CN104059934B

CN104059934B - 人乳头瘤病毒8e7蛋白表达及应用

Info

Publication number: CN104059934B
Application number: CN201410194991.1A
Authority: CN
Inventors: 程浩; 陈贤祯; 韩睿; 朱可建; 周强; 丁杨
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-05-11
Filing date: 2014-05-11
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-05-11
Also published as: CN104059934A

Abstract

本发明提供一种人类乳头瘤病毒HPV‑8E7蛋白的表达纯化方法，通过设计HPV‑8E7的扩增引物，并从HPV‑8E7质粒中有效扩增出这个基因，插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中，获得重组载体，转染，收集上清与4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV‑8E7蛋白，行多点免疫，获得纯化的多克隆抗体。本发明增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，能大大提高检测的准确率，为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。

Description

人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及人乳头瘤病毒8型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒8型（Human Papillomavirus type 8, HPV-8）与皮肤癌的发生发展密切相关，HPV-8E7是其主要的致癌蛋白之一。HPV-8E7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-8E7蛋白抗体的发明可为HPV临床检测提供新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类乳头瘤病毒HPV-8E7蛋白的表达、纯化方法，通过以下步骤实现：

（a）HPV-8E7基因的调取及扩增：设计HPV-8E7的扩增引物，并从HPV-8E7质粒中有效扩增出这个基因。

其中用于扩增用于原核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’-GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ IDNO.2：5’-GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；

用于扩增用于真核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’-GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ IDNO.4：5’-GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点；

（b）HPV-8E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（a）中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-8E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得用于后续同源重组的重组载体pGEX-4T2-(HPV-8E7)和pEGFP-C1-(HPV-8E7)。

（c）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（b）中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-8E7)转入大肠埃希菌DH5α，优化IPTG浓度、诱导时间和诱导温度。在250-300w超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3分钟以破碎细菌，收集上清。

（d）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的纯化及HPV-8E7蛋白的获得：通过（c）步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠（GE healthcare）结合，再用凝血酶（GE healthcare）切除GST标签，获取HPV-8E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-8E7蛋白。

步骤(1)、(2)、(3中，大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa。原核表达载体pGEX-4T2从GE health care公司购得，HPV-8型E7质粒来源于德国癌症研究中心应用病毒研究所。

本发明的另一个目的是提供HPV-8E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本发明获得的人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体。

本发明解决的技术问题是通过原核表达产生可溶性HPV-8E7蛋白，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。

利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见（J．萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。

大肠埃希菌DH5α购于大连宝生物TaKaRa公司，pGEX-4T2原核表达载体购于GEhealthcare，HPV-8型E7基因质粒来源于德国癌症研究中心应用病毒研究所，293T细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴定、酶切鉴定或测序鉴定。

体外获得HPV-8E7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达GST-HPV-8E7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV-8E7蛋白。该蛋白在尖锐湿疣发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。

病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体，申请人前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。

HPV 8型是引起尖锐湿疣的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR,容易造成假阳性，或假阴性。HPV-8抗体的发明可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应等技术来检测HPV 8型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV 8型的感染，能大大提高检测的准确率。

说明书附图

图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-8E7)的电泳示意图。图中泳道M1：TaKaRa DL 15,000 DNA marker；泳道1： HPV-8E7基因（用PCR法从HPV-8E7质粒中扩增得到）；泳道2：重组pMD-18T-HPV-8E7质粒；泳道3：重组pMD-18T-HPV-8E7经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切；泳道4： pGEX-4T2质粒；泳道5： pGEX-4T2质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切；泳道6：重组pGEX-4T2-HPV-8E7；泳道7：重组pGEX-4T2-HPV-8E7经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切；泳道M2：TaKaRa DL 2,000 DNA marker。

