CN102511484A - 一种微生物抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物抑制剂。本发明提供的微生物抑制剂，是从Citrobacter freundii(pCOM10)菌株、Citrobacter freundii(pCOMΔD)菌株或Duganella B2菌株中提取的具有不同化学结构的紫色杆菌素类物质(包括紫色杆菌素或紫色杆菌素衍生物)。本发明提供的三种提取物中有两种能够较强的抑制多种植物病原真菌和革兰氏阳性细菌。其中Citrobacter freundii(pCOM10)菌株的提取物能够对多种植物病原真菌抑制，在浓度为4mg/mL时对辣椒疫霉菌的抑制率达到100％。本发明将为利用紫色杆菌素及其衍生物开发农用抗生素奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物抑制剂。
背景技术
化学农药具有严重的污染性，长期使用对人类的身体健康造成安全隐患。生物农药不仅安全性高、选择性强，而且具有易降解及活性高的特点，受到全世界的广泛关注。研究者发现，微生物源农用抗生素已成为化学农药的重要替代物，从而成为各国研究者的研究热点。
紫色杆菌素是细菌以L-色氨酸为前体物合成的一种吲哚衍生物。紫色杆菌素生物合成途径已基本清楚。紫色杆菌素中所有的C、H、N原子都来自色氨酸分子。紫色杆菌素的整个合成途径中涉及到5个基因vioabcde，分布在同一转录单元。VioC、VioD两者都归属单加氧酶家族，依赖NAD(P)H，在合成途径的结尾部分起一定作用。VioC对脱氧紫色杆菌素前体、紫色杆菌素前体均起催化作用，体内一旦缺失，只能合成紫色杆菌素前体。VioD只对脱氧紫色杆菌素前体起作用，体内一旦缺失只能合成脱氧紫色杆菌素。
自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现它具有如下功能：
(1)广谱抗菌性
1945年Lichstein等用51株细菌(包括21个种)对紫色杆菌素粗提物进行抗菌实验，发现紫色杆菌对革兰氏阳性细菌有显著的抑制作用，对革兰氏阴性细菌有较小的抑制性。随后，1983年Duran等用纯化后的紫色杆菌素进行抗菌试验，纯的紫色杆菌素与紫色杆菌素+10％脱氧紫色杆菌素的混合物抗菌效果一样。紫色杆菌素还可以抑制植物真菌病原菌如Rosellinia necatrix，可以抑制桑树根腐病。在体外紫色杆菌素还具有抗分枝杆菌如Mycobacterium tuberculosis H37Ra的活性，其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为64μg/mL和128μg/mL，与对肺结核进行化学疗法中使用吡嗪酰胺(Pyrazinamide)的浓度相当。
(2)抗原生动物活性
紫色杆菌素具有杀锥虫和抗利什曼原虫(Leishmania)的活性。
(3)抗病毒性
紫色杆菌素和10％脱氧紫色杆菌素的混合物对侵染Hela细胞的单纯性疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)、脊髓灰质炎病毒(Polioviruses)有抵抗活性。
(4)抗肿瘤细胞
紫色杆菌素对成纤维细胞(V79)系有很高的细胞毒素活性。紫色杆菌素对白血病细胞(leukemia cells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、结肠以及由艾滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤都有很好的细胞毒性作用。
脱氧紫色杆菌素、氧化紫色杆菌素是紫色杆菌素的衍生物，生物合成过程中的副产物，产量低，目前对其生物功能尚未开展研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物抑制剂。
本发明提供的微生物抑制剂，包括式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。所述微生物抑制剂还可包括式(III)所示的氧化紫色杆菌素。
所述微生物抑制剂具体可包括式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素；式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素的质量比具体可为89.6∶10.4。
所述微生物抑制剂具体可包括式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素组成和式(III)所示的氧化紫色杆菌素；式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素的质量比具体可为12.7∶9.1∶78.2。
所述微生物抑制剂可为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)将Citrobacter freundii(pCOM10)菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(b)将(a)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物甲)；
(c)将杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；所述杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的保藏编号为CGMCC NO.2056；
