CN104072589A

CN104072589A - 抗肿瘤三硫化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104072589A
Application number: CN201310106792.6A
Authority: CN
Inventors: 白骅; 王继栋; 郑玲辉; 张辉; 姜南; 邓爱文; 陈华; 郑晓鹤; 金秀玲; 王玲萍
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: CN104072589B

Abstract

本发明公开了抗肿瘤三硫化合物HS1123A及其制备方法与应用。本发明所提供的抗肿瘤三硫化合物其结构式如式I所示。本发明提供的三硫化合物HS1123A，属于新结构三硫化合物，具有很强的抗肿瘤活性，适宜于制备抗肿瘤药物或作为抗肿瘤先导化合物。

Description

抗肿瘤三硫化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及制药领域。更具体的说，本发明涉及抗肿瘤三硫化合物及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，癌症发病率正在不断地上升，已成为严重危害人类健康的常见疾病，据统计，因病致死的人当中有21.75％死于癌症。根据美国癌症协会的一份“全球癌症现状及数据”报告，全球每天癌症死亡人数在20000左右。美国癌症协会预测，仅仅由于世界人口的增长及老龄化的加剧，到2050年，全球将会出现2700万新的癌症患者，同时死亡病例也将高达1750万。国内情况也基本如此，近20年间，恶性肿瘤在死亡中的构成比例已由12.6％升至17.9％，每年新发病人数约170万，有130余万人被癌症夺去生命。专家预计，2020年，死亡人数将超过400万。药物治疗是癌症的三大疗法之一，也是最主要的治疗手段，因此发现并研究具有高效、低毒的抗肿瘤药物至关重要。

在US4977138中公开了紫色杆菌(Chromobacterium sp.)能够发酵产生一种环肽类罗米地辛(romidepsin，FK228)。其结构中特有的二硫键是发挥活性的关键基团。由于稳定的疏水结构，romidepsin易透过肿瘤的细胞膜，在胞内其二硫键被谷胱甘肽还原成巯基发挥组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI)的作用。2004年美国FDA批准romidepsin作为孤儿药，用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)，商品名为istodax。目前，环肽类HDAC抑制剂已经成为抗肿瘤药物开发的一个重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种三硫化合物。

本发明所提供的三硫化合物HS1123A，其结构如式I所示：

式I。

本发明的另一个目的是提供所述三硫化合物的制备方法。

本发明所提供的所述三硫化合物的制备方法，包括如下步骤：

在液体培养基中发酵紫色杆菌(Chromobacterium sp.)HS-13-94，得到发酵液；

从所述发酵液中分离和纯化得到所述三硫化合物。

本发明所述液体培养基由以下成分组成：葡萄糖、可溶性淀粉、胰蛋白胨、磷酸二氢钠、缬氨酸和水；以上成分在所述液体培养基中的浓度分别为：1升培养基中含10-40g葡萄糖、10-20g可溶性淀粉、15-20g胰蛋白胨、1-5g磷酸二氢钠和0.5-1g缬氨酸，调pH6.8-7.2。

本发明涉及的紫色杆菌(Chromobacterium sp.)HS-13-94已于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保减号为CGMCC No.6247。

本发明所述分离和纯化的方法包括如下步骤：

(1).将所述发酵液离心后上清液或者发酵液直接进行以吸附树脂为吸附剂的吸附层析，用可溶解所述三硫化合物的溶液进行洗脱，得到含有上述三硫化合物的流份：

(2).将步骤(1)中得到的流份样品通过反相高效液相色谱法进行分离，即得到上述三硫化合物。

其中，在反相高效液相色谱法中使用充满了含18个碳原子的烯链的柱填料，并且使用的混合溶剂为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液，或者甲醇和乙腈混合有机溶剂的水溶液进行洗脱。最后得到三硫化合物HS1123A。所述吸附树脂型号为SP850和HP20ss。所述反相高效液相色谱法中采用的色谱柱是Agilent ZORBAX-XDB反相色谱柱，流动相为甲醇水溶液，检测波长210nn。

