CN1570135A - 采用小分子捕获技术的同型半胱氨酸检测方法 - Google Patents

Abstract

基于小分子捕获技术研制生产同型半胱氨酸诊断试剂盒的方法，该方法使用基因突变酶与待测小分子物质结合，这种基因突变酶称为小分子捕获酶，这些经过突变、修饰的小分子捕获酶保留甚至增强其对底物或待测小分子物质的亲和力，但是削弱其对底物或待测小分子物质的亲和力的催化、分解能力。基于小分子捕获技术研制生产同型半胱氨酸(HCY)诊断试剂盒的方法提供这种，也提供突变的S－腺苷同型半胱氨酸水解酶，特异性S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕获酶可以充分地保留甚至增强其对或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的亲和力，但是削弱了其对HCY或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。该方法尤其适用于小分子物质，如：无机离子，氨基酸，多肽，核苷，寡核苷酸，维生素，单糖，低聚糖，脂类，有机酸。

Description

采用小分子捕获技术的同型半胱氨酸检测方法

技术领域

本发明涉及到成分和检测方法，主要是针对于小分子的待检测物。基于小分子捕获技术研制生产同型半胱氨酸的检测方法，该方法使用基因突变酶与待测小分子物质结合，这种基因突变酶称为小分子捕获酶，这些经过突变、修饰的小分子捕获酶保留甚至增强其对底物或待测小分子物质的亲和力，但是削弱其对底物或待测小分子物质的亲和力的催化、分解能力。基于小分子捕获技术研制生产同型半胱氨酸(HCY)诊断试剂盒的方法提供这种，也提供突变的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，特异性S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕获酶可以充分地保留甚至增强其对或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的亲和力，但是削弱了其对HCY或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。

背景技术

检测物质的方法有广阔的应用范围。许多被检测物质包括一些小分子量的被检测物是生物体和生物运行过程的基本成分或是参与者。检测这些物质可用于监测生物体系及其反应过程或者用于诊断由于这些物质的不均衡或缺乏引起的肌体失调或疾病以及预后。例如，同型半胱氨酸Hcy，一个带硫基的氨基酸；叶酸，一种有机酸；胆固醇，一种对于诊断和预示广泛的心血管疾病有重要作用的脂类。维生素对于诊断和预示维生素缺乏或紊乱症是重要的。血糖，一种单糖，用于诊断和预示糖尿病的血糖水平。乙醇，监测滥用酒精和潜在的肝脏损伤。胆汁酸或胆盐是一种诊断和预示一些肿瘤如结肠癌的重要指标。监测尿酸是很重要的，因为异常高浓度的尿酸是诊断高尿酸血症导致痛风的指标，对肾脏有害。另外这种预示和诊断的应用，这种检测方法也适用于农业，工业或环境保护方面，监测目前的，特定区域的和被检测物的浓度。

同型半胱氨酸的检测

同型半胱氨酸是一种含硫基的氨基酸，来源于蛋氨酸通过S-腺苷蛋氨酸依赖的转甲基作用。细胞内的同型半胱氨酸再甲基化形成蛋氨酸或者进行一系列的分解代谢生成半胱氨酸。细胞内的同型半胱氨酸可以从细胞内溢出细胞外的液体中如血液和尿液中，大多数以氧化形势参加循环，多数与血浆中的蛋白结合(Refsumet al.，Annu.Rev.Medicine，49：31-62(1998)).。血浆和尿中的同型半胱氨酸含量反应同型半胱氨酸的生成和利用平衡状态。这种平衡被破坏可能由于相关酶的遗传缺陷包括同型半胱氨酸转硫基和再甲基化的缺陷(例如胱硫醚β合成酶和N5，N10亚甲基四氢叶酸脱氢酶)或者同型半胱氨酸代谢需要的维生素饮食中缺乏(例如，维生素B6，B12和叶酸)(Baual，et al.，Cleveland Clinic Journal of Medicine，64：543-549(1997))。另外，血浆中的同型半胱氨酸水平同时受到一些治疗癌症或关节炎药物的影响例如抗叶酸药物甲基蝶呤(Foody，et al.，Clinician Reviews，8：203-210(1998))。

严重的高同型半胱氨酸血症由于同型半胱氨酸新陈代谢方面的基因编码出现了缺陷。这种情况中，这种酶的缺陷既包括HCY再甲基化中也包括转硫基的酶类，从而导致血中和尿中的Hcy升高至50倍。最严重的HCY代谢紊乱，先天性的高同型半胱氨酸血症由于缺乏遗传编码胱硫醚β合成酶的同合子。这些个体在早年时即出现血管栓塞，从而发生动脉硬化，心肌梗死，肾血管高压，间歇性跛行，肠系膜缺血和肺部栓塞。一些病人还存在智力缺陷和其它异常象器官异位和骨骼畸形(Perry T.，Homocysteine：Selected aspects in Nyham W.L.ed.Hertable disordersof amino acid metabolism.New York，John Wiley & Sons，pp.419-451(1974))。众所周知，孕妇体内含有高浓度的Hcy会导致婴儿出现神经管关闭不全(Scott et al.，″The etiology of neural tube defects″in Graham，I.，Refsum，H.，Rosenberg，I.H.，andUreland P.M.ed.″Homocysteine metabolism：from basic science to clinical medicine″Kluwer Academic Publishers，Boston，pp.133-136(1995))。因此，Hcy的诊断应用价值在临床上有很多好的文献。

研究证明即使轻微或中度Hcy的水平升高也会导致冠心病的危险，脑及外周动脉和心血管疾病危险的增加。(Boushey，et al.，JAMA，274：1049-1057(1995)).。高同型半胱氨酸血症的流行调查表明高Hcy病人中分别有42％，28％，30％的脑血管疾病，外周血管疾病和心血管疾病。(Moghadasian，et al.，Arch.Intern.Med.，157：2299-2307(1997))。其中27个临床研究中表明每增高5mu.M的Hcy水平，男性的冠心病发病率升高60％，女性升高80％，相对于血浆胆固醇升高20mg.multidot.dl.sup.-1(0.5mmol.multidot.dl.sup.-1)。因此Hcy做为一个危险因子，与普通人中的胆固醇水平同样危险。从这项研究中发现高同型半胱氨酸血症是心血管疾病的新的独立的危险因子，可能是那些无任何血管疾病危险因素的心血管病人的原因。(e.g.，hypertension，hypercholesterolemia，cigarette smoking，diabetesmellitus，marked obesity and physical activity)。

轻微的高同型半胱氨酸血症主要由于酶基因是杂合子治病。四氢叶酸还原酶的基因上的多态性导致叶酸的缺乏从而影响同型半胱氨酸水平的灵敏(Boers，et al.，J.Inher.Metab.Dis.，20：301-306(1997))。而且，血浆中的Hcy水平在心脏和肾脏移植的病人(Ueland，et al.，J.Lab.Clin.Med.，114：473-501(1989))，帕金森氏综合症病人中(Jacobsen，et al.，Clin.Chem.，44：2238-2239(1998))，和非胰岛素依赖的病人中急剧升高(Ducloux，et al.，Nephrol.Dial.Transplantl，13：2890-2893(1998))。越来越多的关于高同型半胱氨酸水平与心血管疾病关系的研究证据促进了通过降低血浆中的Hcy水平来防止心血管疾病的双盲随机性有控制的多中心实验的开始(Diaz-Arrastia，et al.，Arch.Neurol，55：1407-1408(1998))。

在不久的将来血浆中Hcy的检测会成为一种常规的临床检验项目。现在，心脏病专家已经开始建议他们的病人检测Hcy水平，尤其对于那些有心血管家族史的病人或患有心血管疾病但是其胆固醇水平正常并且没有其它危险因子存在的病人，还有那些超过60岁的病人。