图2为重组质粒pEGFP-C1-(HPV-8E7)的电泳示意图。泳道M1：TaKaRa DL 15,000DNA marker；泳道1： HPV-8E7基因（用PCR法从HPV-8E7质粒中扩增得到）；泳道2：重组pMD-18T-HPV-8E7质粒；泳道3：重组pMD-18T-HPV-8E7经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道4： pEGFP-C1质粒；泳道5： pEGFP-C1质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道6：重组pEGFP-C1-(HPV-8E7)；泳道7：重组pEGFP-C1-(HPV-8E7)经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切；泳道M2：TaKaRa DL 2,000 DNAmarker。

图3为重组蛋白GST-HPV-8E7诱导表达、纯化、酶切的PAGE分析。泳道1：蛋白预染marker；泳道2：细菌超声破碎后离心所得的上清；泳道before dialysis：纯化酶切后的HPV-8E7蛋白；泳道after dialysis：透析后的HPV-8E7蛋白。

图4为兔抗HPV-8E7蛋白多克隆抗体的Western-Blot效价鉴定。

图5 为Western blotting检测HPV-8E7在293T细胞中的表达。泳道1：293T ；泳道2：293T转染pEGFP-C1质粒；泳道3：293T转染 pEGFP-C1-HPV-8E7质粒。

图6为免疫荧光检测HPV-8E7在293T细胞中的表达。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。

实施例1：HPV 8型E7基因原核表达载体的构建

用PCR方法从HPV-8 purified plasmid DNA扩增出HPV-8E7基因序列（SEQ IDNO.5），所用的引物HPV-8E7_P up（SEQ ID NO.1）、HPV-8E7_P dn（SEQ ID NO.2）由上海生工合成。用于原核表达的上下游引物分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点

HPV-8E7_P up：5’-GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’

HPV-8E7_P dn：5’-GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’

PCR反应条件：50μL反应体系中，加入1μL 含HPV-8型E7基因的质粒，20μmol/L的上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTP mixture 4μL，5×Buffer（Mg²⁺ plus）10μL，rTaq聚合酶0.5μL，剩余用ddH₂O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，共40个循环以后，再72℃延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为340bp的用与原核表达的HPV-8E7序列（SEQ ID NO.6）。

将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至pMD®18-T Vector（TaKaRa：D101A），转化入DH5α后，铺于含100μg/ mL Amp的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μg/ mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pMD-18T-HPV-8E7质粒，并用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。

将测序正确的pMD-18T-HPV-8E7（原核）用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切后的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。

原核表达质粒pGEX-4T2也用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线性pGEX-4T2和HPV-8E7基因片段混合，用T4 DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。，转化入DH5α后，铺于含100μg/ mL Amp的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μg/ mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T2-(HPV-8E7)质粒，并用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成HPV-8E7基因原核表达载体的构建（见图1）。

实施例2：HPV 8型E7基因真核表达载体的构建

用PCR方法从HPV-8 purified plasmid DNA（ATCC：45150D）扩增出HPV-8基因，所用的引物HPV-8E7_E up（SEQ ID NO.3）、HPV-8E7_E dn（SEQ ID NO.4）由上海生工合成。用于真核表达的上下游引物分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。

HPV-8E7_E up：5’-GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’

HPV-8E7_E dn：5’-GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’

PCR反应条件：50μL反应体系中，加入1μL 含HPV-8型E7基因的质粒，20μmol/L的上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTP mixture 4μL，5×Buffer（Mg²⁺ plus）10μL，rTaq聚合酶0.5μL，剩余用ddH₂O补足。用ABI公司的(型号为2720)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，共40个循环以后，再72℃延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为310bp的用于真核表达的HPV-8E7序列（SEQ ID NO.7）。

将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至pMD®18-T Vector（TaKaRa：D101A），转化入DH5α后，铺于含100μg/ mL Amp的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μg/ mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pMD-18T-HPV-8E7质粒，并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒，阳性克隆送上海生工进一步测序验证正确。

将测序正确的pMD-18T-HPV-8E7（真核）用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切后的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。