(d)将(c)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物乙)。
所述(a)中的所述提取的方法具体如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，先-20℃冷冻30min，然后30℃振荡30min，最后12000g离心10min收集上清。所述振荡的参数优选为180r·min-1、振荡半径为16mm。
所述(c)中的所述提取的方法具体如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，然后在200W超声波条件下振荡1小时，最后9000×g离心5min收集上清。所述振荡的参数优选为30℃、180r·min-1、振荡半径为16mm。
所述微生物可为细菌和/或真菌。所述细菌为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种。所述真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
本发明还保护如下(I)或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在制备微生物抑制剂中的应用：
(I)将Citrobacter freundii(pCOM10)菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(II)将(I)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物甲)；
(III)将所述杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(IV)将(III)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物乙)；
(V)式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素；
(VI)式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
所述(I)中的所述提取的方法具体如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，先-20℃冷冻30min，然后30℃振荡30min，最后12000g离心10min收集上清。所述振荡的参数优选为180r·min-1、振荡半径为16mm。
所述(III)中的所述提取的方法具体如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，然后在200W超声波条件下振荡1小时，最后9000×g离心5min收集上清。所述振荡的参数优选为30℃、180r·min-1、振荡半径为16mm。
所述(V)中，式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素的质量比具体可为12.7∶9.1∶78.2。
所述(VI)中，式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素的质量比具体可为89.6∶10.4。
所述微生物可为细菌和/或真菌。所述细菌为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种。所述真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
本发明还保护所述(I)、所述(II)、所述(III)、所述(IV)、所述(V)或所述(VI)在抑制微生物中的应用。
所述微生物可为细菌和/或真菌。所述细菌为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种。所述真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
本发明还保护式(II)所示脱氧紫色杆菌素在制备微生物抑制剂中的应用。所述微生物可为细菌和/或真菌。所述细菌为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种。所述真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
本发明还保护所述将BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioΔD)菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液，或所述提取液真空干燥得到的粉末(提取物丙)，在制备微生物抑制剂中的应用。所述提取的方法具体如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，先-20℃冷冻30min，然后30℃振荡30min，最后12000g离心10min收集上清。所述振荡的参数优选为180r·min-1、振荡半径为16mm。所述微生物可为细菌和/或真菌。所述细菌为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种。所述真菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