血清或血浆中的总Hcy以复杂的形式存在，70％的血浆中的Hcy以蛋白结合形式，20-30％以均衡的或不均衡的混合二硫化合物形式存在，游离形式的Hcy只有很少量的存在(Stehouwer，et al.，Kidney International，55308-314(1999))。做为心血管疾病的危险因子，建议临床检测血浆中总Hcy(包括游离的，氧化型的，蛋白结合型的)(Hornberger，et al.，American J.of Public Health，88：61-67(1998))。自从1982年以来，出现了几种检测血浆中总Hcy的方法。(Mansoor，et al.，Anal.BioChem.，200：218-229(1992)；Steir，et al.，Arch.Intern.Med.，158：1301-1306(1998)；Ueland，etal.，Clin.Chem.，39：1764-1779 01993)；and Ueland，et al.，″Plasma homocysteine andcardiovascular disease″in Francis，R.B.Jr.eds.Atherosclerotic Cardiovascular Disease，Hemostasis，and Endothelial Function.New York，Marcel Dokker，pp.183-236(1992)；see，also，Ueland，et al.，″Plasma homocysteine and cardiovascular disease″in Francis，R.B.Jr.eds.Atherosclerotic Cardiovascular Disease，Hemostasis，and EndothelialFunction.New York，Marcel Dokker，pp.183-236(1992))。大多数方法需要精密的层析技术例如高压液相技术，毛细管气体层析技术，或者集合光谱测定技术(GC/MS)直接或间接(例如通过HPLC或TLC使SAH水解酶水解Hcy为SAH)检测Hcy。另外还使用在薄层层析分离法TLC分离之前SAH水解酶水解放射性的Hcy转化为放射性标记的SAH。所有这些检测方法的普遍特点包括以下4个步骤：(1)氧化型Hcy转化为还原性的Hcy；(2)进层析分离柱之前Hcy诱导或酶反应为SAH；(3)层析分离；(4)检测Hcy衍生物或SAH。在这些检测中层析分离是分析方法中最关键的步骤，这种方法通常浪费时间，操作烦琐。更特殊地是，这些方法需要高度专业化和精密的仪器以及受过良好训练的专业技术人员。普通的临床科室一般没有这种专门的仪器。

众所周知，免疫方法检测Hcy使用单克隆抗SAH(Araki，et al.，J.Chromatog.，422：43-52(1987)。这种方法基于Hcy转化为SAH，然后使用单克隆抗体检测SAH。研究单克隆抗白蛋白结合型Hcy从而能够检测血浆以主要形式存在的白蛋白结合型Hcy(Stabler，et al.，J.Clin.Invest.，81：466-474(1988))。其它的免疫反应方式也同样其它的免疫物质也同样适用(see，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767 and U.S.Pat.No.5,631,127)。虽然免疫检测方法避免了浪费时间的层析分离步骤和实现了自动化，但是单克隆抗体很昂贵，并且不容易得到经常需要二抗或三抗参与检测。

不论免疫检测方法是多么重要多么广泛围的应用，目前这种方法面临着下面几种问题。第一，对于许多方法来说，特异性地结合物不好制备，并且缺乏特异性从而影响检测的特异性。虽然这个缺陷可以通过制备高分子物抗体，制备抗体尤其纯化均一的单克隆抗体来弥补，但是这个过程需要大量的时间并且花费很大。另外，对于一些小分子量的被检测物，制备抗体的选择变得不可行，因为小分子物质具有微弱的抗原性。小分子物质抗体的制备通常需要大分子物质与小分子物质结合，这样导致抗体的表达更无效，更。第二，许多检测方法尤其对于小分子物质的检测中，包括化学诱导转化和层析分离步骤都需要大量的时间。第三，许多诸如此类的检测方法需要使用精密、昂贵的专业分析仪器例如高压液相色谱仪(HPLC)和气相色谱仪(GC/MS)。

因此，需要一种快速、简单的检测方法来弥补这种缺陷。同样需要一种快速、简单的定量检测体液、组织中Hcy的好方法。

发明内容

本检测方法基于免疫的反应格式，但是使用变异的检测物结合酶代替抗体，这种酶充分保留甚至加强其对检测物或即时酶反应转化的产物的亲和力，但是削弱其催化能力。这种方法称为小分子捕获技术，这种酶称为小分子捕获酶。我们可以提供小分子捕获酶和制备小分子捕获酶的方法。小分子捕获酶用于代替单克隆、多克隆、以及任何混合性的抗体，抗体在反应中可以是反应物。底物捕获酶还可以扮演被检测物的竞争性抑制剂，去结合实体例如受体、其它的抗配基和其它的被检测物。因此，底物捕获酶可以代替例如竞争性受体或受体活性调节器用于竞争性抑制反应中。

在检测过程或方法中尤其免疫分析方法中，抗体用于检测目标分析物，象上面所述被底物捕获酶代替抗体。底物捕获酶可以通过充分的削弱或清除其催化反应而不影响或不会很影响修饰酶的对于被检测物的亲和力的技术制备。

这种方法尤其适用于检测一些用于指示新陈代谢疾病，先天性代谢缺陷疾病的物质如：甲状腺机能减退，半乳糖血症，苯丙酮尿症，茶色尿疾病；以及检测一些疾病的标记物例如：血糖水平，胆固醇水平，Hcy水平和其它哺乳动物包括人类的体液和组织中的物质。这种方法也可用于检测食物中的污染，检测食物的营养价值，检测血液。这种方法已经可以实现自动化。

因此，在此方法中，抗体参与反应，其中使用底物捕获酶来代替抗体。这种方法依赖于修饰酶与目标检测物的竞争性抑制反应。

更具体地说，这种方法检测检测样本中的分析物尤其检测小分子物质的步骤：a)变异的被检测结合酶与样本结合，此酶充分保留甚至加强其对检测物或酶反应转化的直接产物的亲和力，但是削弱其催化能力；b)检测分析物或酶反应转化的直接产物结与变异的被检测物结合酶结合物。

小分子物质的检测方法可以检测任何物质包括无机物和有机物分子。做为特殊地是，检测小分子物质分子量大约或小于10,000道尔顿，尤其是分子量大约或小于5,000道尔顿。

无机小分子包括但不局限于无机离子例如；钠、钾、镁、钙、氯、铁、铜、锌、锰、钴、碘、钼、钒、镍、铬、氟、硅、锡、硼、砷离子。有机分子物包括但是不局限于下列项目：氨基酸、多肽、代表性地包含低于10个氨基酸的多肽，核苷，包括低于10个核苷的低聚核苷，维生素，单糖，包括低于10个单糖的低聚糖或脂类。

氨基酸包括但是不限于下列项目：D-型或L-型氨基酸，包括组成自然多肽和蛋白质的氨基酸：  Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)and Val(V)。

核苷酸包括但是不限于下列项目：腺苷，鸟嘌呤核苷，胞啶核苷，胸腺嘧啶核苷，尿嘧啶核苷。核苷包括但是不限于下列项目：AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP and dTTP。

维生素包括但是不局限于下列项目，水溶性维生素例如，维生素B1，核黄素，烟碱酸，泛酸，维生素B6，维生素H，叶酸，维生素B₁₂和维生素C；脂溶性维生素例如维生素A，维生素D，维生素E，维生素K。

单糖包括但是不局限于下列项目，D-型或L-型单糖，三碳糖例如甘油醛，四碳糖例如赤藓糖和苏糖，五碳糖例如核糖，乳胶醛糖，木糖，来苏糖，核酮糖，六碳糖例如阿洛糖，阿桌糖，葡萄糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，果糖，七碳糖例如景天庚酮糖。

脂类包括但是不局限于下列项目，三酰甘油例如三硬脂酸甘油酯，棕榈酸甘油酯，三油精，蜡；磷酸甘油酯例如磷脂酰乙醇胺，卵磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，心磷脂；鞘脂类例如神经鞘磷脂，脑苷脂，神经节苷脂；固醇例如胆固醇和豆甾醇，固醇酸脂；脂肪酸可以是饱和性的脂肪酸例如月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，二十四酸；或者可以是不饱和性的脂肪酸例如棕榈炔酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸。

更具体的表述来说，变异的SAH水解酶，此酶充分保留甚至加强其对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化能力。另外也可以提供方法，结合物，试剂盒和分析物检测的商品化产品，尤其是小分子物质的检测例如：无机离子，氨基酸(Hcy)，多肽，核苷酸，核苷，低聚核苷酸，维生素，单糖(如葡萄糖)，低聚糖，脂类(如胆固醇)，有机酸(如叶酸，胆汁酸，尿酸)。

另外一个表述，如果变异性的SAH水解酶被纯化，变异的SAH水解酶此酶充分保留甚至加强其对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化能力。