真核表达质粒pEGFP-C1也用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线性pEGFP-C1和HPV-8E7基因片段混合，用T4DNA连接酶在16℃水浴中连接过夜。转化入DH5α后，铺于含50μg/ mL kana的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含50μg/ mL kana的LB液体培养基中，37℃培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pEGFP-C1-(HPV-8E7)质粒，并用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成HPV-8E7基因真核表达载体的构建（见图2）。

实施例3：HPV 8型E7蛋白的诱导表达

pGEX-4T2-(HPV-8E7)质粒分别转化至大肠杆菌JM109，接种于含氨苄青霉素（Amp）100μg/mL的LB培养液，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，诱导温度：26-28℃，诱导4-6h后收集细菌，冰浴超声裂解菌体，4℃ 12000 rpm 10min离心分离上清和沉淀，并经15%聚丙烯凝胶电泳鉴定（见图3）。

实施例4：HPV 8型E7蛋白的纯化和酶切

取菌体上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-8E7蛋白，PBS透析蛋白过夜，并经聚丙烯凝胶电泳鉴定（见图3）。

实施例5：HPV 8 E7蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化

用纯化后的HPV-8E7蛋白免疫新西兰雌兔，体重为2.5kg为宜。初次免疫用含E7蛋白500μg的抗原完全弗氏佐剂乳化剂1.6mL于兔子背部多点皮内注射，以后每隔10d用含E7蛋白500μg的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫3次。耳缘静脉采血，双向免疫扩散法测定血清中多价抗血清效价（1：8以上符合要求）。10d后， E7蛋白500μg直接腹股沟区肌肉注射。5d后麻醉下心脏取血，分离血清后分装并置-20℃保存。血清按rProtein G Agaros说明书操作，亲和层析获得抗体IgG。

实施例6：HPV 8型E7多克隆抗体IgG的Western-Blot效价分析

将诱导表达的蛋白及牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）作为空白对照，经15% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，以多个稀释滴度的兔抗HPV 8型E7多克隆抗IgG为一抗、1：5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色。（见图4）

实施例7：HPV 8型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定（Western blot）

转染24h前将293T细胞以5×10⁶个/mL浓度接种于10cm的培养皿（含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%CO₂、37℃）。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作，将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-8E7)各取10μg分别与20μl转染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30分钟后覆盖于10cm的培养皿，293T未转染细胞做转染空白对照。转染6h后，将培养基换成含10%FBS的DMEM，培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。用RIPA细胞裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒（碧云天）测蛋白浓度，以每孔40μg的总蛋白经95℃变性后5min后，以10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，以兔抗HPV 8型E7多克隆抗IgG为一抗，稀释比1：5000，1：5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色。（见图5）

实施例8：HPV 8型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定（免疫荧光）

转染24h前将293T细胞以2.5×10⁵个/mL浓度接种于放有细胞爬片的6孔板（含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%CO₂、37℃）。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine 2000说明书操作，将质粒pEGFP-C1、重组质粒pEGFP-C1-(HPV-8E7)各取4 μg分别与8 μl转染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30分钟后覆盖于6孔板中，293T未转染细胞做转染空白对照。培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。将6孔板中的细胞爬片用PBS洗3遍后依次4%多聚甲醛室温固定10分钟、0.1%TritonX-100室温孵育7分钟，期间PBS洗3遍，每次5分钟。置于4℃保存或进行免疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出上述爬有293T细胞（未转染的作对照）盖玻片于10%山羊血清室温封闭2h，1：500（5%山羊血清稀释）的HPV-8E7兔多克隆抗体IgG为一抗4℃孵育过夜，1：500（5%山羊血清稀释）的Alexa Flour555羊抗兔IgG为二抗室温孵育1h，0.5μg/mlDAPI染色8分钟，期间用PBS洗3遍每次5min。封片后荧光显微镜观察（见图6）。

<110> 浙江大学

<120> 人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及应用

<160> 7

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 从含HPV-8E7基因的质粒中扩增HPV-8E7基因的上游引物（用于原核表达）