本发明的又一个目的是提供一种用于制备抗肿瘤药物的化合物。采用CCK-8法测得三硫化合物HS1123A对人结直肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MDA-MB231、人大细胞肺癌细胞NCI-H460具有非常强的抑制活性。

最后，本发明涉及治疗性组合物，该组合物由三硫化合物HS1123A以及一种或者多种常规载体和/或稀释剂组成。治疗的肿瘤包括直肠癌、乳腺癌或肺癌。

本发明提供的三硫化合物，其结构与上市药物romidepsin结构类似，是潜在的环肽类HDAC抑制剂，但其相对于romidepsin的关键双硫键变为了三硫键，因此，其又属于新型三硫化合物，而且其抗肿瘤活性与romidepsin相当(同为纳摩尔级)，适宜于制备抗肿瘤药物或作为抗肿瘤先导化合物。本发明所用的微生物发酵方法选择了能产生具有优异抗肿瘤活性三硫化合物的紫色杆菌(Chromobacterium sp.)HS-13-94，提取方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、红外光谱、质谱检测，其结构正确。

三硫化合物HS1123A的发酵、纯化、结构鉴定及活性实验见下面的具体实施例。以下实施例是对本发明的进一步说明但不限制本发明。

附图说明

图1为本发明所述三硫化合物HS1123A的高分辨质谱图。

图2为本发明所述三硫化合物HS1123A溶于DMSO-d₆中的¹H-NMR谱图。

图3为本发明所述三硫化合物溶于HS1123A溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。

图4为本发明所述三硫化合物HS1123A溶于DMSO-d₆中的DEPT135图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：发酵制备抗肿瘤三硫化合物HS1123A

1、种子培养

(1)将斜面培养基在121℃下灭菌20分钟，制成斜面。将紫色杆菌(Chromobacterium sp.)HS-13-94接种于斜面培养基，于37℃恒温培养3天，即得到斜面菌种。所述斜面培养基由以下成分组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L；所述斜面培养基的pH值为7.0。

(2)在多个1000ml玻璃瓶中分别装入200ml种子培养基，加棉塞，于121℃下灭菌30分钟，由斜面接种。于30℃在旋转摇床旋转培养(转速为250rpm)12小时，得到种子液。所述种子培养基由以下成分组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；所述种子培养基的pH值为7.0。

2、发酵培养

然后配制发酵培养基(培养基成份：4％葡萄糖、2％可溶性淀粉、2％蛋白胨、0.5％磷酸二氢钠、0.1％缬氨酸)。在50L的发酵罐中装30L发酵培养基，灭菌后按照3％(体积百分比)的接种量将种子培养步骤得到的种子液接种于发酵培养基，于30℃旋转培养(转速为100rpm，通气1000L/h)。2天后收获发酵液。发酵液为容器内的所有物质。

实施例2：三硫化合物HS1123A的分离纯化和结构鉴定

1、三硫化合物HS1123A的分离纯化

将上述实施例1得到的发酵液过滤，收集滤液。将上清液通过三菱SP850(购自日本三菱化工)吸附树脂吸附。先用水冲洗，再用25％的丙酮冲洗，最后用65％的丙酮洗脱并收集洗脱液，TLC检测，将所得具有TLC显色点的溶液合并，用自来水稀释至25％，然后再用三菱HP20ss(购自日本三菱化工)树脂吸附，用25％的丙酮冲洗，再用40％的丙酮冲洗，最后用50％的丙酮洗脱并收集洗脱液。将收集的洗脱液再用水稀释至25％，用乙酸乙酯萃取两次，并浓缩有机相，得到粗品。得到的粗品用反相高效液相色谱法制备(购自美国安捷伦)，AgilentZORBAX-XDB反相色谱柱(购自美国安捷伦)，9.4*250mm。甲醇∶水＝65∶35做流动相，收集13.4分钟的峰得到该三硫化合物。

