中，所述的含有苹果多糖（寡糖、低聚糖）的食品为本领域常规所述的食品，市售可得或按照本领域常规方法由苹果多糖（寡糖、低聚糖）原料提取获得。所述在普通食品中的应用可以为含有苹果多糖（寡糖、低聚糖）的饼干、糖果、酸奶、面包等，其配方包括50~90%的多糖（低聚糖、寡糖），采用常规方法制备的饼干、糖果、酸奶、面包等等。

效果实施例 

实施例4 昆明鼠100只，随机分为10组，分别为生理盐水组，苹果多糖高中低剂量组，苹果低聚糖高中低剂量组，苹果寡糖高中低剂量组。经口灌胃给药，每天1次，连续7天，末次给药后，将小鼠全部移入代谢笼中，经口灌胃给予印度墨汁，6h后，收集粪便称重；解剖动物，量取墨汁推进长度，计算墨汁推进率。结果见表1。

表1  苹果多糖（寡糖、低聚糖）对小鼠小肠运动的推动作用

组 别	动物数	墨汁推进率(%)	6h粪便重量(mg)
				生理盐水	12	35.5±7.6	70.2±23.6
苹果多糖（1000mg/kg）	12	48.4±6.3	92.3±31.6
				苹果多糖 （2000mg/kg）	12	54.5±5.1*	107.6±46.8
苹果多糖（3000mg/kg）	12	61.8±7.3**	114.5±34.2*
				苹果低聚糖（200mg/kg）	12	56.8±6.4*	102.4±30.9
苹果低聚糖（600mg/kg）	12	63.5±5.9**	114.8±24.7*
				苹果低聚糖（1800mg/kg）	12	66.9±7.9**	121.6±32.5*
苹果寡糖（100mg/kg）	12	58.9±6.8*	106.5±23.8
				苹果寡糖（400mg/kg）	12	63.6±4.7**	113.7±31.3*
苹果寡糖（800mg/kg）	12	68.9±7.4**	121.9±25.7*

*P<0.05, **P<0.01 vs 生理盐水

结果表明，苹果多糖、低聚糖、寡糖均可显著提高墨汁推进率，6h粪便总重量显著高于盐水对照组，说明苹果多糖、低聚糖、寡糖均具有显著的通便作用。

实施例5 将苹果多糖，分别与大鼠饲料以2.5%，5%，10%浓度混合，做成大鼠饲料。SD大鼠40只，随机分为5组，分别为生理盐水组，高脂饲料组，苹果多糖2.5%，5%，10%（质量含量）剂量组。除生理盐水组大鼠外，其余鼠经口灌胃给予高脂饲料，每天1次，连续15天，通过聚合酶链式反应（PCR）技术检测粪便菌群丰度，当硬壁菌门:拟杆菌门的比例大于1:1时，提示菌群开始失调，大鼠饲料更换为含有苹果多糖的饲料，饲喂大鼠14天后，收集粪便，PCR测定细菌丰都。结果如图1、图2所示。图1显示了 苹果多糖(AP)对肠道菌群紊乱的调节作用，图2显示了苹果多糖(AP)对肠道菌群中拟杆菌属、梭杆菌属和乳杆菌属的影响。

由图1、图2可见，高脂饲料组大鼠粪便硬壁菌门丰度显著升高，拟杆菌门丰度明显减小，而与结肠癌发病密切相关的梭杆菌属丰度显著升高，益生菌丰都明显减少，给予苹果多糖的大鼠粪便中硬壁菌门丰度显著下降，梭杆菌属丰度显著下降，益生菌丰都明显增加，显示出明显地改善肠道菌群失调的作用。

实施例6

将苹果寡糖分别与大鼠饲料以2%，4%，8%浓度混合，做成大鼠饲料。SD大鼠40只，随机分为5组，分别为生理盐水组，高脂饲料组，苹果寡糖2%，4%，8%（质量含量）剂量组。除生理盐水组大鼠外，其余鼠经口灌胃给予高脂饲料，每天1次，连续15天，通过PCR检测粪便菌群丰度，当硬壁菌门：拟杆菌门的比例大于1：1时，提示菌群开始失调，大鼠饲料更换为含有苹果寡糖的饲料，饲喂大鼠14天后，收集粪便，PCR测定细菌丰度。结果如图3、图4所示。其中图3为苹果低聚糖(LAP)对肠道菌群中硬壁菌门及拟杆菌门的影响，图4为苹果低聚糖(LAP)对肠道菌群中拟杆菌属、梭杆菌属和乳杆菌属的影响 