本文分别将Citrobacter freundii(pCOM10)菌株、Duganella B2菌株和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioΔD)菌株发酵，通过无水乙醇提取和真空干燥后得到了三种不同的提取物，含有具有不同化学结构的紫色杆菌素类物质(包括紫色杆菌素或紫色杆菌素衍生物)。Citrobacter freundii(pCOM10)菌株得到的提取物为提取物甲。Duganella B2菌株得到的提取物为提取物乙。BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioΔD)菌株得到的提取物为提取物丙。
分别检测各个提取物对真菌和细菌的抑制作用。结果表明，三种胞内提取物对供试菌株有不同程度的生长抑制作用，抑菌活性由强到弱表现为：提取物甲(氧化紫色杆菌素+脱氧紫色杆菌素+紫色杆菌素)＞提取物乙(脱氧紫色杆菌素+紫色杆菌素)＞提取物丙(脱氧紫色杆菌素)，在供试菌株中，辣椒疫霉病原真菌对提取物甲最为敏感。提取物甲和提取物乙都能够较强的抑制多种植物病原真菌和革兰氏阳性细菌。提取物甲能够对多种植物病原真菌抑制，在浓度为4mg/mL时对辣椒疫霉菌的抑制率达到100％。
本发明将为下一步探讨紫色杆菌素衍生物对植物病原菌的抑制机理打下基础，最终为开发农用抗生素奠定基础。
附图说明
图1为提取物甲的HPLC色谱图。
图2为提取物甲第一个峰的洗脱液质谱图。
图3为提取物甲第二个峰的洗脱液质谱图。
图4为提取物甲第三个峰的洗脱液质谱图。
图5为提取物乙的HPLC色谱图。
图6为提取物丙的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。1ppm代表该溶质占溶液总质量的百万分之一。
杜檊氏菌(Duganella)B2菌株：CGMCC NO.2056(申请号200710120074，授权号101139564)；简称B2菌株；是合成紫色杆菌素的野生菌株，其基因组中含该色素合成的五个酶基因(VioA-VioB-VioC-VioD-VioE)。Citrobacter freundii(pCOM10)菌株：参考文献：Peixia Jiang，Haisheng Wang，Chong Zhang，Kai Lou，Xin-Hui Xing.Reconstruction of the Violacein Biosynthetic，Pathway from Duganella sp.B2in different Heterologous Hosts.Appl.Microbiol.Biotechnol，(2010)86(4)：1077-88；简称C.freundii(pCOM10)菌株；是含VioA-VioB-VioC-VioD-VioE基因簇的工程菌株，其紫色杆菌素产量高于B2菌株。BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioΔD)菌株(别名为“Pseudomonas putida-VioΔD”)：参考文献：王海胜《一株产蓝色素细菌的鉴定、色素的结构解析及其基因的克隆与表达》博士论文，2008中国农业科学院研究生院；是含VioA-VioB-VioC-VioE基因簇的工程菌株，产生脱氧紫色杆菌素。
实施例中用于抑菌谱测定所选用的供试菌株共有24株，其中植物病原真菌14株，细菌10株，均获自中国农业微生物菌种保藏管理中心。供试菌株见表1。
表1实施例中用于抑菌谱测定所选用的供试菌株
NA固体培养基(营养琼脂培养基)：由溶质和水组成；溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂14g/L。
实施例1、提取物甲、提取物乙和提取物丙的制备和分析
C.freundii(pCOM10)菌株、B2菌株和C.freundii(pCOMΔD)菌株三个菌株合成的紫色杆菌素类物质(包括紫色杆菌素或紫色杆菌素衍生物)均不分泌到胞外，所以紫色杆菌素类物质的提取均包括如下步骤：发酵、离心收获菌体，采用冻融法破碎菌体细胞壁而使色素释放出来。紫色杆菌素类物质具有不溶于水而易溶于有机溶剂的特性，乙醇是提取紫色杆菌素类物质的最佳溶剂，因此采用无水乙醇来提取破壁细胞中的紫色杆菌素类物质。
一、提取物甲的制备
液体发酵培养基是将如下溶质用水定容至100mL得到的：NaH2PO4·2H2O 0.13g、Na2HPO4·12H2O 0.3g、NH4Cl 0.089g、KH2PO4·3H2O 0.75g、MgSO4·7H2O 1g、glycerol0.3g、yeast extract 0.1g、5-羟基色氨酸0.04g；pH6.5。
1、种子液培养
从C.freundii(pCOM10)菌株的甘油保藏管中取10μL接入20mL LB液体培养基(含50μg·L-1卡那霉素)，振荡培养(37℃、200rpm·min-1、振荡半径为16mm)12h，得到OD660约为1.5的种子液。
2、诱导发酵
将步骤1的种子液按2％(体积比)的接种量接种于20mL液体发酵培养基，振荡培养(37℃、200rpm·min-1、振荡半径为16mm)5h后OD660约为1.2；然后加入正辛烷(诱导剂)使其浓度为375ppm，振荡培养(20℃、200r·min-1、振荡半径为16mm)35h；12000g离心10min收集菌体。
3、提取物甲的制备
①用蒸馏水悬浮漂洗步骤2的菌体三次，然后将菌体重悬于5mL无水乙醇中充分混匀；先置于-20℃冰箱中冷冻30min，然后振荡(30℃、180r·min-1、振荡半径为16mm)30min，最后12000g离心10min分别收集上清和菌体。
