发明内容:
本发明的目的是探索依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析的各种条件,提供一种快速、简便、可靠、有效的依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析方法。
本发明人经过对高效液相色谱分析中色谱柱、流动相等条件进行筛选,选用合适的缓冲溶液体系,并在流动相中加三乙胺扫尾,在流动相的比例调节上,充分兼顾成品中数十个杂质(包括EP登载杂质)分离的需要,最终建立了弱碱性的HPLC梯度洗脱方法,将分析周期控制在60分钟内,能将数十个已知杂质与主峰基线分离,达到了上述发明目的。
本发明的技术方案如下:
依巴斯汀中有关物质的高效液相色谱分析方法,其特征为:
采用反相高效液相色谱法,色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶,采用有机溶剂和缓冲溶液为流动相,将待测样品用有机溶剂配制成2.0~3.0mg/ml的样品溶液,并采用梯度洗脱法洗脱;所述有机溶剂是甲醇或乙腈;所述缓冲溶液是三乙胺水溶液。
优选的检测条件是:所述三乙胺水溶液中三乙胺浓度为0.05%~1.0%(V/V),并用盐或酸调节至pH值为6.5~10.8,所述盐选自磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐、六氟磷酸钾中的一种或几种。所述酸选自磷酸、醋酸、甲酸中的一种或几种。
并可选用以下检测条件,样品检测波长:210~250nm,流速:0.8~1.3ml/min,柱温:15~35℃,进样量:10μl;
本发明方法与欧洲药典方法的测定结果对比如下:
指标 |
欧洲药典(EP6版)方法 |
本发明方法 |
依巴斯汀与杂质分离 |
仅能与7个杂质基线分离,且峰形差,严重拖尾(见图1) |
与潜在的10个杂质均能基线分离,峰形好(见图2) |
依巴斯汀液相保留时间 |
约120min(见图1) |
20~45min(见图2) |
液相色谱收集时间 |
约170min(欧洲药典规定收集时间为依巴斯汀保留时间的1.4倍) |
约60min(一般规定收集时间为主峰保留时间的2~3倍) |
流动相及样品配制 |
较复杂(见实施例1) |
简单方便(见实施例2) |
灵敏度 |
峰形拖尾,宽,灵敏度差,不利于有关物质测定(见实施例1) |
峰形好,灵敏度高,有利于有关物质测定(见实施例10) |
采用本发明的原料药依巴斯汀(4-二苯基甲氧基1-[3(对-叔丁基苯甲酰基)丙基]嘧啶)有关物质的高效液相色谱分析方法,其积极效果在于可以有效、快速、简单、可靠测定依巴斯汀所有的有关物质。
具体实施方式
以下实施例中使用的实验仪器均为岛津高效液相色谱仪(UV检测器);
除注明外,使用的色谱柱为Gemimi C18 4.6×150mm 5μm,柱温为25℃;进样量为10μl;流速为1.0ml/min
实施例1依巴斯汀有关物质测定——欧洲药典(EP6版)方法测定
色谱条件:
色谱柱:Agilent SB-CN 4.6×150mm 5μm,检测波长:210nm
流动相:乙腈∶磷酸(1.1g/L用40g/L氢氧化钠溶液调节pH值=5.0)=35∶65
供试品溶液配制:称取供试品约125.0mg,精密称定,置50ml量瓶中,加混合溶液[乙腈∶磷酸(1.1g/L用40g/L氢氧化钠溶液调节pH值=5.0)=65∶35]溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。(2.5mg/ml)
结果见附图1,由色谱图可知依巴斯汀的保留时间是120min,根据色谱收集时间要求(依巴斯汀保留时间的1.4倍),整个收集时间需要170min,约3个小时;依巴斯汀主峰严重拖尾,峰比较宽(25~30min)。
实施例2依巴斯汀有关物质测定(一)
色谱条件:检测波长:250nm、210nm,流动相:A:乙腈 B:0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.5),流速:1.2ml/min;梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
结果见:附图2(检测波长250nm)、附图3(检测波长210nm)。
实施例3依巴斯汀有关物质测定(二)
色谱条件:检测波长:250nm,流动相:A:甲醇,B:0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.8),流速:1.2ml/min,梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加甲醇逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。结果见附图4(流动相中有机相为甲醇)。
实施例4依巴斯汀有关物质测定(三)
色谱条件:色谱柱:Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm,检测波长:210nm,流动相:A:乙腈,B:0.02mol/lK2HP4水溶液(加0.3%三乙胺),0.02mol/LKF6P水溶液(加0.3%三乙胺),0.02mol/LCH3COONH4水溶液(加0.3%三乙胺),梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
50 |
50 |
15 |
74 |
26 |
50 |
74 |
26 |
50.01 |
50 |
50 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