例如，变异的SAH水解酶削弱其催化作用是由于在SAH水解酶的NAD结合位点或SAH的催化位点变异或者在两处同时变异；变异的SAH水解酶削弱5’-端SAH的水解作用但是充分保留3’-端的氧化作用；固定的结合SAH，对SAH的酶切速率大约或低于10.0.mu.M，对SAH的催化活性大约或低于0.1S^-1；变异的SAH水解酶有一个或多个可插入，缺失或点突变的位点。更具体地说，变异的SAH水解酶来源于SEQ ID No.1表述的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表述的核酸序列编码的氨基酸但是包括下列一处或多处变异：Phe302 of Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的两次变异，或者在低度，中度或高度的杂交，其酶切速率是野生型的10％最多的可达50％，但是削弱了其催化活性。

单独的核苷酸片段编码上面所述的变异的SAH水解酶，更适宜质粒和向量的表达。可以提供重组干细胞，尤其重组细菌细胞，酵母细胞，真菌细胞，植物细胞，昆虫细胞，动物细胞包括质粒和向量。可以提供利用重组干细胞植被变异性SAH水解酶的方法。

检测Hcy及其相关代谢物的方法。

Hcy，如上所述，是心血管疾病和其他疾病的危险因子，我们可以提供检测方法。

同型半胱氨酸

具体为，被检测的小分子为Hcy，变异的检测物结合酶是变异的Hcy结合酶，此酶充分甚至增强了对Hcy或Hcy的直接转化物的亲和力但是削弱了其催化能力。

检测中的变异的Hcy结合酶的变异包括削弱其催化活性由于在酶与辅酶的结合位点或与非Hcy底物结合位点发生了变异或者在酶的催化活性位点发生了变异。

具体表述，变异的酶为变异的胱硫醚β合成酶，削弱的催化活性由于诱变了胱硫醚β合成酶与吡哆醛5’-磷酸或L-丝氨酸结合的催化位点发生了变异或两个位点均发生了变异。

具体表述，变异的酶为蛋氨酸合成酶，削弱的催化活性是由于诱变的蛋氨酸合成酶催化位点与维生素B₁₂或5-甲基四氢叶酸结合的催化位点发生了变异，或两个位点均发生了变异。更值得一提的是，变异的蛋氨酸合成酶是一种大肠杆菌蛋氨酸合成酶，此酶有下列一个或多个变异：His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，andSer801。

具体表述，变异的酶为蛋氨酶，削弱的催化活性是由于诱变的蛋氨酸合成酶的催化位点，此催化位点与R’SH混合物的结合位点，R’SH是指硫醇，R是烷基或炔基尤其指低链烷基或炔基(1-6个碳原子，尤其指1-3个碳原子，直链或支链)，杂芳环，这里杂原子是指氧原子O，硫原子S，氮原子N或者芳基等上述基团被下列基团取代：烷基或炔基，尤其指低链烷基或炔基，或者hal，或者未被取代尤其指芳基或含有一环或两环、三环的杂环基尤指环中每个环中含有4-7个原子的基团，或者变异发生在以上基团组合中。

更明白地表述，变异的酶为SAH水解酶，变异的SAH水解酶充分保留甚至加强其对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化能力。变异的SAH水解酶在检测体系中的应用包括：削弱其催化活性由于诱变的SAH水解酶的与NAD⁺或SAH水解酶的催化位点或者两个位点均发生了变异；削弱了5’端的水解活性但是充分地保留了3’端的氧化活性；固定的结合SAH，对SAH的酶切速率大约或低于10.0.mu.M，对SAH的催化活性大约或低于0.1S^-1；变异的SAH水解酶有一个或多个可插入，缺失或点突变的位点。更具体地说，变异的SAH水解酶来源于SEQID No.1表述的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表述的核酸序列编码的氨基酸但是包括下列一处或多处变异：Phe302 ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431 H和K426A的两次变异，或者在低度，中度或高度的杂交，其酶切速率是野生型的10％最多的可达50％，但是削弱了其催化活性。

应用SAH水解酶的表述，在样本与变异的SAH水解酶结合之前，氧化型的Hcy要转化为还原型的Hcy，氧化型Hcy转化为还原型的Hcy使用的还原剂可以使用下面列出的还原剂但是不局限于仅仅使用下列还原剂：磷酸三丁醇(TBP)，巯基乙醇(β-ME)，二硫赤藓醇(DTT)，二硫赤藓糖醇，巯基乙酸，谷胱甘肽，腈硼氢钠，NaBH，KBH，金属离子。

具体表述使用SAH水解酶，在样本与变异的SAH水解酶结合之前，样本中的Hcy需要转化为SAH。样本中的Hcy转化为SAH需要未变异的SAH水解酶水解。样本中的SAH与变异的SAH水解酶结合过程中存在着SAH水解酶催化抑制剂例如，neplanocin A或thimersol，但不局限于上述两种物质。

具体表述变异的SAH水解酶的应用，在SAH与变异的SAH水解酶结合之前，需要去除或降解游离的腺苷，这种降解作用可以通过腺苷脱氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黄嘌呤氧化酶来完成。

具体表述变异的SAH水解酶的应用，SAH与变异的SAH水解酶结合时，存在的标记的SAH或其衍生物、类似物竞争性地与SAH水解酶结合，竞争程度与标记的SAH的含量和样本中的SAH的含量相关。必须指出，标记的SAH衍生物或类似物是荧光标记的腺苷半胱氨酸。

具体表述变异的SAH水解酶的应用，变异的SAH水解酶是标记的SAH水解酶，标记的SAH水解酶是由荧光标记。

具体表述，变异的酶为变异的甜菜碱—同型半胱氨酸转甲基酶，削弱其催化活性是由于甜菜碱—同型半胱氨酸转甲基酶与甜菜碱的结合位点及它的催化位点或者两个位点同时发生了变异。

具体表述，Hcy的检测应与其它心血管检测项目结合检测，和或Hcy相关水平例如胆固醇或叶酸联合检测。

叶酸

具体表述，变异的酶为变异的蛋氨酸合成酶。在这个例子中，叶酸是5-甲基四氢叶酸中的元素，变异的含叶酸的结合酶是变异的蛋氨酸合成酶，削弱蛋氨酸合成酶的催化活性是由于其催化位点的诱变，及其结合位点结合维生素B12，Hcy的变异或者这两个位点均发生了变异。

具体表述，其中的叶酸是四氢叶酸，变异的含叶酸的结合酶为变异的四氢叶酸转甲基酶，削弱了四氢叶酸转甲基酶催化活性是由于其催化位点的诱变，及其此结合位点结合丝氨酸的变异或两个位点均发生了变异。

具体表述，含叶酸的物质为5，10-亚甲基四氢叶酸，变异的含叶酸的结合酶为变异的亚甲基四氢叶酸还原酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异。

具体表述，含叶酸的物质是5，10-亚甲基四氢叶酸，变异的含叶酸的结合酶为变异的叶酸多聚谷胱甘肽合成酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合ATP，L-谷氨酸，Mg²⁺的结合位点的变异或者两者同时发生了变异。更具体地说，含叶酸的物质是二氢叶酸，变异的含叶酸的结合酶为变异的二氢叶酸还原酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合NAHPH的结合位点的变异或者两者同时发生了变异。再具体地说，变异的二氢叶酸还原酶是一种乳酸菌酪蛋白的二氢叶酸还原酶，发生了Arg43Ala到Trp21的变异(Basran et al.，Protein Eng.，10(7)：815-26 91997))。

另外的例子，含叶酸的物质是5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-亚甲基FH₄)，变异的含叶酸的结合酶为变异的胸苷酸合成酶，其催化活性的削弱由于催化位点的变异，以及结合dUMP的结合位点变异或两者均发生了变异。更具体地说，变异的胸苷酸合成酶是人类胸苷酸合成酶，下列位点发生了变异：Tyr6His，Glu214Ser，Ser216Ala，Ser216Leu，Asn229Ala和His199X，这里的X是指除了组氨酸以外的任何氨基酸(Schiffer et al.，Biochemistry，34(50)：16279-87(1995)；Steadman et al.，Biochemistry，37：7089-7095(1998)；Williams et al.，Biochemistry，37(20)：7096-102(1998)；Finer-Moore et al.，J.Mol.Biol.，276(1)：113-29(1998)。再具体地说，变异的胸苷酸合成酶是大肠杆菌胸苷酸合成酶，在Arg126Glu发生了变异(Strop et al.，Protein Sci.，6(12)：2504-11(1997))or a Lactobacillus casei thymidylate synthasehaving a V316Am mutation(Carreras et al.，Biochemistry，31(26)：6038-44(1992))。

