CN104046682B - 同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒 - Google Patents

同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒，该方法选择了抗SAH抗体，并建立了SAH-DNA引物，选择了特定的与该DNA引物互补的DNA模板以及合适的DNA多聚酶，建立了DNA多聚酶反应体系。当待测样品中的HCY在SAM的存在下由甲基转移酶转变成SAH，该生成的SAH会与检测体系中抗SAH抗体结合，则检测体系中剩余部分的抗SAH抗体会与体系中SAH-DNA引物结合，所形成的结合物将抑制DNA多聚酶的活性并阻止新的双链DNA的形成，通过测定新双链DNA的含量来检测样品中HCY的含量。该检测方法快速准确且操作简便，且建立在该检测方法上的诊断试剂盒使用起来精准可靠，简便易行，且操作成本低廉，有助于进行广泛推广。<!--1-->

Description

同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒，尤其涉及一种利用DNA多聚酶活性的调控来检测样品中同型半胱氨酸含量的方法，以及依据该方法建立的诊断试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸（HCY）在人体内的浓度与心血管发病率有着密切的相关性。研究表明同型半胱氨酸与低密度脂蛋白反应经吞噬细胞吞噬后，该吞噬细胞会“破碎”并沉积于血管壁，通过一系列反应后将会有副产物氧化放出并损伤血管壁，然后平滑肌细胞分裂修补造成“疤痕”，同型半胱氨酸改变凝血因子水平，造成血小板聚集在血管壁的粥样硬化处等。临床上，在跟踪5年近1500个高同型半胱氨酸的男性中发现，排除其他因素后，其心脏病的几率将会增加3倍，血液中每增加5μmol/l同型半胱氨酸的浓度与胆固醇升高0.5mmol/l的效果是一样的，均对冠状动脉疾病发生具有相同的危险性，尤其是中年男性局部缺血性心脏疾病机会将增加1/3。此外还有许多研究表明高同型半胱氨酸血症与颈动脉粥样硬化相关，随着颈动脉硬化及狭窄的加重，血清中同型半胱氨酸的水平随之升高，且男性的水平高于女性，这可能与雌激素对同型半胱氨酸代谢的影响以及男性肌肉容量比女性大有关。
目前测定同型半胱氨酸的方法包括以下几种。一是由Refsum等人于1985年建立的同位素法，该方法通过14C标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来检测HCY的浓度，其虽然灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。二是1987年Stabler等人首次报道的气相色谱-质谱法，该方法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质，虽然灵敏度、特异性好，但由于仪器价格昂贵而得不到广泛的推广。三是免疫学法，该方法应用特异性的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定HCY，其中美国雅培公司采用全自动荧光偏振免疫技术，用AXSYM仪器检测HCY，其反应原理为：正常人血浆中HCY约有1%并以还原型存在，70%与白蛋白结合，近30%形成小分子二硫化物，血浆标本在含二硫苏糖醇的预处理液作用下，HCY、混合的二硫化物及蛋白结合型等均被还原成游离HCY形式（即tHCY）：tHCY在S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水解酶和过量腺苷存在的情况下，将被转换成SAH；预稀释的SAH混合物、抗SAH单克隆抗体及标记的荧光S-腺苷-L-半胱氨酸示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本中总HCY的水平。四是近年来国外研究出的新一代同型半胱氨酸测试法，即酶法，但该方法操作成本较高且有相应的专利保护。因此，快速，精确，简易的同型半胱氨酸测试方法有待于出现。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒，该检测方法快速准确且操作简便，且建立在该检测方法上的诊断试剂盒使用起来精准可靠，简便易行，且操作成本低廉，有助于进行广泛推广。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种同型半胱氨酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）选择同型半胱氨酸HCY的甲基转移酶产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸SAH的特异性抗体，即抗SAH抗体；
