CN104101663B - 用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，所述方法包括以下步骤：a.配制供试样品溶液：将待测样品用溶剂配制成供试样品溶液；b.检测：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以磷酸盐缓冲溶液和有机溶剂的混合液作为流动相A、以所述有机溶剂作为流动相B，采用梯度洗脱法，检测所述供试样品溶液，检测波长为200-220nm。使用本申请提供的高效液相色谱法检测依巴斯汀原料药成分的方法，能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出依巴斯汀原料药中有关物质。

Description

用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法

技术领域

本发明涉及化学领域，具体而言，涉及一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法。

背景技术

依巴斯汀(Ebastine)，化学名称为：1-[4-(1，1-二甲基乙基)苯基]-4-[4-(二苯基甲氧基)-1-哌啶基]-1-丁酮，是一组胺H1受体阻断剂，被广泛用于治疗荨麻疹，过敏性鼻炎，湿疹等治疗。

依巴斯汀原料药的成分是明确的，主要包含依巴斯汀及8种相关杂质，将这9种物质彻底的快速的分离十分重要。

现有的依巴斯汀有关物质高效液相分析方法有：

欧洲药典(EP8.0)，采用乙腈-磷酸-氢氧化钠溶液(pH5.0)等度洗脱，分析时间周期长达3个小时，主峰约110分钟出峰，且拖尾严重，测定很不方便，不利于实际推广应用；

国家药品标准方法，采用甲醇-醋酸铵缓冲液(pH3.9)为流动相，检测波长为254nm，但该波长下个别杂质无吸收，且杂质无法达到有效分离，不能准确检测杂质；

中国专利CN102095808所描述的方法采用三乙胺的磷酸盐缓冲溶液(pH6.5～10.8)为流动相，存在峰型钝且拖尾、杂质无法有效分离、优选的250nm波长下杂质不能完全被检测。

因此，需要对依巴斯汀有关物质分析方法进行改进，建立一个快速、有效的检测方法，以区分并检测出依巴斯汀原料药内的所有相关物质。

发明内容

本发明提供了一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，以解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，所述方法包括以下步骤：

a.配制供试样品溶液：将待测样品用溶剂配制成供试样品溶液；

b.检测：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以磷酸盐缓冲溶液和有机溶剂的混合液作为流动相A、以所述有机溶剂作为流动相B，采用梯度洗脱法，检测所述供试样品溶液，检测波长为200-220nm。