胆固醇

具体表述，检测中的胆固醇，变异的被检测物结合酶是变异的胆固醇结合酶，此酶充分地保留甚至增强了对胆固醇的亲和力，但是削弱了其催化能力。更具体地说，变异的胆固醇结合酶是变异的胆固醇酯酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合H₂O的位点的变异，或者两者同时变异。再具体地说，胆固醇酯酶是胰胆固醇酯酶，发生变异的位点是Ser194Thr or Ser194Ala(DiPersio etal.，J.Biol.Chem.，265(28)：16801-6(1990))。另外一个具体地说，变异的胆固醇结合酶是胆固醇氧化酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合O₂的结合位点的变异，或者两者同时变异，更具体地说，胆固醇氧化酶是sterolicum短杆菌胆固醇氧化酶，发生变异的位点是：

胆汁酸(盐)

具体地表述，小分子检测物为胆汁酸(盐)，变异的被检测物结合酶是变异的胆汁酸结合酶，此酶充分保留甚至增强了与胆汁酸(盐)的结合能力，但是削弱了其催化活性。更具体地说，变异的胆汁酸(盐)结合酶是变异的3-α-羟基类固醇脱氢酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合NAD⁺结合位点的变异或者两者均发生变异。

糖代谢紊乱的检测Assays for Disorders Associated with Glucose Metabolism

具体地表述，小分子被检测物是葡萄糖，变异的检测物结合酶是变异的葡萄糖结合酶，变异的酶充分保留甚至增强了与血糖的结合，但是削弱了催化活性。更具体地说，葡萄糖结合酶是thermosulfurogenes梭菌葡萄糖异构酶，其变异位点从下列中产生His101Phe，His101Glu，His101Gln，His101Asp and His101Asn(Lee et al.，J.Biol.Chem.，265(31)：19082-90(1990))。另一个具体的变异酶是变异的己糖激酶或葡萄糖激酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合ATP、Mg²⁺或者两者均发生变异。另外一个具体的变异酶是葡萄糖氧化酶，其催化活性的削弱是由于其催化位点的变异，以及结合H₂O或O₂的结合位点发生了变异，或者两者均发生变异。任何与葡萄糖代谢相关的代谢紊乱均可监测。

乙醇

具体地表述，小分子被检测物是乙醇，变异的检测物结合酶是变异的乙醇结合酶，此酶充分保留甚至增强与乙醇的结合力，但是削弱了其催化活性。更具体地说，变异的乙醇结合酶为变异的乙醇脱氢酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合NAD⁺或Zn²⁺的结合位点的变异，或者两者均发生了变异。再具体地说，变异的乙醇脱氢酶是人肝脏乙醇脱氢酶，在下列位点发生变异：His51Gln(Ehrig et al.，Biochemistry，30(4)：1062-8(1991))。另外一个具体说明，变异的乙醇脱氢酶是马的肝脏乙醇脱氢酶，在下列位点发生变异：Phe93Trp或者Val203Ala(Bahnson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，94(24)：12797-802(1997)；Colby et al.，Biochemistry，37(26)：9295-304(1998))。

一些代谢紊乱如痛风病，与尿酸代谢有关。

具体地表述，小分子检测物是尿酸，变异的检测物结合酶是变异的尿酸结合酶，此酶充分保留甚至增强与尿酸的结合力，但是削弱了其催化活性。更具体地说，变异的尿酸结合酶是变异的尿酸氧化酶，其催化活性的削弱由于其催化位点的变异，以及结合O₂，H₂O，Cu的结合位点的变异或者两者均发生变异。再具体地说，变异的尿酸氧化酶是兔尿酸氧化酶，其变异位点为下列位点：H127Y，H129Y和F131S(Chu et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，804：781-6(1996))。

所有上面所述中，有代表性的检测样本是体液或组织包括但是不限于下列项目：血液，尿液，脑脊液，滑膜液，羊水，组织细胞如活检组织细胞。再具体地说，体液指血液或尿液。更具体地说，血液应该分离出血浆或血清。

在这里提到的结合物包括：a)变异的检测物结合酶，此变异酶充分保留甚至增强其亲和力但是削弱其催化活性；b)试剂或变异的检测结合酶与检测物或者检测物的酶转化物结合的方法。更具体地说，检测物或检测物的酶转化物与变异的检测物结合酶使用标记检测物，检测标记的检测物直接转化物或其衍生物或类似物，检测标记的变异的检测物结合酶。再具体地说，检测中的结合物是Hcy甚至包括检测胆固醇和或叶酸的试剂。

最后，可以提供试剂盒和检测说明包括上面提到的结合物和及其说明书。生产的程序包括标记的变异的酶可以指示检测系统中使用的酶，也可指示检测系统中包含的酶类。

特殊的合成物，结合物，试剂盒和检测说明书，尤其对于小分子物质在下面分段介绍。

A.说明

除非另外说明，这里所用的所有的技术、科学术语与普通技术领域的理解有相同的含义。所有专利，申请表，公布的表格以及其他出版物和序列、其他数据全部由GenBank公司提供。

这里所用的分析物指能特异结合到酶上的分子，它即可作为辅酶，也可作为辅助因子或者底物。

这里所用的酶指一种特殊的蛋白质，它可以催化和促进特定的代谢反应。一般地，酶是作为催化剂，但在这里，还包括酶在反应中被修饰。酶被修饰后可使其催化活性清除或相当大的清除。有些酶并不被如此修饰。

这里所用的分析物结合酶是指用分析物作为其辅酶，辅助因子，唯一底物或者底物之一的酶。如：同型半胱氨酸结合酶指用同型半胱氨酸作为它的辅酶，辅助因子，唯一底物或者底物之一的酶。同型半胱氨酸结合酶包括SAH水解酶，胱硫醚，beta-合成酶，蛋氨酸合成酶，甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶，蛋氨酶，用不改变酶活性的保守氨基酸替代作用围绕同型半胱氨酸结合酶。适当的氨基酸的保守替代是众所周知的技术，氨基酸的保守替代可以不改变变异后的物质的生物活性。这是科技界所认可的。(see，e.g.，Watson et al.Molecular Biology of theGene，4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。

氨基酸替代如表1

    表1

    原始残基            保守替代

    Ala(A)              Gly；Ser

    Arg(R)              Lys

    Asn(N)              Gln；His

    Cys(C)              Ser

    Gln(Q)              Asn

    Glu(E)              Asp

    Gly(G)              Ala；Pro

    His(H)              Asn；Gln

    Ile(I)              Leu；Val

    Leu(L)              Ile；Val

    Lys(K)              Arg；Gln；Glu

    Met(M)              Leu；Tyr；Ile

    Phe(F)              Met；Leu；Tyr

    Ser(S)              Thr

    Thr(T)              Ser

    Trp(W)              Tyr

    Tyr(Y)              Trp；Phe

    Val(V)              Ile；Leu

其它由经验决定或已知的保守替代也是允许的。

这里所用的氨基酸是指各种氨基酸序列，可根据常规已知的3字母缩写或1字母缩写识别，不同DNA片段中的核苷可根据通用的标准单字母法指定。

这里所用的变异分析物结合酶指修饰酶和底物捕获酶，其在反应过程中能充分保留甚至增强分析物或分析物酶直接产物的结合力，具有代表性的相对于野生型配体至少保留结合力的10％，适宜地，保留了少于50％的结合力，更适宜地保留了对分析物或分析物酶的直接转化产物结合力的60％，70％，80％，90％，甚至100％，或者比其野生型配体具有更高的结合力。这里的变异分析物结合酶如“底物诱导酶”，特定结合于所选择的分析物或目标分子，但并不能促进它们的转化。

分析物酶的直接转化产物通过特定分析物结合酶催化分析物而得到，例如SAH水解酶的直接转化产物是SAH，胱硫醚β-合成酶的Hcy酶直接转化产物是胱硫醚，蛋氨酸合成酶和甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶的直接转化产物是蛋氨酸