（2）针对（1）中所选择的抗SAH抗体，制备能够与该抗SAH抗体特异性结合的SAH-DNA引物，并选择与该SAH-DNA引物中的DNA引物互补的DNA模板，建立DNA多聚酶反应体系；
（3）选择DNA多聚酶；
（4）将待测样品中未知量的HCY在过量S-腺苷-L-蛋氨酸的存在下由甲基转移酶转变成SAH，将该生成的SAH和已知并过量的（1）中所述抗SAH抗体结合；将该已知并过量抗SAH抗体中未与所述生成的SAH结合的部分与继续添加的已知量并过量（2）中所述SAH-DNA引物结合，所形成的结合物将抑制（3）中所述DNA多聚酶的活性并阻止新的双链DNA的形成；
（5）通过测定形成的新的双链DNA的含量来检测样品中HCY的含量。
其进一步的技术方案是：
制备SAH-DNA引物时通过在合适的DNA引物上引入能够与SAH交联的可交联基团。
所述可交联基团为羧基，该羧基能够被活化成活化酯基团，该活化酯基团能够和SAH中的氨基形成肽键。
所述SAH-DNA引物在同一时刻仅能与抗SAH抗体和DNA多聚酶中的一种相结合。
所述抗SAH抗体和SAH的结合能够抑制抗SAH抗体和SAH-DNA引物的结合，并恢复DNA多聚酶的活性，合成新的双链DNA，并释放出焦磷酸。
所述形成的新的双链DNA的含量能够通过荧光染料标记来测定。
所述DNA多聚酶的活性能够通过新的双链DNA形成时所释放焦磷酸的含量来测定。
待检样品为血清、血浆、唾液、尿液和上述物质提取物中的一种。
本发明还根据上述检测方法建立了一种同型半胱氨酸的诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，所述第一试剂包括甲基转移酶、抗SAH抗体、dNTP和S-腺苷-L-蛋氨酸；所述第二试剂包括SAH-DNA引物和与其互补的DNA模板；所述第三试剂包括DNA多聚酶。
所述第一试剂、第二试剂和第三试剂均为均相试剂。
本发明的有益技术效果是：本发明所提供的同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒以HCY的甲基转移酶产物SAH能够和其特异性抗体抗SAH抗体结合为基础而建立的，该方法中选择了抗SAH抗体，并建立了SAH-DNA引物，选择了特定的与该DNA引物互补的DNA模板，选择合适的DNA多聚酶，建立了DNA多聚酶反应体系，该方法中当待测样品中的HCY在SAM的存在下由甲基转移酶转变成SAH，该生成的SAH会与检测体系中抗SAH抗体结合，则检测体系中剩余部分的抗SAH抗体会与体系中SAH-DNA引物结合，所形成的结合物将抑制DNA多聚酶的活性并阻止新的双链DNA的形成，通过测定新双链DNA的含量来检测样品中HCY的含量，新双链DNA含量可通过荧光染料标记或对其副产物焦磷酸含量的测定来测定。该检测方法快速准确且操作简便，且建立在该检测方法上的诊断试剂盒使用起来精准可靠，简便易行，且操作成本低廉，有助于进行广泛推广。
附图说明
图1为SAH-DNA引物的形成及其对DNA多聚酶的影响；
图2为抗SAH抗体结合SAH-DNA引物并抑制DNA多聚酶的反应示意图；
图3为样品中HCY生成的SAH与抗SAH抗体结合并启动DNA多聚酶的反应示意图；
图4为DNA引物与SAH共价结合形成SAH-DNA引物的反应原理简图；
图5为抗SAH抗体浓度与相对荧光强度之间的关系图；
图6为HCY浓度与相对荧光强度之间的关系图；
其中：
101-DNA多聚酶；102-DNA引物；103-抗SAH抗体；104-SAH；105-新DNA双链。
具体实施方式
本发明用于检测同型半胱氨酸的方法是建立在同型半胱氨酸（HCY）的甲基转移酶产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）能够和其特异性抗体（抗SAH抗体）结合的基础上进行的，而SAH和抗SAH抗体的结合可以通过简单的DNA多聚酶的活性表现出来。其具体的原理如下所述：当HCY的甲基转移酶产物SAH以共价键结合在DNA引物上，形成SAH-DNA引物时，该SAH-DNA引物仍然可以在DNA多聚酶的作用下合成新的DNA双链，如图1所示；当有抗SAH抗体存在时，该抗SAH抗体可以和SAH-DNA引物上的SAH结合，且该结合将会阻止DNA多聚酶的活性，使其无法作用于SAH-DNA引物上，进而无法形成新的DNA双链，如图2所示；当样品中的HCY可以通过甲基转移酶在S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）存在时形成SAH，而该合成得到的SAH将消耗掉体系中的抗SAH抗体，从而将DNA引物释放出来，且该释放出的DNA引物能够在DNA多聚酶的作用下合成新的DNA双链，如图3所示，则样品中的HCY的浓度可以通过所合成的新DNA双链含量的多少来测定。