优选的，所述磷酸盐缓冲溶液由磷酸盐水溶液用磷酸调节pH值后加入适量十二烷基硫酸钠制成。

优选的，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和磷酸氢二铵的一种。

优选的，所述磷酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mol/L。

优选的，所述pH值为5.8～7.0，所述十二烷基硫酸钠的量为1.52～2.30g。

优选的，所述供试样品溶液的浓度为1.0～3.0mg/ml。

更为优选的，所述供试样品溶液的浓度为2.0mg/ml。

优选的，所述检测波长为210nm。

优选的，步骤a中所述溶剂为乙腈水溶液，其比例为乙腈：水＝75:25；步骤b中所述有机溶剂为乙腈或甲醇。

优选的，所述步骤b中检测的流速的范围为0.9～1.1ml/min，柱温的范围为35～40℃，进样量为10μl。

使用本申请提供的一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，能够带来以下有益效果：

第一，缩短检测分析的周期，节约检测的时间；第二，能够有效分离杂质，检测出峰无拖尾，检测准确度高；第三，操作简便，适于实际应用和推广。

附图说明

图1示出了本申请实施例1提供的检测结果的HPLC图谱；

图2示出了本申请实施例2提供的检测结果的HPLC图谱；

图3示出了本申请实施例3提供的检测结果的HPLC图谱；

图4示出了本申请实施例4提供的检测结果的HPLC图谱；

图5示出了本申请实施例5提供的检测结果的HPLC图谱；

图6示出了本申请实施例6提供的检测结果的HPLC图谱；

图7示出了本申请实施例7提供的检测结果的HPLC图谱；

图8示出了本申请实施例8提供的检测结果的HPLC图谱；

图9示出了本申请实施例9提供的检测结果的HPLC图谱；

图10示出了本申请实施例10提供的检测结果的HPLC图谱；

图11示出了本申请实施例11提供的检测结果的HPLC图谱；

图12示出了本申请实施例12提供的检测结果的HPLC图谱；

图13示出了本申请实施例13提供的检测结果的HPLC图谱；

图14示出了本申请实施例14提供的检测结果的HPLC图谱；

图15示出了本申请比较例1提供的检测结果的HPLC图谱；

图16示出了本申请比较例2提供的检测结果的HPLC图谱；

图17示出了本申请比较例3提供的检测结果的HPLC图谱；

图18示出了本申请比较例4提供的检测结果的HPLC图谱；

图19示出了本申请比较例5提供的检测结果的HPLC图谱；

图20示出了本申请实施例15提供的检测结果的HPLC图谱；

图21示出了本申请磷酸盐缓冲溶液中未加入十二烷基硫酸钠的检测结果的HPLC图谱；

图22示出了本申请磷酸盐缓冲溶液中加入十二烷基硫酸钠的检测结果的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请，而非对本申请的限定。

本发明的目的是探索依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析的各种条件，提供一个简便、可靠的依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析方法。

本发明立足于高效液相色谱分析方法，发明并采用本领域内技术人员意料不到的流动相、添加物和色谱柱等条件，针对现有技术存在的分离不彻底、峰形拖尾严重、检测时间长等缺点，采用新的缓冲液体系以及流动相比例，使杂质能够完全分离，解决了现有技术的相关问题；且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，其验证结果均在可接受范围；本发明同现药典、标准及文献方法进行专属性、灵敏度等对比研究，证明其方法更能有效地控制本品有关物质。

本申请提供一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，所述方法包括以下步骤：

a.配制供试样品溶液：将待测样品用溶剂配制成供试样品溶液；

b.检测：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以磷酸盐缓冲溶液和有机溶剂的混合液作为流动相A、以所述有机溶剂作为流动相B，采用梯度洗脱法，检测所述供试样品溶液，检测波长为200-220nm。

本发明采用不同于现有技术的色谱柱填料、缓冲溶液、流动相以及不同的梯度洗脱，有效解决分离不彻底、检测时间长、峰形拖尾等技术问题；本发明提供的方法，能够使得依巴斯汀原料药中的相关物质完全分离，检测时间短，峰形较好。

优选的，所述磷酸盐缓冲溶液由磷酸盐水溶液用磷酸调节pH值后加入适量十二烷基硫酸钠制成。

本发明优选磷酸盐水溶液作为缓冲溶液且使用磷酸调节pH值。在缓冲溶液中加入十二烷基硫酸钠，对于保证各个检测物质有效分离具有重要的意义。

优选的，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和磷酸氢二铵的一种。

优选的，所述磷酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mol/L。

优选的，所述pH值为5.8～7.0，所述十二烷基硫酸钠的量为1.52～2.30g。

优选的，所述供试样品溶液的浓度为1.0～3.0mg/ml。

更为优选的，所述供试样品溶液的浓度为2.0mg/ml。

优选的，所述检测波长为210nm。

优选的，步骤a中所述溶剂为乙腈水溶液，其比例为乙腈：水＝75:25；步骤b中所述有机溶剂为乙腈或甲醇。

优选的，所述步骤b中检测的流速的范围为0.9～1.1ml/min，柱温的范围为35～40℃，进样量为10μl。

下述依巴斯汀原料药(所述本品)是指发明人按照国家药品食品监督管理局注册批准生产的符合国家标准的药物，本品符合国家药品标准WS1-(X-008)-2013Z和欧洲药典EP8.0标准。

以下实施例和比较例中使用的实验仪器均为安捷伦高效液相色谱仪；

除注明外，使用的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18100×4.6mm，3.5μm；柱温为40℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；溶剂：乙腈-水(75：25)。

除注明外，梯度洗脱按照下表1进行线性洗脱，表中流动相A为磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合液，流动相B为乙腈。在其他的实施例中，梯度洗脱方案是可以变化的。

表1梯度洗脱方案

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	48	52
9	67	33
			16	75	25
50	75	25

所有图中，各杂质代码代表的杂质名称见下表2。

表2杂质代码和名称(参考欧洲药典EP8.0)

实施例1

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈＝80：20，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；按照表1进行线性梯度洗脱。

供试样品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试样品溶液；精密量取供试样品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

检测结果如图1所示。图1中，依巴斯汀原料药中的8种杂质和依巴斯汀均完全分离，峰形齐整不拖尾，检测时间少于20min，证明本申请提供的方法，检测效果好、速度快，完全符合实际需要。

实施例2-3

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液[取(实施例2-磷酸氢二钾2.28g)、(实施例3-磷酸氢二铵1.32g)，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀]-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