这里所指的评价包括对分析物浓度和数量绝对值的定量的和定性的判断，例如样本中的同型半胱氨酸底物复合物，可通过其指标数，所占比率，百分比，以及视觉或者其它数值指标表示样本中分析物的水平，评定可以是直接或间接的。

这里所指的削弱催化活性是指变异分析物结合酶用做假抗体时仅保留非常低的催化活性，即在免疫实验中以小分子代替抗体。每个测试中所需降低催化活性的准确度可由以往的经验决定。有代表性的，酶类可保留其野生型所有催化活性或者催化活性之一的50％，或者不到50％；可取地，变异分析物结合酶仅保留不到其野生型总催化活性或催化活性之一的40％，30％，20％，10％，1％，0.1％，或0.01％，更适宜的，变异分析物结合酶丧失其所有催化活性或其催化活性之一。例如需要保留其催化活性或进一步降低的催化活性，催化抑制剂可以影响反应步骤，这些催化抑制剂包括重金属，螯合剂或其它物质。

这里所指的大分子指不用结合其他分子就能产生与大分子结合的抗体。

这里所指的小分子指不经高度聚合或结合高分子或经辅佐作用就不能产生能与其结合的抗体。小分子的分子量约为10,000 D或小于10,000 D，甚至一些小分子的分子量为5,000 D或少于5,000 D。

这里所指的无机分子指不含碳氢化合物的分子族。这里所指的有机分子指含碳氢化合物的分子族。这里所指的维生素指生物体所需有机物，大部分的维生素可作为某些辅酶的组成成分。这里所指的生物分子通常指构成生物体的有机化合物。这里所指的脂质指非水溶性的，油状的物质，它可溶于非极性有机溶剂中，如氯仿。

这里所指的同型半胱氨酸指由分子式为HSCH2CH2CH(NH2)COOH.的分子构成。Hcy由蛋氨酸脱甲基生成，是蛋氨酸生成半胱氨酸的中间产物，Hcy包括游离Hcy和结合Hcy，Hcy能结合蛋白质，肽，自身或二硫化物结合物的硫醇。这里所指的SAH水解酶指普遍存在于真核生物中的一种酶，在一些原核生物中也可发现。它可催化SAH水解为Hcy和Ado，SAH水解酶同时也促进Hcy和Ado合成SAH。SAH水解酶有各种催化活性，它的辅酶是NAD+/NADH.，在水解作用方面，首先包括SAH的3-羟基族被NAD+(E-NAD+)氧化，接着将L-Hcy的β基传给3′-酮-4′，5′-didehydro-5′-脱氧-Ado。5’-端的水基团的紧密结合的中间产物提供给3’-酮-腺嘌呤的氢离子，从而使得3’-酮-腺嘌呤被NADH结合的酶还原为腺嘌呤。

这里所指的SAH水解酶催化抑制剂是指抑制SAH水解酶一个或整个催化活性的作用物，例如，3′-氧化活性，5′-水解活性或3′-还原活性，但不影响SAH水解酶对Hcy和/或SAH的亲和力。

这里所指的胱硫醚-β-合成酶指不可逆的催化Hcy和丝氨酸合成胱硫醚的酶，胱硫醚-beta.-合成酶的辅酶是磷酸吡哆醛，用不改变酶活性的保守氨基酸围绕胱硫醚-beta.-合成酶。

这里所指的蛋氨酸合成酶是指不可逆催化Hcy和5-甲基四氢酸(5-CH₃-THF)生成蛋氨酸的酶，胱硫醚-β-合成酶的辅酶是维生素B₁₂，用不改变酶活性的保守氨基酸围绕蛋氨酸合成酶。

这里所指的甜菜碱-同型半胱氨酸-转甲基酶指不可逆催化Hcy和甜菜碱生成蛋氨酸和二甲基-氨基乙酸的酶。用不改变酶活性的保守氨基酸围绕甜菜碱-同型半胱氨酸-转甲基酶。

这里所指的蛋氨酶是指可催化S-替代氨基酸生成α.，β-和α，.leftbrkt-top-清除，也可催化各种β-和左端brkt-top-置换反应的酶，根据下列平衡RSCH₂CH(NH₂)COOH+R′SH平衡R′SCH₂CH(NH₂)COOH+RSH(β-转换)和RSCH₂CH₂CH(NH₂)COOH+R′SH平衡R′SCH₂CH₂CH(NH₂)COOH+RSH(.leftbrkt-top-exchange)，R′SH代表烷烃或取代硫基。独立的R和R′从烷基，芳香基，炔基，环烷基，杂芳基，链烯基，氨基酸，蛋白质或其混合物中被选择。典型的，被替代或不替代的R和R′包少于50个原子。碳链可以是直链，有支链或环状的。杂环原子含S，N，O。芳香基和杂芳基或其它环族可含有一个环，两个环或者更多环。

这里所指的腺苷脱氨酶指催化次黄苷脱氨基生成腺苷的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸围绕腺苷脱氨酶。

这里所指的嘌呤核苷磷酸化酶指可催化水和次黄苷生成次黄嘌呤和D-核糖的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸替代作用围绕嘌呤核苷磷酸化酶。

这里所指的黄嘌呤氧化酶指催化次黄嘌呤生成尿酸和黄嘌呤的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸替代围绕黄嘌呤氧化酶。

这里所指的叶酸族指叶酸或维他命B族，化学式为N-[4-[[2-氨基1，4-二氢-4-氧-6-蝶啶)甲基]氨基]-benzxoyl]-L-谷氨酸或它的衍生物。叶酸衍生物包括二氢叶酸脱氢酶，四氢叶酸脱氢酶，5-甲基-四氢叶酸和5，10-亚甲基-四氢叶酸。

这里所指的四氢叶酸转甲基酶指一种可催化四氢叶酸和丝氨酸生成5，10-亚甲基-四氢叶酸和氨基乙酸的酶。用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代围绕四氢叶酸转甲基酶。

这里所指的亚甲基四氢叶酸还原酶指可催化5，10-亚甲基-四氢叶酸生成5-甲基-四氢叶酸的酶，用的不改变酶活性的保守氨基酸通过替代作用包围亚甲基四氢叶酸还原酶。

这里所指的叶酸多聚谷胱甘肽合成酶指可催化5，10-亚甲基四氢叶酸-双谷氨酸衍生物的生成的酶，其催化5，10-亚甲基四氢叶酸，L-谷氨酸盐和ATP反应生成ADP和磷酸。它的辅助因子是Mg.2+，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代围绕叶酸多聚谷胱甘肽合成酶。

这里所指的二氢叶酸还原酶指催化二氢叶酸，NADPH和H..+生成四氢叶酸和NADP+的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸通过置换反应包围二氢叶酸还原酶。

这里所指的胸苷酸合成酶是指催化5，10-亚甲基-四氢叶酸和dUMP生成二氢叶酸和dTMP的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代作用包围胸苷酸合成酶。

这里所指的胆固醇酯酶是指催化胆固醇和水生成脂肪酸和胆固醇酯的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代作用包围胆固醇酯酶。

这里所指的胆固醇氧化酶是指催化氧和胆固醇生成胆固醇-4-en-3-one和水的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代作用包围胆固醇氧化酶。

这里所指的胆汁酸是指胆固醇在肝内生成的酸性甾酮，胆汁酸随胆汁进入小肠，脂溶性维他命有利于脂质的吸收，人体中胆汁酸含量最大的是胆酸胆酸盐指胆汁酸的盐类，人体胆酸盐大部分的是肝胆酸盐和牛黄胆酸钠。

这里所指的3-α-羟基-类固醇脱氢酶是指可催化3-alpha-羟基-类固醇和NAD+生成3-氧-胆汁酸和H.+和NADH的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代作用包围3-alpha-羟基-类固醇脱氢酶。

这里所指的葡萄糖异构酶指一种可催化D-葡萄糖和D-果糖之间的相互转化的酶，用保守的不改变其活性的氨基酸替代作用包围葡萄糖异构酶。

这里所指的己糖激酶或葡萄糖氧化酶是指可催化α.-D-葡萄糖和ATP生成D-葡萄糖-6-磷酸的酶，己糖激酶或葡萄糖氧化酶辅助因子是Mg.²⁺，用不改变酶活性的保守氨基酸替代包围己糖激酶或葡萄糖氧化酶。