而新DNA双链含量的测定可以通过测定其在生成过程中由DNA多聚酶释放出的焦磷酸含量来获得。常用测量新DNA双链合成过程中由DNA多聚酶释放的焦磷酸含量的方法有ATP化学发光法，也可以采用焦磷酸酶将焦磷酸裂解为无机磷酸（Pi），则该无机磷酸能够在嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）催化作用下与2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核酸（MESG）反应，生成核糖1-磷酸盐和2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤。在该反应进行过程中，MESG的转化将导致从底物MESG的330nm的光吸收波段移到产物核糖1-磷酸盐和2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的最大光吸收波段360nm。则在该360nm处的光吸收变化直接反应出样品中HCY的浓度，光吸收的增加和样品中HCY的浓度是呈正比的，并且信号强度将会成倍增大，通过检测反应体系在360nm处的光吸收增加即可间接测定出样品中HCY的含量。
本发明也可理解为制备用于检测同型半胱氨酸的人造DNA开关的方法，依据该方法制备出的人造DNA开关直接受HCY的甲基转移酶产物SAH和其特异性抗体抗SAH抗体的结合而控制，该开关开启的程度直接反应出测试体系中HCY含量的大小。从人造DNA开关的角度来看，该抗SAH抗体与SAH-DNA引物相结合时，抗SAH抗体将阻止DNA多聚酶和DNA模板的结合并关闭新双链DNA的合成，当抗SHA抗体与SAH-DNA引物分开时，则启动新双链DNA的合成，该开关完全由样品中HCY浓度控制，即无HCY——抗SAH抗体与SAH-DNA引物结合——抑制DNA多聚酶——无新双链DNA合成；有HCY——产生SAH抗原并与抗SAH抗体结合——恢复DNA多聚酶活性——有新双链DNA合成，因此反应体系中有HCY存在时便有新双链DNA的合成，且该新双链DNA的合成量与反应体系中HCY含量成正比，本发明所述方法及诊断测试盒正是利用这一模式来测定样品中HCY含量的。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。本发明所述的检测方法并不局限于本实施例中所采用的一种DNA引物及与其互补的模板DNA，亦可适用于所有能够与SAH共价键连接在一起的DNA引物及与其互补的模板DNA。且下述实施例中未提到的试剂、操作步骤、实验仪器及操作参数等均按照本领域常规选择即可。其具体步骤如下所述。
一、合成SAH-DNA引物，并选择与该引物互补的DNA模板。
首先设计好并制备出不含SAH的DNA引物，在设计及制备该DNA引物时，可在其结构上加入不同的可交联基团。本实施例中在不含SAH的DNA引物上引入羧基（-COOH），然后利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化后形成活化酯基团，然后将SAH的-NH2基团和该活化酯基团反应，形成肽键，由此形成带有SAH的DNA引物，即SAH-DNA引物，其中DNA引物的编码序列为：NNNNNNNNNNNNNNNNNN。则带有SAH的DNA引物示意序列为：NNNNNNNNNNNNNNNNN(SAH)N，其形成过程简图如图4所示。当进行DNA模板的选择时，选择3’端与上述引物互补的DNA片段，该DNA片段的长度为75至80个碱基，也可以为80个碱基以上，DNA酶所产生的信号与该DNA片段的长度密切相关，本实施例中选用的DNA模板的编码序列为：TCTTCCTCTCTCTTTCTTTCCTCCTTCCCTCTCCCTTTCCTCCTCTC'TCCTCCTTTCCTCTACTCTCTGACTTACG。
二、选择合适的抗SAH抗体浓度。
该步骤所依据的原理是抗SAH抗体阻止DNA多聚酶的反应。抗SAH抗体如同基因调控开关一样可以控制DNA多聚酶和DNA模板的结合，即当体系中有抗SAH抗体存在时，抗体可以和SAH-DNA引物上的SAH结合，进而阻止DNA多聚酶和DNA模板的结合，其中抗SAH抗体对DNA多聚酶活性干扰的程度和体系中抗体的浓度呈正比关系。