实施例2结果见附图2；实施例3结果见附图3。通过图2、图3可以看出，本申请提供的不同的磷酸盐缓冲溶液，均能够满足检测需要，分离效果好、速度快。

实施例4-5

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(实施例4取十二水合磷酸氢二钠1.79g、实施例5取十二水合磷酸氢二钠17.9g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

实施例4结果见附图4；实施例5结果见附图5。图4、图5可以看出，同种缓冲溶液不同浓度条件下对检测的影响，同时也证明在本申请优选的缓冲溶液浓度范围内，均能满足检测需要。

在其他的可选的实施方式中，磷酸盐缓冲溶液的浓度是可以变化的。其浓度在0.005～0.05mol/L范围内，如0.01mol/L，均可对依巴斯汀原料药中有关物质进行有效分离。

实施例6-7

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至5.8(实施例6)、7.0(实施例7)，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

实施例6结果见附图6(缓冲液pH＝5.8)；实施例7结果见附图7(缓冲液pH＝7.0)。

在其他的可选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的pH值是可以变化的，本申请优选为5.8-7.0，在本范围内，如6.0、6.5等均可满足检测需要。

实施例8-9

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.52g(实施例8)、2.30g(实施例9)，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

实施例8结果见附图8(十二烷基硫酸钠1.52g)；实施例9结果见附图9(十二烷基硫酸钠2.30g)。

十二烷基硫酸钠的加入，主要是为了提高各个物质的分离度，保证各个物质有效分离。其加入量优选为1.52g-2.30g，在其他的实施方式中，可依据具体情况进行变化，如加入2.00g等。

实施例10-11

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：0.9ml/min(实施例10)、1.1ml/min(实施例11)；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

实施例10结果见附图10(流速：0.9ml/min)；实施例11结果见附图11(流速：1.1ml/min)。

流速一方面会对检测时间产生影响，另一方面也会对分离效果产生影响。本申请优选的流速为0.9-1.1ml/min，在其他的实施例中，流速也可选为1.0ml/min，或其他的合适的流速值。

实施例12

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

结果见附图12(柱温：35℃)。

参照实施例1-12所对应的附图1-12可发现，本方法能够快速有效分离依巴斯汀相关物质，检测峰拖尾少，分离效果好。

实施例13-14

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-乙腈(80：20)，流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min；以表1所列进行线性梯度洗脱。

供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品适量，精密称定，加溶剂逐步稀释至合适浓度定量限(S/N≥10)(实施例13)、检测限(S/N≥3)(实施例14)，摇匀，即得。进样并记录色谱图。

实施例13结果见附图13(杂质A、B、C、D、E、F、G、H、依巴斯汀的定量限)；实施例14结果见附图14(杂质A、B、C、D、E、F、G、H、依巴斯汀的检测限)。

其具体结果见下表3。

表3原料药依巴斯汀中的杂质定量限、检测限结果

由图13、14及表3中结果可知，本申请提供的方法，其专属性和灵敏度均在可接受的范围之内。

比较例1-2

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-CN 4.6×4.6mm，5μ，检测波长210nm

流动相：磷酸盐缓冲液(1.1g/L磷酸水溶液，40g/L氢氧化钠溶液调pH到5.0)-乙腈(35:65)，调乙腈比例(30％V/V～40％V/V)使依巴斯汀保留时间约在110min。

供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品适量，精密称定，加溶剂逐步稀释至合适浓度定量限(S/N≥10)(比较例1)、检测限(S/N≥3)(比较例2)，摇匀，即得。进样并记录色谱图。

比较例1结果见附图15[杂质A、B、C、D、E、F、G、H、依巴斯汀的定量限(欧洲药典方法)]；比较例2结果见附图16[杂质A、B、C、D、E、F、G、H、依巴斯汀的检测限(欧洲药典方法)]。

欧洲药典方法原料药依巴斯汀中的杂质定量限、检测限结果具体见下表4：

表4欧洲药典方法原料药依巴斯汀中的杂质定量限、检测限结果

实施例13与比较例1对比，实施例14与比较例2对比，可以发现：EP标准的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的定量限浓度较低，灵敏度较高，但杂质E、杂质F和依巴斯汀的定量限较高，灵敏度较低；本发明方法中，杂质E、杂质F和依巴斯汀的定量限浓度较低，灵敏度较高。检测限和定量限均满足有关物质检测要求。

比较例3

依巴斯汀有关物质测定(欧洲药典EP8.0版)

色谱条件：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-CN 4.6×4.6mm，5μ，检测波长210nm