这里所指的葡萄糖氧化酶是一种可催化葡萄糖，水和氧生成葡糖酸的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸替代包围葡萄糖氧化酶。

这里所指的乙醇脱氢酶催化乙醇和NAD⁺生成乙醛，NADH和H⁺的酶，用不改变酶活性的保守氨基酸替代包围乙醇脱氢酶。

这里所指的尿酸盐氧化酶和尿酸酶催化尿酸，氧和水生成尿曩素的酶，辅助因子是铜，用不改变酶活性的保守氨基酸通过替代包围尿酸盐氧化酶和尿酸酶。

这里所指的血清指血液除去血球和纤维蛋白的液体部分。它区别于循环血中的血浆。

这里所指的血浆指一种液体组织，是血液中非细胞成分液体。它区别于离心做得的血清。

这里所指的高纯度″substantially pure″是指高度相似，高度均一通过一些检测纯度的标准方法，如薄层层吸法，凝胶电泳和高效液相层吸法不能检测到杂质，或者指进一步纯化时不能检测到其物理和化学性能的改变，如它的酶活性和生物活性。。。。但是化学纯度高的物质可以是立体异构体，同分异构体的混合，因此，进一步纯化可以增强合成物的特异性。这里所指的生物活性指化合物，合成物，混合物。生物活性也包括化合物，合成物，混合物的疗效和药物活性。生物活性在体外的试验可观察到，如利用荧光素酶的氧化活性氧化底物，可以产生荧光。

这里所指的受体指可结合特定配体的一种分子，受体可以是自然的或人工合成的。受体也可以作为抗-配体，受体和抗-配体可以相互转变。受体可单独使用或与其它种类结合为聚合体使用。受体可与其结合物进行直接/间接的共价或非共价结合，或者是物理性结合。受体包括抗体，胞膜受体或胞内受体，单克隆抗体，药物，多核苷酸，核酸，肽，辅助因子，外源凝集素，糖，多糖，细胞，细胞膜，细胞器。

受体的例子和应用如下

a)酶：特异运输供微生物生存的蛋白质或基础酶，也可作为抗体(配体)的结合目标。

b)抗体：通过辨认抗体上与抗原表位结合的位点，确定拟抗原表位序列，可以发展疫苗或其它诊断产品以及自身免疫疾病治疗的药物。

c)核酸：配体的鉴定，如蛋白质，RNA，结合点。

d)具有催化作用的多肽：聚合体，多肽，具有促进化学反应的能力。多肽通常对一个反应物或反应中间产物和活性功能基团至少有一个特异结合点。[see，e.q.，U.S.Pat.No.5,215,899]。

e)激素受体：与受体有高度亲和力的配体可用于激素替代疗法的开发，例如控制血压药物的开发。

f)麻醉剂受体：测定结合大脑镇静受体的配体可用于开发吗啡和相关的低成瘾药物。

抗体：包括抗体片段，如组成轻链和重链可变区的Fab片段。

类人化抗体：修饰包含“人”氨基酸序列的抗体以便使其不能激发人体的免疫反应。例如单克隆抗体表达的杂交瘤通过基因重组技术所得而来，此技术表达的抗体的不变的氨基酸区域是人类抗体的区域。

重组产品：利用分子生物学的DNA基因重组技术生成的蛋白质

非常相同″substantially identical″：指产品非常相似，特性几乎不变，因而，可用非常相似的产品取代这种产品。相同的，等价的″equivalent，″：用于两个序列的核酸，是指这两个序列的核酸可以编译出相同序列的氨基酸或相同的蛋白质，也包括中度严格或高度严格条件下编码所需蛋白质的杂交。相同的，等价的″equivalent″：用于指两种蛋白质或肽类，指两种蛋白质或肽类这含有充分相同的氨基酸序列只有被保守的氨基酸所取代，不会完全改变蛋白质或肽类的活性或功能[see，e.g.，Table 1，above]相同的，等价的″equivalent″：指性能，特点时，特性不一定相同程度的出现(两个肽分子的相同类型的酶活性可能表现出不同的速度)，但是活性非常相似。另外，可指两列核苷酸的杂交能力。适宜的可以少于25％的错配，较适宜的，少于15％的错配，甚至可少于10％，最适宜的，在高度严格条件下杂交，两个相对氨基酸之间没有错配。

杂交的严格性由错配百分率决定，如下

1)高度严格：0.1.times.SSPE，0.1％SDS，65℃。

2)中度严格：0.2.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。

3)低严格性：1.0.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。

严格度equivalent stringencies可以通过选择缓冲液，盐类和温度来获得。

充分地，非常的″substantially″：文章中相同的，相应的或类似的改变是指至少70％，更进一步指至少80％，再进一步指至少90％，最多指95％。

合成物：指两种或更多种产物或化合物组成的一种混合物，可以是一种溶液，悬乳液，粉剂，糊剂，水剂或是它们的任意组合。

结合：指两种或更多物质之间的结合作用。

流体：指任何能流动的成分，包括，半固体，糊剂，溶液，水剂，凝胶体，洗剂，膏体和其他混合物的形态。

载体(质粒)：指在细胞内引入异种DNA进行基因的转录或表达。例如质粒，重组病毒或其他载体可以插入适合的宿主细胞中，引起DNA的克隆。载体基因的表达包括在原核细胞和/或真核细胞和其他残余游离基因或那些并入宿主细胞的基因。

启动区或启动因素：指可控制DNA或RNA转录的DNA或RNA片段，启动区包含能被RNA聚合酶识别，结合并启动转录的特定序列。启动区的一部分作为启动子。另外，启动区还包括调节这些RNA聚合酶识别，结合并启动转录活性的序列。受体受自然法则的调控，效仿启动子被用于原核生物，包括抗菌素T7和T3启动子等。

有效连接和有效结合：指核酸序列影响和调节的DNA的功能的关系，核酸序列如，启动子，增强子，转录和翻译的终止位点和其它信号序列。例如DNA与启动子的有效连接是指DNA和启动子的物理和功能关系，RNA聚合酶结合DNA启动区，通过特异辨认并结合启动子，启动DNA的转录。在体外转录或表达中为了使其达到最优化，需要除去，增加，或改变克隆5′-端非翻译部分从而去除额外的、潜在地、不恰当的具有选择性的翻译起始密码子或其它序列，这些序列可能干扰或降低基因的表达，转录或翻译。做为可选择的，核糖体结合点(see，e.g.，Kozak，J.Biol.Chem.，266：19867-19870(1991))直接插入起始密码的5′-端可以增强表达。上述所希望的修饰也可根据经验进行改变。

样本指实验中的分析物，可以是生物样本，如生物的体液样本或组织样本。体液样本包括尿液，血液，血浆，唾液，精液，大便，痰，脑脊液，泪液，黏液，羊水等。生物组织是由细胞和细胞间质构成的集合体，可构成人类，动物，植物，细菌，真菌或病毒的结构，包括接缔组织，上皮细胞，肌肉和神经组织，也包括瘤，器官，淋巴结，动脉等。

对于保护基团，氨基酸和其他化合物的缩写，如果不另行指出，均根据其通用公认的缩写或IUPAC-IUB组织关于生物化学命名法。

.B.检测项目的方法

这里提供检测样本中项目的方法。任何把抗体作为一种试剂的检测都可以用这里给出的方法加以修改：用一种已被修改的酶来代替该抗体，这样，它结合检测项的能力得以保持，而催化活力大大降低(如，底物捕获酶)。

这里提供的检测步骤包括：a)样品与结合于检测项的变异或修改酶接触；和b)用变异检测项结合酶探测检测项或直接检测项酶转化产物间的结合。变异或修改酶仍然保留了结合力，对检测项或直接检测项酶转化产物的结合力较原始型或未修改酶更为提高，但催化活性被削弱。

1.检测项

任何能够作为辅酶、辅助因子或底物特异结合于酶的检测项，都可以用这个刚宣布的方法检测。检测项可以是任何分子，包括生物大分子和小分子、配子、反配子和其他种类。最好是小分子。比如，该小分子检测项是个无机分子，那么最好是个无机离子，如钠、钾、镁、钙、氯、铁、铜、锌、锰、钴、碘、钼、钒、镍、铬、氟、硅、锡、硼或砷离子。