结果见附图5(缓冲溶液,0.02mol/lK2HPO4水溶液)、附图6(缓冲溶液,0.02mol/LKF6P水溶液)、附图7(缓冲溶液,0.02mol/LCH3COONH4水溶液)。
实施例5依巴斯汀有关物质测定(四)
色谱条件:色谱柱:Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm(pH值=10.8),检测波长:250nm,流动相:A:乙腈,B:0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.5)、(磷酸调pH值=10.8),流速:1.2ml/min,梯度洗脱:
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
结果见附图8(缓冲溶液,磷酸调pH值=6.5)、附图9(缓冲溶液,磷酸调pH值=10.8)
实施例6依巴斯汀有关物质测定(五)
色谱条件:检测波长:250nm、流动相:A:乙腈,B:0.05%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.8),1.0%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.8),流速:1.2ml/min,梯度洗脱:
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
结果见附图10(缓冲溶液0.05%三乙胺溶液)、附图11(缓冲溶液1.0%三乙胺溶液)。
实施例7依巴斯汀有关物质测定(六)
色谱条件:检测波长:250nm、流动相:A:甲醇,B:0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.8),流速:0.8ml/min、1.3ml/min,梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加甲醇逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
结果见附图12(流速0.8ml/min)、附图13(流速1.3ml/min)。
实施例8依巴斯汀有关物质测定(七)
色谱条件:检测波长:250nm,流动相:A:乙腈,B:0.3%三乙胺溶液(磷酸调pH值=6.8),流速:1.2ml/min,柱温:15℃、35℃,梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
48 |
52 |
9 |
67 |
33 |
16 |
75 |
25 |
50 |
75 |
25 |
50.01 |
48 |
52 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
结果见附图14(柱温15℃)、附图15(柱温35℃)。
实施例9依巴斯汀有关物质测定(八)
色谱条件:色谱柱:Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm,检测波长:250nm,流动相:A:乙腈,B:0.02mol/l(NH4)2HPO4水溶液(加0.3%三乙胺),梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
50 |
50 |
15 |
74 |
26 |
50 |
74 |
26 |
50.01 |
50 |
50 |
供试品溶液配制:分别称取供试品约50.0mg、75.0mg,精密称定,置25ml量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得(2.0mg/ml、3.0mg/ml);对供试品溶液浓度进行考察。
结果见附图16(样品浓度2.0mg/ml),附图17(样品浓度3.0mg/ml)。
实施例10原料药依巴斯汀中潜在杂质定量限检测
色谱条件:色谱柱:Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm,测波长:210nm,流动相:A:乙腈,B:0.02mol/l(NH4)2HPO4水溶液(加0.3%三乙胺),梯度洗脱:
时间(分钟) |
A(%) |
B(%) |
0 |
50 |
50 |
15 |
74 |
26 |
50 |
74 |
26 |
50.01 |
50 |
50 |
供试品溶液配制:分别称取各杂质对照品,精密称定,加乙腈逐步稀释至合适溶度,摇匀,过滤,即得。进样并记录色谱图。
附图中杂质代码和名称
杂质代码 |
杂质名称 |
A |
二苯甲醇 |
B1a |
二苯甲基醚 |
B |
4-叔丁基苯乙酮 |
C |
4-(二苯甲氧基)哌啶 |
D |
1-(4-叔丁基苯)-4-(4-羟基哌啶)-丁酮 |
E |
4-(4-(二苯甲氧基)哌啶-1-基)-1-(4-叔戊基苯基)-丁酮 |
X2 |
1-(4-叔丁基苯)-4-氯丁酮 |
X2a |
1-(4-叔丁基苯)-4-羟基丁酮 |
F |
1-(4-叔丁基苯基)-4-(顺-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮 |
G |
1-(4-叔丁基苯基)-4-(反-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮 |
结果见附图18(A、C、B1a、的定量限)、附图19(B、D、E、X2、X2a、F、G的定量限)
原料药依巴斯汀中的潜在杂质的定量限结果见下表。
由于A、C、B1a三者与主峰响应值存在较大差异,我们在不改变色谱系统的前提下,增大待测样品的配制浓度,以提高检测灵敏度。样品浓度为20mg/ml。