②将步骤①收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体。
③将步骤②收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体(此时菌体发白)。
④将步骤①收集的上清、步骤②收集的上清和步骤③收集的上清混合。
4、提取物甲的鉴定
(1)将步骤3的④得到的上清进行真空干燥，得到固体粉末(提取物甲)。
(2)提取物甲的组成分析(高效液相色谱-质谱-核磁共振)
①HPLC分析纯化
将步骤(1)的固体粉末用无水甲醇溶解，用孔径为0.22μm的有机滤膜过滤后装入HPLC专用盛样瓶，上样于色谱柱进行HPLC分析。
色谱柱为安捷伦HC-C18，基质为超纯硅胶(粒径为5μm)；流动相由7体积份甲醇和3体积份水组成；柱温为30℃；检测器为SPD，波长为570nm；流速为1mL·min-1，进样量10μL。
色谱图见图1，显示有三个峰(保留时间分别为2.4min、3.3min和4.8min)，即三个单一组分(按保留时间自短至长分别命名为组分1、组分2和组分3)，分别收集三个峰的洗脱液(第一个峰收集保留时间0.8-1.6min之间的洗脱液，第二个峰收集保留时间2.5-3.2min之间的洗脱液，第三个峰收集保留时间4.7-5.2min之间的洗脱液)。依据各个峰面积与总峰面积的比值来计算各个单一组分的含量(质量比)，组分1∶组分2∶组分3＝78.2∶12.7∶9.1。
②质谱分析
分别将三个峰的洗脱液进行质谱分析。质谱条件：离子源为电喷雾(ESI)离子源；电喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为300℃；鞘气为35arb；辅助气为0arb；流速为1mL/min；分流比9∶1；质谱速度为0.1mL/min。采用正离子全扫描(Full ScanMS)和二级质谱全扫描(FullScan MS2)方式同时检测，二次质谱碎裂能量为35％。
第一个峰的洗脱液质谱图见图2。结果表明，组分1的分子量为360.1，为式(III)所示的氧化紫色杆菌素。
第二个峰的洗脱液质谱图见图3。结果表明，组分2的分子量为344，为式(I)所示的紫色杆菌素。
第三个峰的质谱图见图3。组分3的分子量为328，为式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
③核磁共振分析
组分1、组分2和组分3分别按照文献(Nakamura Y，Sawada T，Morita Y，TamiyaE1Isolation of a psychrot rophic bacterium f rom t he organic residue of awater tank keeping rainbow t rout and antibacterial effect of violet pigmentproduced f rom t he st rain1 Biochemical Engineering J ournal，2002，12(1)：79-86)中描述的方法进行核磁共振分析，用JNM ECA2600核磁共振波谱仪，磁场强度为141096T，1H共振频率为600117MHz，溶剂为DMSO，在室温下进行数据采集。90°脉冲宽度为1113μs，采样点数为16384，扫描次数为16次，氘代试剂为d2DMSO。
组分1的结果见表2。
表2组分1的核磁氢谱化学位移值与文献数据的比对
已报道的氧化紫色杆菌素的氢原子的化学位移参见文献：HoshinoT，Ogasawara N.Studies on the biosynthesis of violacein.Part III.Biosynthesis of violacein：evidence for the intermediacy of 5-hydroxy-L-tryptophan and the structure ofa new pigment，oxyviolacein，produced by the metabolism of 5-hydroxytryptophan.Agricultural and Biological Chemistry.1990，54(9)：2339-2346。
结果表明，该组分的氢原子的化学位移与已报道的氧化紫色杆菌素的氢原子的化学位移基本一致。综合质谱及核磁共振分析结果，该组分为氧化紫色杆菌素。
组分2的结果见表3。
表3组分2的核磁氢谱化学位移值与文献数据的比对
已报道的紫色杆菌素的氢原子的化学位移参见文献：T.Hoshino，T.Kondo，T.Uchiyama，N.Ogasawara，Biosynthesis of violacein：a novel rearrangement intryptophan metabolism with a 1，2-shift of the indole，Agric.Biol.Chem.51(1987)965-968.。
结果表明，该组分的氢原子的化学位移与已报道的紫色杆菌素的氢原子的化学位移基本一致。综合质谱及核磁共振分析结果，该组分为紫色杆菌素。
组分3的结果见表4。
表4组分3的核磁氢谱化学位移值与文献数据的比对
已报道的脱氧紫色杆菌素的氢原子的化学位移参见文献：T.Hoshino，T.Kondo，T.Uchiyama，N.Ogasawara，Biosynthesis of violacein：a novel rearrangementin tryptophan metabolism with a 1，2-shift of the indole，Agric.Biol.Chem.51(1987)965-968.。