在该步骤中，取50μl0.05mol/lTris-HClpH8.0的DNA多聚酶缓冲液，其中含1倍的DNA荧光染料SYBR（购自美国LifeTechnologiesInc）和0.1mmol/l（其用量即为50μl×0.1mmol/l）的dNTP混合物。将含有上述物质的DNA多聚酶缓冲溶液分别与20μl不同浓度的抗SAH抗体样品混合，该抗SAH抗体样品的浓度分别是100nmol/l、50nmol/l、25nmol/l、12.5nmol/l、6.25nmol/l、3.125nmol/l、1.5nmol/l和0.0nmol/l。向上述体系中分别加入20μl的5nmol/l的SAH-DNA引物和与该引物互补的DNA模板（则DNA模板的量也为20μl×5nmol/l），混合均匀后并在室温下保持10min，向上述体系中分别加入10μl的1单位/ml的DNA多聚酶。记录反应过程中的荧光变化，其中激发光选用485nm，发射光选用535nm。其抗SAH抗体含量与荧光量的关系图如图5所示。由于新合成的双链DNA可以通过其与SYBR结合所释放出的荧光检测出来，因此新合成的双链DNA与荧光强度之间存在相应的关系。从图5结果显示可以看出，高浓度抗SAH抗体可以抑制DNA多聚酶的反应，随着样品中抗SAH抗体的浓度增加，新合成的双链DNA的量随之减少。按照上述方法，通过对荧光量的检测，可以不用通过创造性的劳动就能容易的找出抗SAH抗体的最佳使用浓度。本实施例中选用10nmol/l的抗SAH抗体进行HCY的检测实验。
三、样品中HCY含量的测定。
该步骤所依据的原理如下所述，样品中的HCY在S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）存在下时，会由甲基转移酶催化生成SAH，该生成的SAH可以特异性的和抗SAH抗体结合，消耗掉样品体系内的抗SAH抗体，则体系中余下的抗体量和体系中HCY的浓度成反比。即HCY的量越多，余下的抗SAH抗体的量越少，抗SAH抗体量的减少对DNA多聚酶的影响越小。
在该步骤中，取50μl0.05mol/lTris-HClpH8.0的DNA多聚酶缓冲液，其中含1倍的DNA荧光染料SYBR（购自美国LifeTechnologiesInc）、0.1mmol/l（其用量即为50μl×0.1mmol/l）的dNTP混合物、1mmol/l的SAM和50μg的甲基转移酶，将含有上述物质的DNA多聚酶缓冲液与20μl10nmol/l的抗SAH抗体混合在一起，得到第一混合液。将第一混合液分别与10μl不同浓度的HCY样品混合，该HCY样品的浓度分别是50nmol/l、25nmol/l、12.5nmol/l、6.25nmol/l、3.125nmol/l、1.5nmol/l和0.0nmol/l，混合均匀后在室温下保温5min，得到一系列的第二混合液。向上述一系列的第二混合液中分别加入20μl的5nmol/l的SAH-DNA引物和与该引物互补的DNA模板（则DNA模板的量也为20μl×5nmol/l），混合均匀后并在室温下保持5min，得到相应一系列的第三混合液。然后向上述一系列第三混合液中分别加入10μl的1单位/ml的DNA多聚酶。记录反应过程中的荧光变化，其中激发光选用485nm，发射光选用535nm。其HCY含量与荧光量的关系图如图6所示。由于新合成的双链DNA可以通过其与SYBR结合所释放出的荧光检测出来，因此新合成的双链DNA与荧光强度之间存在相应的关系。从图6结果显示可以看出，高浓度的HCY可以和抗SAH抗体结合，从而缓解抗SAH抗体对DNA多聚酶的抑制反应，随着样品中同型半胱氨酸的浓度增加，新合成的DNA双链的量也随之增加。按照上述方法，通过对荧光量的检测，可以不用通过创造性的劳动就能测定体系中HCY的含量。上述方法可用于检测的样品有血清、血浆、唾液、尿液、血清提取物、血浆提取物、唾液提取物和尿液提取物中的一种。
本发明实施例还提供了一种根据上述检测方法设计出的用于检测HCY的诊断试剂盒，该诊断试剂盒中包括三种试剂，分别为第一试剂、第二试剂和第三试剂。
其中第一试剂共计70ml，其所包含的主要成分为：0.05mol/lTris-HClpH8.0的DNA多聚酶缓冲液，1mg/ml的甲基转移酶，1nmol/l的抗SAH抗体，0.5mmol/l的还原剂，该还原剂可选用二硫苏糖醇（DTT）或三（2-羧乙基）膦（TCEP），0.1mmol/l的dNTP和1mmol/l的SAM，稳定剂（含1wt.%BSA，2wt.%糖和15wt.%甘油），防腐剂（含0.1wt.%叠氮钠），且该第一试剂中含有1倍的SYBR，以上所述浓度均为在70ml中计。
其中第二试剂共计20ml，其所包含的主要成分为：0.05mol/lTris-HClpH8.0的DNA多聚酶缓冲液，5nmol/l的SAH-DNA引物/DNA模板，稳定剂（含1wt.%BSA，2wt.%糖和15wt.%甘油），防腐剂（含0.1wt.%叠氮钠），以上所述浓度均为在20ml中计。