<440> 1

ggatccatga ttggtaaaga ggtcactgt 29

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 从含HPV-8E7基因的质粒中扩增HPV-8E7基因的下游引物（用于原核表达）

<440> 2

gaattcttat gatccgccat gtttgca 27

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 从含HPV-8E7基因的质粒中扩增HPV-8E7基因的上游引物（用于真核表达）

<440> 3

gaattctatg attggtaaag aggtcactgt 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 从含HPV-8E7基因的质粒中扩增HPV-8E7基因的下游引物（用于真核表达）

<440> 4

ggatccttat gatccgccat gtttgca 27

<210> 5

<211> 312

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 8 E7 gene

<220>

<221> CDS

<222> (1)~(312)

<223> 人乳头瘤病毒8型E7基因序列

<440> 5

001-060 atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg gag ttaagt gag ata cag cct

MET Ile Gly Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Phe Val Leu Glu LeuSer Glu Ile Gln Pro

1 5 10 15 20

061-120 gaa gtg tta cca gtt gac ctg ctt tgt gaa gag gaa tta cca aacgaa cag gaa acg gag

Glu Val Leu Pro Val Asp Leu Leu Cys Glu Glu Glu Leu Pro AsnGlu Gln Glu Thr Glu

21 25 30 35 40

121-180 gag gag cta gac atc gaa aga act gta ttc aaa att gtt gca ccgtgt ggc tgc agc tgc

Glu Glu Leu Asp Ile Glu Arg Thr Val Phe Lys Ile Val Ala ProCys Gly Cys Ser Cys

41 45 50 55 60

181-240 tgt cag gtc aag cta cgt ctt ttt gtc aac gca act gat tcg ggtatc agg acc ttt caa

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61 65 70 75 80

241-297 gaa ttg ctg ttc aga gac cta cag ctt ctg tgt cct gag tgc cgcggt aac tgc aaa cat

Glu Leu Leu Phe Arg Asp Leu Gln Leu Leu Cys Pro Glu Cys ArgGly Asn Cys Lys His

81 85 90 95 98

301 ggc gga tca taa

Gly Gly Ser ***

101 103

<210> 6

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (21)~(333)

<223> 重组载体pGEX-4T2-(HPV-8E7)

<440> 6

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961 acg ttt tcc aat gat gag cac ttt tta aag ttt ctg cta t

<210> 7

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (64)~(375)

<223> 重组pEGFP-C1-(HPV-8E7)

<400> 7

1 tct ctc ggc atg gac gag ctg tac aag tcc gga ctc aga tct cga gct caa gct tcg aat

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Claims

1.人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及纯化方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）HPV-8E7基因的调取及扩增：设计HPV-8E7的扩增引物，并从HPV-8E7质粒中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’-GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列SEQID NO.2：5’-GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；

（2）HPV-8E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1）中得到的这两个含不同酶切位点的HPV-8E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得用于后续同源重组的重组载体pGEX-4T2-(HPV-8E7)和pEGFP-C1-(HPV-8E7)；

（3）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2）中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-8E7)转入大肠埃希菌DH5α，优化IPTG浓度、诱导时间和诱导温度，在250-300w超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长3分钟以破碎细菌，收集上清；

（4）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的纯化及HPV-8E7蛋白的获得：通过（3）步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-8E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-8E7蛋白；

在设计蛋白表达载体时，选择含GST标签的pGEX-4T2，且在蛋白纯化后，可将GST标签切除，使获得的蛋白更接近天然HPV-8E7蛋白，在诱导蛋白表达时为避免形成不可溶的包涵体，采取降低IPTG的浓度，缩短诱导时间，降低诱导温度。

2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒8E7蛋白表达纯化方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中，大肠埃希菌宿主DH5α、真核表达载体pEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa，原核表达载体pGEX-4T2从GE health care公司购得，HPV-8型E7质粒来源于德国癌症研究中心应用病毒研究所。

3.根据权利要求1所述方法获得的人乳头瘤病毒8E7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。