由图3、图4可见，高脂饲料组大鼠粪便硬壁菌门丰度显著升高，拟杆菌门丰度明显减小，而与结肠癌发病密切相关的梭杆菌属丰度显著升高，益生菌丰度明显减少，给予苹果寡糖的大鼠粪便中硬壁菌门丰度显著下降，梭杆菌属丰度显著下降，益生菌丰度明显增加，苹果寡糖呈现明显地改善肠道菌群失调的作用。

实施例7

将苹果低聚糖，分别与大鼠饲料以1.25%，2.5%，5%浓度混合，做成大鼠饲料。SD大鼠40只，随机分为5组，分别为生理盐水组，高脂饲料组，苹果低聚糖1.25%，2.5%，5%（质量含量）剂量组。除生理盐水组大鼠外，其余鼠经口灌胃给予高脂饲料，每天1次，连续15天，通过PCR检测粪便菌群丰度，当硬壁菌门：拟杆菌门的比例大于1：1时，提示菌群开始失调，大鼠饲料更换为含有苹果低聚糖的饲料，饲喂大鼠14天后，收集粪便，PCR测定细菌丰度。结果如图5、图6所示。图5为苹果寡糖(GOP)对肠道菌群中硬壁菌门及拟杆菌门的影响，图6为苹果寡糖(GOP)对肠道菌群中拟杆菌属、梭杆菌属和乳杆菌属的影响。

由图5、图6可见，高脂饲料组大鼠粪便硬壁菌门丰度显著升高，拟杆菌门丰度明显减小，而与结肠癌发病密切相关的梭杆菌属丰度显著升高，益生菌丰度明显减少，给予苹果低聚糖的大鼠粪便中硬壁菌门丰度显著下降，梭杆菌属丰度显著下降，益生菌丰度明显增加，苹果低聚糖明显地改善了肠道菌群失调的状态。

本实施例没有详细叙述的分属于本行业的公知常识或常用实验手段，这里不一一叙述。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行另外详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，其特征在于：所述苹果多糖及其制剂在预防或治疗肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌的药品中的应用。

2.如权利要求1所述的苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，其特征在于：所述苹果多糖制成胶囊剂、或片剂、或颗粒剂、或口服液、或散剂；所述苹果多糖单独使用或与其他成分配合使用，与其他成分配合使用时配方中苹果多糖质量含量为50~90%。

3.苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，其特征在于：所述苹果多糖及其制剂在预防或治疗肠道菌群紊乱所导致的便秘、肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠病、结肠癌的保健品及食品中的应用。

4.如权利要求3所述的苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，其特征在于：所述苹果多糖的添加量为质量分数50~90%。

5.如权利要求1~4中的任意之一所述的苹果多糖调节肠道菌群失调及润肠通便的用途，其特征在于：所述的肠道菌群紊乱是指肠腔内菌群的益生菌与有害菌比例失调而导致的结肠功能紊乱，所述的肥胖是由于饮食导致肠道菌群紊乱所导致的肥胖，所述的胰岛素抵抗是肠道菌群紊乱所导致的胰岛素抵抗。

6.如权利要求1~4中的任意之一所述的一种调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖，其特征在于：所述苹果多糖为多糖、低聚糖、寡糖中的一种或多种的混合物。

7.用于调节肠道菌群失调及润肠通便的苹果多糖的制备方法，依次包括如下步骤：

步骤1）取新鲜苹果榨汁后的苹果渣，用体积比为50%~100%的酒精浸泡3~30天，料液比为3:1，单位g/L；

步骤2）步骤1）中的浸提液采用回流塔浓缩，收集回流液；苹果渣采用无水乙醇回流3~7次，料液比为4:1，单位g/L，每次2~8h，收集上清液；残渣晾干至完全干燥，再用自来水或纯净水回流3~4次，料液比为4:1，单位g/L，每次3~8小时，收集并合并三次收集的回流液；

步骤3）回流液采用回流塔浓缩，获得浓缩液即苹果多糖提取液；苹果多糖提取液用体积比为70~85%的乙醇沉淀，收集沉淀并干燥，得到苹果粗多糖；

步骤4）步骤3）中的苹果粗多糖用水溶解，添加苹果粗多糖质量2%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，收集沉淀并干燥，获得分子量为3000~500000的苹果低聚糖；

步骤5）步骤4）中的苹果低聚糖用水溶解，添加苹果低聚糖质量1%~10%的半乳糖苷酶，25℃~50℃条件下孵育30min~4h，酶解液采用回流塔浓缩，浓缩液用体积比为70~85%的乙醇沉淀1~5次，通过SephadexG-200装填充柱，柱长10~200cm，柱内径为5~50cm，以0.1~0.5当量的氯化钠溶液洗脱，分段收集，获得分子量为500~3000的苹果寡糖。