另一个特别的例子是，小分子检测项是个有机分子，那么最好是氨基酸、少于10个氨基酸的多肽、维生素、单糖、少于10个单糖的低聚糖或脂类。

本法可检测所有氨基酸。例如，可检测D-和L-氨基酸。例外，还可检测所有的自然界多肽和蛋白质基团，包括Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)and Val(V)。以及自然界氨基酸的所有衍生物，如Cys的衍生物Hcy。

本法可检测所有的核苷。如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

本法可检测所有的核苷酸。这样的例子有，AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP和dTTP。例外，还可检测所有的少于10个这样的或其他核苷酸的寡核苷酸。本法可检测所有的维生素。如水溶性维生素有B1、核黄素(B2)、烟酸、泛酸(B3)、B6、生物素(H)、叶酸、维生素B12和抗坏血酸(C)，同样检测脂溶性维生素如，维生素A、D、E和K。

本法可检测所有单糖，无论D-还是L-单糖，醛糖还是酮糖。单糖的例子有丙糖如甘油醛、四糖如赤藓糖和苏糖，戊糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和核酮糖，己糖如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖和果糖，庚糖如景天庚酮糖。

本法可检测所有的脂类。包括三酰甘油如(三)硬脂酸甘油酯、三甘油棕榈酸酯、甘油三油酸酯、腊，磷脂如磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心磷脂，鞘脂类如鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂，固醇类如胆固醇和豆甾醇以及脂肪酸酯甾酮。脂肪酸可以是饱和脂肪酸如十二(烷)酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和二十四烷酸，或可以是不饱和脂肪酸如棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸。

还有其他特别的实例中，被检测小分子的分子量大约或小于10,000道尔顿。

分子量等于或小于5,000道尔顿更佳。

本法可以检测的(但不限于此)项目还包括，Hcy、叶酸族、胆固醇、葡萄糖、乙醇和尿酸。

2.变异检测项结合酶(“底物捕获酶”)

任何能保留结合力或降低催化活力的变异检测项结合酶都可以用在本法。例如，如果Hcy作为待检测项，可使用变异Hcy结合酶如变异胱硫醚-β-合酶、变异蛋氨酸合酶、变异甜菜碱-同型半胱氨酸转甲基酶、变异蛋氨酸酶和变异SAH水解酶。

用常规变异方法可准备有理想特性的变异酶。变异残余可被系统变异残余识别为不同残余，且把催化活性降低理想的并对特殊底物保留有亲和力的识别出来。另外，变异也可能基于预知或已知的酶3D结构，包括预知各种变异的影响(见，如Turner et al.(1998)Nature Structural Biol.5：369-376；Ault-Richie et al.(1994)J.Biol.Chem.269：31472-31478；Yuan et al.(1996)J.Biol.Chem.271：28009-28016；Williams et al.(1998)Biochemistry 37：7096；Steadman et al.(1998)Biochemistry37：7089-7095；Finer-Moore et al.(1998)J.Mol.Biol.276：113-129；Strop et al.(1997)Protein Sci.6：2504-2511；Finer-Moore et al.(1996)Biochemistry 35：5125-5136；Schiffer et al.(1995)Biochemistry 34：16279-16287；Costi et al.(1996)Biochemistry35：3944-3949；Graves et al.(1992)Biochemistry 31：15-21；Carreras et al.(1992)Biochemistry 31：6038-6044)。这些预知也可以由化学计算技巧中取得。因此，对任何选定的酶，再试验决定变异需要抑制催化活力而保留结合力。

a.核酸编码检测项结合酶

核酸编码检测项结合酶可由已知方法中取得。检测项结合酶的已知核酸序列可被用于从自然界或其他来源分离核酸编码检测项结合酶。另外，完整或部分的核酸编码检测项结合酶可通过已知序列化学合成或商业及其他途径获得。

真核细胞和原核细胞可作为核酸编码检测项结合酶的核酸来源。其DNA可由已知的克隆DNA(如DNA“库”)的标准程序、化学合成、cDNA克隆或染色体DNA或片断克隆、从目标细胞提纯取得。(见，例如，Sambrook et al.，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.；Glover，D.M.(ed.)，1985，DNA Cloning：A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，II.)。从染色体DNA中克隆提取除了编码区，还可含有特定的和内DNA区；从cDNA或RNA中克隆提取仅含有外部序列。不管来源哪里，基因总按分子克隆为基因繁殖的适当载体。

从cDNA中基因分子克隆，cDNA可由已知的总细胞RNA或mRNA产生。也可从染色体DNA中获得基因，DNA片断即由染色体产生(如，用限制酶或机械剪)，有些DNA可编码成理想基因。然后，线性DNA片断可通过标准技术被重排分离，包括但不限于，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱状色谱分离。

一旦生成DNA片断，识别含所有或部分检测项结合酶的基因的特异性DNA片断，有很多方法来完成。

分离一个检测项结合酶基因的较好方法是用聚合酶链反应(PCR)，从染色体或cDNA库，或未统一入库的染色体DNA或cDNA扩增理想的检测项结合酶序列，寡核苷酸引物与检测项结合酶序列杂交后可作为PCR的引物。

另外，一部分(任何物种的)检测项结合酶基因或特异性RNA、或其片断可被纯化(或寡核苷酸合成)和标记，生成的DNA片断可用核酸杂交到标记的探针来过筛。(Benton，W.and Davis，R.，1977，Science 196：180；Grunstein，M.And Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961)。那些与探针同族的DNA片断则杂交。检测项结合酶核酸也可被表达克隆识别和分离，比如利用选择性抗检测项结合酶抗体。

除了以克隆或扩增来获得检测项结合酶DNA，包括但不仅限于，由已知检测项结合酶核酸序列化学合成，或使cDNA变成具有检测项结合酶编码的mRNA。任何已知的适当的方法都可以使用。

得到克隆之后，其特征可由核酸序列(用已知方法)以及与已知检测项结合酶序列比较来证实。DNA序列分析可用已知的方法，包括但不限于，Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65：499-560)，the Sanger dideoxy方法(Sanger，F.，etal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463)，使用T7 DNA聚合酶(Tabor andRichardson，U.S.Pat.No.4,795,699)，使用自动DNA序列器(e.g.，AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)。

与检测项结合酶核酸或核酸编码检测项结合酶衍生物杂交的核酸，可在低、高或中等严格条件下，用核酸杂交分离出来。(Shilo and Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6789-6792).

b.选择和生产变异检测项结合酶

一旦获得核酸编码检测项结合酶，这些核酸可根据检测项结合酶被诱变、过筛和/或选择，要求检测项结合酶保留或增强对检测项或检测项酶直接转化产物的结合力，而削弱了催化活力。插入、剪除或点突变都可以用来使核酸编码出检测项结合酶。可使用已知的突变技术，包括但不限于，体外定点诱变(Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem 253：6551)，使用TAB.RTM.接头(Pharmacia)，含突变的PCR引物，等等。不同的基因产物表型检测可在突变发生后进行。

需要时，定点诱变程序可利用提供单链及双链DNA的载体。一般来说，带这样载体的突变程序如下：合成突变引物，如补充欲改变序列的引物，但包括一个或几个改变的、添加的或去除的碱基。引物在体外进行DNA聚合酶扩展，经过一些附加操作之后，双链DNA被转到细菌细胞中。接着，用各种方法识别理想的突变DNA，理想的蛋白从含突变序列的克隆中纯化出来。对于长序列，经常需要额外的克隆步骤，因为在那些载体上插入长序列(长于2,000碱基)不易稳定。很多生物技术公司提供已知的定点突变程序，例如美国的Life Science，Inc.(ArlingtonHeights，III.)和Stratagene Cloning Systems(La Jolla，Calif.)。

关于检测项结合酶的结构-功能资料，可用于检测项结合酶的突变和选择，该酶应保留或增强对检测项酶或检测项酶直接转化产物的结合力而削弱催化活性。例如，突变可对其辅酶、辅助因子、非检测项底物的酶结合位点或突变酶催化点或其合成物上形成。

一旦一个突变检测项结合酶具有理想特性，如保留或增强了对检测项酶或检测项酶直接转化产物的结合力而削弱催化活性，被识别出来，该突变检测项结合酶可以由任何已知的方法获得，包括重组表达、化学合成或两者综合。突变检测项结合酶最好由重组表达取得。

