CN104099404B - 用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1和2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ？ID？No.3所示。本发明进一步提供了检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法，其是以样品总DNA为模板，利用上述引物对和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。该方法可从被丁香疫霉侵染的发病植物组织中快速、准确地检测出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。

Description

用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法。
背景技术
丁香疫霉（Phytophthorasyringae(Klebahn)Klebahn）是我国重要的检疫性病菌，可以引起观赏植物、果树发生严重、具有毁灭性的病害。该病菌寄主范围广泛，主要危害14个科中的29个属，如：欧洲丁香（Syringavulgaris）、柑桔属的柠檬（Citruslimon）、脐橙（C.sinensis）、小茴香（Foeniculumvulgare）、苹果属的苹果（Maluspumila）、李属的甜樱桃（Prunusavium）、梨属的西洋梨（Pyruscommunis），火棘属(Pyracanthassp.)等，能引发根、茎、叶、果实上的多种病害。目前，在美洲、欧洲、亚洲、非洲的许多国家都有丁香疫霉病菌发生危害的报道。
因此开发丁香疫霉的早期快速检测技术，对相关植物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。
近年来，实时荧光定量PCR（荧光RT-PCR）技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，然而国内外鲜有利用荧光RT-PCR技术检测丁香疫霉方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针。
本发明的另一目的是提供用于检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测丁香疫霉的引物对，其包括上游引物PS-F：5’-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3’（SEQIDNo.1）和下游引物PS-R：5’-AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3’（SEQIDNo.2）。
本发明还提供含有上述引物对PS-F和PS-R的用于检测丁香疫霉的试剂盒。
本发明还提供一种用于检测丁香疫霉的探针，所述探针为：5’-F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'（SEQIDNo.3），其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。优选F1为FAM荧光染料，Q1为MGB。
本发明还提供一种检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法：以样品DNA为模板，采用引物对PS-F和PS-R以及上述探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
上述荧光RT-PCR扩增反应中，25μL的反应体系含有成分如下：样品DNA1μL(0.0005-50ng)，10×PCR反应缓冲液（不含Mg2+）2.5μL，25mMMgCL22.0μL，2.5mMdNTP2.0μL，10μM引物PS-F1μL，10μM引物PS-R1μL，10μM探针1.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL，ddH2O13.7μL。
荧光RT-PCR扩增反应过程中使用的退火温度为60℃。优选地，反应程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40个循环。
本发明还提供用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括引物对PS-F和PS-R以及上述探针。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明在测序分析丁香疫霉及其近似种和近缘种的ITS序列的基础上，分别设计用于检测丁香疫霉的引物对和荧光探针。该探针与普通的Taqman探针不同之处在于3'端采用了非荧光性的淬灭基因，即淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。
TaqmanMGB探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5’端，而3'端采用了非荧光性的淬灭基因，二者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于TaqDNA聚合酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对丁香疫霉的检测。
本发明根据丁香疫霉ITS序列，设计出可快速检测丁香疫霉病菌的特异性引物对和探针，并在此基础上建立了荧光RT-PCR检测法，可从发病植物组织中快速、准确地检测出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例4中采用荧光RT-PCR技术检测丁香疫霉的结果示意图，其中，1：丁香疫霉（Phytophthorasyringae，来源于美国）；2：丁香疫霉（P.syringae，来源于英国）；3-4：冬生疫霉（P.hibernalis）；5-7：雪松疫霉（P.lateralis）；8-9：栎树猝死病菌（P.ramorum）；10-11：苜蓿疫霉根腐病菌（P.medicaginis）；12-13：马铃薯绯腐疫霉（P.erythroseptica）；14-16：栗黑水疫霉（P.cambivora）；17-18：草莓疫霉（P.fragariae）；19-20：树霉疫霉（P.fragariaevar.rubi）；21：大豆疫霉（P.sojae）；22：棕榈疫霉（P.palmivora）；23：辣椒疫霉（P.capsici）；24：康沃尔疫霉（P.kernoviae）；25：空白对照。