2、三硫化合物HS1123A的结构鉴定

将上述得到的HS1123A进行鉴定，其理化性质如表1所示：

(1)外观：白色结晶形粉末。

(2)溶解性：易溶于甲醇，氯仿，丙酮，DMSO。

(3)旋光值：HS1123A的值分别为-84.6。测试仪器为Perkin-Elmer Model343polarimeter。采用钠光谱D线(589.3nm)测定，测定管长度1dm。溶剂为乙醇，浓度0.026g/100mL。

(4)紫外光谱：HS1123A乙醇溶液的紫外光谱在207nm处有最大吸收峰。紫外光谱测试仪器为Mariner System5304instrument。

(5)红外光谱：HS1123A红外光谱在3350，2962，2929，1734，1699，1669，1520，1507，1457，1258，1080cm^-1有特征吸收峰。

红外光谱测试仪器为Nicolet5700FT-IR Microscope spectrometer(FT-IRMicroscope Transmission)。

(6)质谱：图1是HS1123A的HRESIMS高分辨质谱图，显示其[M+Na]⁺峰为m/z595.1678；并提供HS1123A的最可能分子式为C₂₄H₃₆N₄O₆S₃。HRESIMS测试采用Bruker APEX III7.0T spectrometer。甲醇为溶剂。

(7)核磁共振谱：图2是HS1123A的1H-NMR谱图。图3是HS1123A的13C-NMR谱图，图4是HS1123A的DEPT135谱图。根据三硫化合物的1H-NMR，13C-NMR及DEPT135谱图，对该三硫化合物的核磁共振谱进行了研究并对13C信号进行了归属，见表2。并最终确定结构如式I所示：

(式I)

表1三硫化合物HS1123A的理化性质

表2HS1123A的¹³C和¹H NMR核磁信号归属(DMSO-d₆)

^3aDehydrobutyrine(脱氢丁氨酸)

实施例3：三硫化合物HS1123A的抗肿瘤活性

采用CCK-8法(文献1：Tominage H等.Anal Commun，36，第47-50页(1999)；文献2：Jidong Wang等.The Journal of Antibiotics，62，第483-487页(2009))测得三硫化合物HS1123A对人结直肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MDA-MB231、人大细胞肺癌细胞NCI-H460的抑制活性分别为3.0，5.0及4.0nM。

Claims

1.一种三硫化合物，其结构式如式I所示：

式I。

2.一种从微生物发酵液中分离和提纯如权利要求1所述三硫化合物的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)制备含有如权利要求1所述三硫化合物的发酵液；

(2)从上述发酵液中分离和纯化得到如权利要求1所述的三硫化合物。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，其中所述的含有如权利要求1所述三硫化合物的发酵液通过培养紫色杆菌(Chromobacterium sp.)HS-13-94得到。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述紫色杆菌(Chromobacteriumsp.)HS-13-94，其保藏号为CGMCC No.6247。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养中的培养基可选自葡萄糖、可溶性淀粉、胰蛋白胨、磷酸二氢钠、缬氨酸和水。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述分离和纯化的方法包括如下步骤：

(1).将所述发酵液离心后上清液或者发酵液直接进行以吸附树脂为吸附剂的吸附层析，用可溶解权利要求1所述三硫化合物的溶液进行洗脱，得到含有如权利要求1所述三硫化合物的流份；

(2).将步骤(1)中得到的流份样品通过反相高效液相色谱法进行分离，即得到权利要求1所述的三硫化合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述吸附树脂的型号为SP850、HP20ss。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述的反相高效液相色谱法使用充满了C18反相填料，并且使用混合溶剂进行层析，其中所述的混合溶剂为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液，或者甲醇和乙腈混合有机溶剂的水溶液。

9.一种用于抗肿瘤的药物，其含有权利要求1所述的三硫化合物作为活性成分。

10.如权利要求9所述的药物，其中的肿瘤为直肠癌、乳腺癌或肺癌。

11.一种药物组合物，包括权利要求1所示的三硫化合物与一种或者多种常规载体和/或稀释剂。

12.权利要求1的三硫化合物与权利要求11的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中的肿瘤为直肠癌、乳腺癌或肺癌。