结果表明，该组分的氢原子的化学位移与已报道的脱氧紫色杆菌素的氢原子的化学位移基本一致。综合质谱及核磁共振分析结果，该组分为脱氧紫色杆菌素。
结果表明，提取物甲含有式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素。
二、提取物乙的制备
1、菌株培养
配制平板培养基：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂20g，加水到1000ml，调节pH 7.0。将平板培养基在121℃下灭菌15min，倒平板，冷却后接入B2菌株，在25℃下培养72小时。
配制种子液体培养基(每升含量)：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，调节pH7.0。从平板中挑取单个B2菌落接种于无菌的种子液体培养基中，振荡培养(25℃、200rpm·min-1、振荡半径为16mm)24小时，即为种子液。
配制发酵液体培养基：淀粉15g，硫酸亚铁0.03g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.5g，色氨酸0.6g加水到1000ml，pH为7.0。将100ml发酵液体培养基装入500ml培养瓶中灭菌，将10mL所述种子液接入灭菌后的发酵液体培养基，振荡培养(25℃、200rpm·min-1、振荡半径为16mm)50小时；将发酵液在7000×g下离心10min，收集沉淀物。
2、提取物乙的制备
①在沉淀物中加入无水乙醇(每100ml发酵液得到的沉淀物加入50ml乙醇)，用漩涡混合器混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡1小时(30℃、180r·min-1、振荡半径为16mm)，将振荡液9000×g离心5min，分别收集上清和菌体。
②将步骤①收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体。
③将步骤②收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体(此时菌体发白)。
④将步骤①收集的上清、步骤②收集的上清和步骤③收集的上清混合。
3、提取物乙的鉴定
(1)将步骤2的④得到的上清进行真空干燥，得到固体粉末(提取物乙)。
(2)提取物乙的组成分析(高效液相色谱-质谱-核磁共振)
①HPLC分析纯化
将步骤(1)的固体粉末用无水甲醇溶解，用孔径为0.22μm的有机滤膜过滤后装入HPLC专用盛样瓶，上样于色谱柱进行HPLC分析。
采用高效液相色谱(HPLC)(美国Waters公司，Waters 2695)，色谱柱为InertsilODS-35um 250×4.6mm(购于DIKMA公司)；PDA二极管阵列检测器(Waters 2996)，检测波长为575nm；流动相由7体积份甲醇和3体积份水组成；柱温为室温；每次进样量0.2mL，流速为1mL/min。
色谱图见图5，显示有两个峰(保留时间分别为3.3min和4.8min)，即两个单一组分(按保留时间自短至长分别命名为组分1和组分2)，分别收集两个峰的洗脱液(第一个峰收集保留时间2.5-3.2min之间的洗脱液，第二个峰收集保留时间4.7-5.2min之间的洗脱液)。依据各个峰面积与总峰面积的比值来计算各个单一组分的含量(质量比)，组分1∶组分2＝89.6∶10.4。
②质谱分析
分别将两个峰的洗脱液进行质谱分析。质谱条件：离子源为电喷雾(ESI)离子源；电喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为300℃；鞘气为35arb；辅助气为0arb；流速为1mL/min；分流比9∶1；质谱速度为0.1mL/min。采用正离子全扫描(Full ScanMS)和二级质谱全扫描(FullScan MS2)方式同时检测，二次质谱碎裂能量为35％。
第一个峰的洗脱液质谱分析结果表明，组分1的分子量为343.24，为式(I)所示的紫色杆菌素。
第二个峰的质谱图分析结果表明，组分2的分子量为328，为式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
结果表明，提取物乙含有式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
三、提取物丙的制备
1、诱导发酵
在LB 培养基(含0.4g/L L-色氨酸)中37℃培养BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioΔD)菌株其至浓度OD600为0.8，加入IPTG使其终浓度为1.0mmol/L，20℃诱导30h。
2、提取物丙的制备
①用蒸馏水悬浮漂洗步骤1的菌体三次，然后将菌体重悬于5mL无水乙醇中充分混匀；先置于-20℃冰箱中冷冻30min，然后振荡(30℃、180r·min-1、振荡半径为16mm)30min，最后12000g离心10min分别收集上清和菌体。
②将步骤①收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体。
③将步骤②收集的菌体再次进行步骤①相同的操作，分别收集上清和菌体(此时菌体发白)。
④将步骤①收集的上清、步骤②收集的上清和步骤③收集的上清混合，即为提取物丙。
3、提取物丙的鉴定