图2是本发明实施例5中荧光RT-PCR检测方法的灵敏度实验结果示意图，其中，1-8的DNA浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL和0.000005ng/μL，9为空白对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（NewYork:GoldSpringHarborLaboratoryPress,1989），或Draper等（Blackwell科学出版社，1988），郑小波（疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1引物对及探针的设计与合成
根据丁香疫霉ITS序列，采用探针设计软件Express3.0设计引物对及探针，引物对序列为：
PS-F（正向引物）：5’-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3’
PS-R（反向引物）：5’-AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3’
探针的序列为：5’-F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'；其中，F1为FAM荧光染料，Q1为非荧光性的淬灭基团MGB。
上述引物对及探针序列合成由上海基康生物技术有限公司完成。实施例2样品总DNA的提取
采集适量丁香疫霉（Phytophthorasyringae）真菌菌丝体或染病果实、叶片，用赛默飞世尔植物直接提取试剂盒（ThermoPhireDirectPCRKit）提取DNA。
实施例3实时荧光定量PCR（荧光RT-PCR）法的建立
1、荧光RT-PCR反应体系
以总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系（总体积25μL）为：样品DNA1μL(0.0005-50ng)，10×PCR反应缓冲液（不含Mg2+）2.5μL，25mMMgCL22.0μL，2.5mMdNTP2.0μL，10μM引物PS-F1μL，10μM引物PS-R1μL，10μM探针1.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL，ddH2O13.7μL。
2、实时荧光PCR反应条件
将样品管放入BIO-RAD公司IQTM5荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：第1个循环为95℃3min;然后是95℃10s，60℃30s，40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。
实施例4丁香疫霉荧光RT-PCR检测法的特异性分析
以丁香疫霉的总DNA为模板，以丁香疫霉的近似种及近缘种的总DNA为对照，通过荧光RT-PCR检测荧光强度变化。
试验结果：
以丁香疫霉（Phytophthorasyringae）的总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而丁香疫霉的近似种及近缘种，如冬生疫霉（P.hibernalis）、雪松疫霉（P.lateralis）、栎树猝死病菌（P.ramorum）、苜蓿疫霉根腐病菌（P.medicaginis）、马铃薯绯腐疫霉（P.erythroseptica）、栗黑水疫霉（P.cambivora）、草莓疫霉（P.fragariae）、树霉疫霉（P.fragariaevar.rubi）、大豆疫霉（P.sojae）、棕榈疫霉（P.palmivora）、辣椒疫霉（P.capsici）、康沃尔疫霉（P.kernoviae）的荧光强度没有变化，检测结果如图1所示。
实施例5丁香疫霉荧光RT-PCR检测法的灵敏度分析
用超纯水分别稀释丁香疫霉的DNA，进行相对灵敏度检测，在25μL反应体系中，DNA分别为50ng/μL、5.0ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL和0.000005ng/μL。检测结果如图2所示，最低检测限为0.0005ng/μL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.用于检测丁香疫霉的引物对和探针，其特征在于，
上游引物PS-F：5’-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3’，
下游引物PS-R：5’-AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3’；
所述探针为：5’-F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'，其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，F1为FAM，Q1为MGB。
3.检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法，其特征在于，以样品DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对及探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
4.根据权利要求3所述的荧光RT-PCR法，其特征在于，25μL的反应体系含有成分如下：0.0005-50ng/μL样品DNA1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mMMgCL22.0μL，2.5mMdNTP2.0μL，10μM引物PS-F1μL，10μM引物PS-R1μL，10μM探针1.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL，ddH2O13.7μL；其中，所述PCR反应缓冲液中不含Mg2+。
5.根据权利要求3所述的荧光RT-PCR法，其特征在于，反应程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40个循环。
6.用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物对和探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
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