流动相：磷酸盐缓冲液(1.1g/L磷酸水溶液，40g/L氢氧化钠溶液调pH到5.0)-乙腈(35:65)，调乙腈比例(30％V/V～40％V/V)使依巴斯汀保留时间约在110min。

供试品溶液配制：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液。

结果见附图17，由色谱图可知依巴斯汀的保留时间是115min，根据色谱收集时间要求(依巴斯汀保留时间的1.4倍)，整个采集时间为180min，为3个小时；依巴斯汀峰非常宽，拖尾严重(出峰时间跨度约为25min)。

比较例4

依巴斯汀有关物质测定(国家药品标准)

色谱条件：

色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ250mm×4.6mm 5μm；检测波长254nm

流动相：甲醇-0.1mol/L醋酸铵缓冲液(pH3.9)(醋酸铵3.85g与冰醋酸15ml，加水稀释至500ml)(75:25)。

供试品溶液配制：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.0mg的溶液，作为供试品溶液。

结果见附图18，在254nm检测波长下，杂质C和杂质D出峰时间重合，分离度<1.5，无法有效分离；杂质A和杂质C在254nm下几乎无吸收，无法准确检测。检测和分离效能均不能满足有关物质检查。

比较例5

依巴斯汀有关物质测定(CN专利)

色谱柱：Gemimi C18250mm×4.6mm 5μm；检测波长250nm

流动相：A:甲醇B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值至6.5)。

流速：1.0ml/min；以下表5进行线性梯度洗脱：

表5CN专利洗脱梯度方案

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	48	52
9	67	33
			16	75	25
50	75	25

供试品溶液配制：取本品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含依巴斯汀2.5μg的溶液，作为对照溶液。进样并记录色谱图。

结果见附图19，在250nm检测波长下，依巴斯汀主成分理论塔板数为277，对称因子为0.55，样品检测的准确度无法达到要求，杂质F与主成分峰分离度<1.5，无法有效分离；多个杂质在250nm下几乎无吸收，无法准确检测。检测和分离效能均不能满足有关物质检查。

本发明方法同欧洲药典方法及国家药品标准方法的测定结果对比如下表6所示：

表6对比结果

实施例15

色谱条件：流动相A为磷酸盐缓冲液(取十二水合磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至6.3，加入十二烷基硫酸钠1.92g，混匀)-甲醇(80：20)，流动相B为甲醇；流速：1.0ml/min；以下表7进行线性梯度洗脱：

表7实施例15的梯度洗脱表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	50	50
10	35	65
			15	20	80
30	20	80

其测试结果见图20所示。

如图20所示，因甲醇检测截止波长为230nm,本发明采用的检测波长优选为210nm,所以采用甲醇进行梯度洗脱时基线漂移较明显，故本发明优选乙腈配制流动相。

在其他条件均相同的情况下，本发明对于是否在磷酸盐缓冲溶液中加入十二烷基硫酸钠进行了研究，其结果如图21(未加入十二烷基硫酸钠)和图22所示(加入十二烷基硫酸钠)。

对照两图可发现，加入十二烷基硫酸钠，依巴斯汀保留时间较长，各杂质更能有效分离，适合本品检测。

采用本发明的原料药依巴斯汀有关物质的高效液相色谱分析方法，梯度洗脱，充分揭示了本品的杂质，提高产品的安全性，方法科学、可靠，可控本品有关物质。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用高效液相色谱法测定依巴斯汀有关物质的方法，所述方法包括以下步骤：

a.配制供试样品溶液：将待测样品用溶剂配制成供试样品溶液；

b.检测：以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合液作为流动相A、以乙腈作为流动相B，采用梯度洗脱法，检测所述供试样品溶液，检测波长为210nm；所述流动相A中磷酸盐缓冲溶液和乙腈的体积比为80:20；

所述磷酸盐缓冲溶液由磷酸盐水溶液用磷酸调节pH值后加入适量十二烷基硫酸钠制成；所述磷酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mol/L；所述pH值为5.8～7.0，所述十二烷基硫酸钠的量为1.52～2.30g/L；梯度条件为：

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 48 52 9 67 33 16 75 25 50 75 25

。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和磷酸氢二铵的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供试样品溶液的浓度为1.0～3.0mg/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述供试样品溶液的浓度为2.0mg/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a中所述溶剂为乙腈水溶液，其比例为乙腈：水＝75:25。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤b中检测的流速的范围为0.9～1.1ml/min，柱温的范围为35～40℃，进样量为10μl。