(1)将步骤2的④得到的上清进行真空干燥，得到固体粉末(提取物丙)。
(2)提取物丙的组成分析(高效液相色谱-质谱-核磁共振)
同步骤一的4的(2)。
色谱图见图6，显示有一个峰(保留时间为4.8min)，即一个单一组分，分别该峰的洗脱液(收集保留时间4.7-5.2min之间的洗脱液)。
该峰的质谱图分析结果表明，分子量为328，为式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
结果表明，提取物丙含有式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
实施例2、提取物甲、提取物乙和提取物丙对供试细菌的抑制作用
分别检测实施例1制备的紫色杆菌素类物质(提取物甲、提取物乙或提取物丙)对10株供试细菌的抑制作用，具体步骤如下：
1、含菌平板的制备
将100μL细菌菌液(OD600＝0.1)涂在含有NA固体培养基的平皿中，放置晾干即制成含菌平板。
2、紫色杆菌素类物质对供试细菌的抑制作用(无菌操作)
①分别将提取物甲、提取物乙和提取物丙溶于丙酮，使其浓度均为125μg/mL。
②将3组直径为5mm的无菌滤纸圆片(3片为1组)分别置于步骤①得到的三种溶液中浸泡12h，然后风干除去丙酮；将1组同样的无菌滤纸圆片于50％(体积比)丙酮水溶液中浸泡12h(CK对照)，然后风干除去丙酮；
③用无菌镊子取步骤②的滤纸圆片置于含菌平板上，每个平板放置3个滤纸片；平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h后测定抑菌圈大小，根据抑菌圈的有无或大小来确定紫色杆菌素的抑菌效果。
结果见表5。提取物甲、提取物乙及提取物丙对革兰氏阳性菌抑制效果较为明显，对革兰氏阴性菌抑制活性较差；提取物甲、提取物乙对阳性菌株抑制活性比脱氧紫色杆菌素略好。
表5提取物甲、提取物乙及提取物丙对供试细菌的抑制作用
第三列中的“-”代表小于2.0mm；第二列中的“+”代表革兰氏阳性，“-”代表革兰氏阴性。
3、不同浓度的紫色杆菌素类物质对敏感细菌的抑制作用(无菌操作)
①分别将提取物甲和提取物乙溶于丙酮，再加入等体积的水，用50％(体积比)丙酮水溶液稀释其浓度均为20mg/mL。
②将步骤①得到的两种溶液分别用50％(体积比)丙酮水溶液稀释成25μg/mL、50μg/mL、125μg/mL、250μg/mL的稀释液。
③将12组直径为5mm的无菌滤纸圆片(3片为1组)分别置于步骤②得到的八种溶液中浸泡12h，然后风干除去丙酮；将1组同样的无菌滤纸圆片于丙酮50％(体积比)丙酮水溶液中浸泡12h(CK对照)，然后风干除去丙酮；
④同步骤二的③。
提取物甲的结果见表6，提取物乙的结果见表7。
表6不同浓度的提取物甲对细菌抑制活性
表7不同浓度的提取物乙对细菌抑制活性
随着提取物浓度的增加，其抑制活性逐渐增加，提取物浓度在25μg/ml时，提取物甲、提取物乙对金黄色葡萄球菌金黄亚种抑制活性比对枯草芽胞杆菌和巨大芽孢杆菌抑制活性更高。
实施例3、提取物甲、提取物乙和提取物丙对供试真菌的抑制作用
一、紫色杆菌素类物质对供试真菌的抑制作用
分别检测实施例1制备的紫色杆菌素类物质(提取物甲、提取物乙或提取物丙)对24株供试真菌的抑制作用，具体步骤如下：
1、紫色杆菌素衍生物对病原真菌抑制敏感性的测定(无菌操作)
①分别将提取物甲、提取物乙和提取物丙溶于无菌的无水丙酮，再加入等体积的水，用50％丙酮水溶液稀释其浓度均为20mg/mL的母液。
②分别将步骤①的三种母液溶液添加至不同的灭菌后的平皿中，然后倒入熔化并冷却至45℃左右的PDA固体培养基，使提取物的终浓度为2mg/mL，混匀，放置晾干即制成检测平板；将等体积的无菌50％丙酮水溶液作为三种溶液的对照，即对照平板。
③对供试真菌的抑制作用(菌丝生长速率法)
在长满供试真菌的平板上用直径6mm的灭菌打孔器打取菌饼，将一个菌饼接种于检测平板(或对照平板)中央，每个供试真菌菌株接种3个平板作为重复实验；25℃光照培养，5d后用十字交叉法测量菌落生长直径；菌落扩展直径(mm)＝菌落直径平均值(mm)-菌饼直径(即6mm)，抑制率(％)＝(对照平板上的菌落扩展直径-检测平板上的菌落扩展直径)/对照平板上的菌落扩展直径×100％。
结果见表8。
表8提取物甲、提取物乙及提取物丙对供试真菌的抑制作用
提取物甲对多数真菌抑制作用较提取物乙和提取物丙强，抑制效果最明显。提取物甲对辣椒疫霉菌和大豆根腐病菌抑制率分别达到达91.8％和67.5％，对灰葡萄孢ACCC30387、立枯丝核菌、灰葡萄孢ACCC36448抑制率也达到50％以上。提取物乙对供试真菌的抑制作用次之，但对核盘菌ACCC36081、大豆根腐病菌、辣椒疫霉菌抑制率也大于50％。提取物丙除了对立枯丝核菌的抑制率达61.2％外，但对其他供试病原真菌抑制效果较差。
二、不同浓度的紫色杆菌素类物质对供试真菌的抑制作用
分别检测不同浓度的实施例1制备的紫色杆菌素类物质(提取物甲、提取物乙或提取物丙)对24株供试真菌的抑制作用，具体步骤如下：
①将提取物溶于无水丙酮，再加入等体积的水，用50％丙酮水溶液稀释其浓度均为20mg/mL的母液。
②分别将步骤①母液溶液添加至不同的灭菌后的平皿中，然后倒入熔化并冷却至45℃左右的PDA固体培养基，使提取物的终浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，混匀，放置晾干即制成检测平板；将等体积的无菌50％丙酮水溶液作为对照。
④对供试真菌的抑制作用(菌丝生长速率法)
同步骤1的③。
提取物甲的结果见表9，提取物乙的结果见表10，提取物丙的结果见表11。