其中第三试剂共计10ml，其所包含的主要成分为：0.05mol/lTris-HClpH8.0的DNA多聚酶缓冲液，0.1单位的DNA多聚酶，稳定剂（含1wt.%BSA，2wt.%糖和15wt.%甘油），防腐剂（含0.1wt.%叠氮钠），以上所述浓度均为在10ml中计。
上述第一试剂、第二试剂和第三试剂为用于诊断的一个整体，且第一、二和三试剂中除含有上述成分外，本实施例中未提及的其他试剂均为能够用于该领域的常规试剂，不需要本领域技术人员付出创造性劳动即可获知。本实施例所述试剂盒可以是由多个隔断所形成，用以容纳固定一个或者多个如管或小瓶类的容器，每个容器中分别装有本实施例所述的第一试剂、第二试剂和第三试剂，且每三瓶试剂为一个整体，可根据实际检测需要调整每种试剂中的液体体积。此外本发明试剂盒中还包括有用于实施本发明所需要的基本用具，均为本领域技术人员熟知的常规操作用具。本发明所述诊断试剂盒中的内容物均为均相物，且本发明所述试剂盒所适用的样品可以使血清、血浆、唾液、尿液、上述方法可用于检测的样品有血清、血浆、唾液、尿液、血清提取物、血浆提取物、唾液提取物和尿液提取物中的一种。相应的提取物，均能够定量测定上述种类样品中的同型半胱氨酸含量。

Claims (10)

1.一种非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)选择同型半胱氨酸HCY的甲基转移酶产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸SAH的特异性抗体，即抗SAH抗体；
(2)针对(1)中所选择的抗SAH抗体，制备能够与该抗SAH抗体特异性结合的SAH-DNA引物，并选择与该SAH-DNA引物中的DNA引物互补的DNA模板，建立DNA多聚酶反应体系；
(3)选择DNA多聚酶；
(4)将待测样品中未知量的HCY在过量S-腺苷-L-蛋氨酸的存在下由甲基转移酶转变成SAH，将该生成的SAH和已知并过量的(1)中所述抗SAH抗体结合；将该已知并过量抗SAH抗体中未与所述生成的SAH结合的部分与继续添加的已知量并过量(2)中所述SAH-DNA引物结合，所形成的结合物将抑制(3)中所述DNA多聚酶的活性并阻止新的双链DNA的形成；
(5)通过测定形成的新的双链DNA的含量来检测样品中HCY的含量。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：制备SAH-DNA引物时通过在合适的DNA引物上引入能够与SAH交联的可交联基团。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：所述可交联基团为羧基，该羧基能够被活化成活化酯基团，该活化酯基团能够和SAH中的氨基形成肽键。
4.根据权利要求1所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：所述SAH-DNA引物在同一时刻仅能与抗SAH抗体和DNA多聚酶中的一种相结合。
5.根据权利要求1所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：所述抗SAH抗体和SAH的结合能够抑制抗SAH抗体和SAH-DNA引物的结合，并恢复DNA多聚酶的活性，合成新的双链DNA，并释放出焦磷酸。
6.根据权利要求1所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：所述形成的新的双链DNA的含量能够通过荧光染料标记来测定。
7.根据权利要求1所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：所述DNA多聚酶的活性能够通过新的双链DNA形成时所释放焦磷酸的含量来测定。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的非诊断目的的同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于：待检样品为血清、血浆、唾液、尿液和上述物质提取物中的一种。
9.根据权利要求1所述检测方法建立的同型半胱氨酸的检测试剂盒，其特征在于：包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，所述第一试剂包括甲基转移酶、抗SAH抗体、dNTP和S-腺苷-L-蛋氨酸；所述第二试剂包括带有S-腺苷-L-同型半胱氨酸SAH的DNA引物和与其互补的DNA模板；所述第三试剂包括DNA多聚酶。
10.根据权利要求9所述的同型半胱氨酸的检测试剂盒，其特征在于：所述第一试剂、第二试剂和第三试剂均为均相试剂。
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