表9不同浓度提取物甲对供试真菌的抑制率
表10不同浓度提取物乙对供试真菌的抑制率
表11不同浓度提取物丙对供试真菌的抑制率
实验结果表明不同浓度的提取物甲对供试病原真菌有一定的抑制活性，随着浓度变大，对辣椒疫霉菌、大豆根腐病菌、立枯丝核菌、大丽花轮枝孢以及灰葡萄孢ACCC36448的抑制率也逐渐增大。在所试病原真菌中，提取物甲对辣椒疫霉菌的抑制作用最明显，在其浓度为4mg/mL时完全抑制该真菌的生长。在三种提取物中，提取物甲的生物活性最为强烈，在农业植物病害防治具有最大的应用前景。
Claims (10)
1.一种微生物抑制剂，它包括式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素；
2.如权利要求1所述的微生物抑制剂，其特征在于：它还包括式(III)所示的氧化紫色杆菌素；
3.如权利要求1所述的微生物抑制剂，其特征在于：所述微生物抑制剂为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)将Citrobacter freundii pCOM10菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(b)将(a)所述的提取液真空干燥后的粉末；
(c)将杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；所述杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的保藏编号为CGMCC NO.2056；
(d)将(c)所述的提取液真空干燥后的粉末。
4.如权利要求3所述的微生物抑制剂，其特征在于：所述(a)中的所述提取的方法如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，先-20℃冷冻30min，然后30℃振荡30min，最后12000g离心10min收集上清；所述振荡的参数优选为180r·min-1、振荡半径为16mm。
5.如权利要求3所述的微生物抑制剂，其特征在于：所述(c)中的所述提取的方法如下：将所述菌体重悬于无水乙醇中混匀，然后在200W超声波条件下振荡1小时，最后9000×g离心5min收集上清。
6.如权利要求1至6中任一所述的微生物抑制剂，其特征在于：所述微生物为细菌和/或真菌；所述细菌优选为金黄色葡萄球菌金黄亚种、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌和链球菌中的至少一种；所述真菌优选为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型、核盘菌、葫芦科刺盘孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻绿核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大丽花轮枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一种。
7.如下(I)或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在制备微生物抑制剂中的应用：
(I)将Citrobacter freundii pCOM10菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(II)将(I)所述的提取液真空干燥后的粉末；
(III)将杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；所述杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的保藏编号为CGMCC NO.2056；
(IV)将(III)所述的提取液真空干燥后的粉末；
(V)式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素；
(VI)式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
8.如下(I)或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在抑制微生物中的应用：
(I)将Citrobacter freundii pCOM10菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；
(II)将(I)所述的提取液真空干燥后的粉末；
(III)将杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液；所述杜檊氏菌(Duganella)B2菌株的保藏编号为CGMCC NO.2056；
(IV)将(III)所述的提取液真空干燥后的粉末；
(V)式(I)所示的紫色杆菌素、式(II)所示的脱氧紫色杆菌素和式(III)所示的氧化紫色杆菌素；
(VI)式(I)所示的紫色杆菌素和式(II)所示的脱氧紫色杆菌素。
9.式(II)所示脱氧紫色杆菌素在制备微生物抑制剂中的应用。
10.将BL21-CodonPlus(DE3)-RIL pET30aVioΔD菌株的菌体用无水乙醇进行提取得到的提取液，或所述提取液真空干燥得到的粉末，在制备微生物抑制剂中的应用。
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