为了重组表达，突变检测项结合酶基因或部分基因被插入到适当的克隆载体，在特殊的宿主细胞上表达。大量已知的载体宿主都可以使用。可能的载体包括但不限于，质体或被修改的病毒体，但载体系统必须和使用的宿主细胞相兼容。这样的载体包括但不限于，噬菌体如λ衍生物，或质体如pBR322或pUC质体衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。克隆载体的插入，例如，可通过把DNA片断绑入具有相应粘着点的克隆载体。但是，克隆载体上如果不存在相应的DNA片断粘着点，DNA分子末尾可被酶解改变。另外，绑入核苷(接头)序列到DNA粘着点可产生理想位点；这些被绑入的接头可包括特殊的编码限制核酸内切酶识别序列的寡核苷酸。重组分子可通过转化、转染、传染、电穿孔等方法导入宿主细胞，这样就产生了很多的基因序列。

另一种方法中，理想的基因用“鸟枪”法插入到适当的克隆载体后可被识别并分离。在插入到克隆载体之前，理想基因可先增殖，例如按大小分级。

在一些特例中，带重组DNA分子与被分离的突变检测项结合酶基因、cDNA或合成DNA序列的宿主细胞的转化使基因成倍复制。这样，转化株成长、重组DNA分子自转化株分离出来，并在必要时，从分离的重组DNA上找回插入基因，可以获得大量基因。

编码突变检测项结合酶或功能活性类似物或片断或其他延伸物的核苷序列，可被插入到一个适当的表达载体，如一个含有插入蛋白译码序列的转录和翻译必要因子。必要的转录和翻译信号也可由本族突变检测项结合酶基因和/或其旁侧区提供。不少宿主-载体系统可利用于蛋白译码序列表达。这些系统包括但不限于，感染了病毒的哺乳动物细胞系统(如牛痘病毒、腺病毒等)；感染了病毒的昆虫细胞系统(如杆状病毒)；微生物如带酵母载体的酵母菌，或转化了耐药力和特性的细菌。根据利用的宿主-载体系统，可以使用适当的转录和翻译因子。

前面描述过把DNA片断插入到载体的方法，可以用于建立含有未知的含适当转录/翻译控制信号和蛋白译码序列的基因表达的载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(基因重组)。编码一个突变检测项结合酶或多肽的核酸表达，可用第二个核酸序列来调整，这样，突变检测项结合酶或多肽就被表达到经重组DNA分子的宿主中。例如，一个突变检测项结合酶的表达用被促进因子/增强因子来控制。可用来控制突变检测项结合酶表达的促进因子包括但不限于，SV40早期促进区(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)，含于鲁斯氏肉瘤病毒的重复3′长端促进因子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22：787-797)，疱疹腺嘧啶激酶促进因子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)，金属硫蛋白基因的调整序列(Brinster et al.，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶促进因子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)，或tac促进因子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)；也见于″Useful proteins from recombinant bacteria″in ScientificAmerican，1980，242：74-94；酵母或其他真菌的促进因子如Gal4促进因子，ADC(乙醇脱氢酶)促进因子，PGK(磷酸甘油激酶)促进因子，碱性磷酸酶促进因子和某些动物的转录控制区。

例如，可使用载体如含有与核酸编码有可用连接的促进因子，具有一个或多个的复制起点，也可以是一个或多个可选的标记(如一个抗生素耐药基因)。

具体地表述，表达构造可用亚克隆一个突变检测项结合酶译码序列为EcoRI限制位点，三个pGEX载体中任意一个。(Glutathione S-Transferase expression vectors；Smith and Johnson，1988，Gene 7：31-40)。这使突变检测项结合酶的表达可以在正确的读码时，由亚克隆生产。

含一个突变检测项结合酶基因插入的表达载体可被三种普通途径识别：(a)核酸杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺少，和(c)插入序列的表达。第一种途径中，突变检测项结合酶基因插入到表达载体的存在，可用含与插入突变检测项结合酶同源的探针，通过核酸杂交来检测。第二种途径中，重组载体/宿主系统可被识别和选择出来，基于某些“标记”基因功能的存在或缺少(如腺嘧啶激酶活性，抗生素耐药性，转录表型，杆状病毒的封闭体型等)，在载体中插入突变检测项结合酶基因使这些功能产生变化。例如，如果突变检测项结合酶基因插在载体的标记基因序列内，含突变检测项结合酶插入的重组无可因缺少标志基因功能而被识别出来。第三种途径中，重组表达载体可由分析突变检测项结合酶产物通过重组表达识别出来。举例说明，这些分析可基于在体外分析系统中，突变检测项结合酶的物理或功能特性，如与抗突变检测项结合酶抗体结合。

一旦一种特定的重组DNA分子被识别和分离出来，可用多种已知的方法来增殖它。一旦建立起适宜的宿主系统和生长环境，重组表达载体就可被定量增殖和准备。如前所述，可用的表达载体包括但不限于一下载体和其衍生物：人体和动物病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)，以及质体和粘粒DNA载体和其他。

另外，宿主细胞株可被选择，按照特殊需要方式调整插入序列的表达，或修改和处理基因产物。从某些促进因子来的表达，在某些引导物存在时可被提高。这样，基因工程突变检测项结合酶的表达可被控制。而且，不同的宿主细胞对蛋白的翻译和后翻译的处理和修改(如糖基化、磷酸化)有不同的特性和特殊机制。适当的细胞线或宿主系统可被选用以保证外来蛋白表达的理想修改和处理。例如，在细菌系统中表达可以用来生产无糖基化核心蛋白产物。在酵母中表达则生产糖基化产物。在适当的动物细胞中表达可以用来保证异体蛋白的“本地”糖基化。而且，不同的载体/宿主表达系统可以影响反应处理到不同程度。

3.样本收集

以上所述的方法可以用来分析任何样本检测项。在此例中，待测标本是从哺乳动物，尤其是人的生物学样本，如体液或组织。生物学体液包括但不限于，尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、毛发和其他角蛋白样本、脑脊液、眼泪、粘液和羊水。生物学组织可能包括但不限于，细胞集合，通常为一种特别的细胞和其用以形成支架结构的胞间物质，而形成的人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒的结构，包括关节、上皮、肌肉和神经组织、器官、肿瘤、淋巴结、动脉以及单个细胞。在一个特例中，待测体液为尿液。在另一个特例中，待测体液为学业。血液样本最好再分离为血浆或血清成分。

血清或血浆可用任何已知的方法从采集的血液中取得。在一个特例中，血清和血浆通过离心采集血获得。离心最好在有封闭剂的条件下进行，封闭剂具有比血清和血浆重而比血球轻的重力特性，这样血球会沉底，而经过离心，封闭剂在血清或血浆之下、血球之上形成一个阻断层。封闭剂可用于但不限于以下过程，苯乙烯粉(Japanese Patent Publication No.38841/1973)、交链聚合水凝胶小球或盘(U.S.Pat.No.3,647,070)、表面带抗栓剂或湿润剂的聚苯乙烯小珠(U.S.Pat.No.3,464,890)和硅树脂液(U.S.Pat.Nos.3,852,194 and 3,780,935)。最好的情况是，封闭剂为非替代的丙烯酸烷和/或异丁烯酸烷聚合物，其烷链应不超过18个碳原子，聚合物重量约为1.03至1.08且在切变速度约1s^-1粘度为5,000至1,000,000cps(25℃测量)(U.S.Pat.No.4,140,631)。

具体地表述，过筛血液区的血清或血浆。血液最好用一层平均直径约0.2-5mu密度约0.1-0.5g/cm³的玻璃纤维过滤，分离的血浆或血清总量最多约为玻璃纤维吸收量的50％；收集穿过玻璃纤维层的血清和血浆(U.S.Pat.No.4,477,575)。用灌注了聚丙烯酯衍生物和聚乙烯乙二醇的平均直径0.5-2.5 mu的玻璃纤维也不错(U.S.Pat.No.5,364,533)。聚丙烯酯衍生物为丁基丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物，以及(a)丁基丙烯酸聚合物，(b)甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物和(c)聚乙烯乙二醇以(10-12)∶(1-4)∶(1-4)的比例混合使用更好。

还有一个更好的实例，用含氧侧链或侧环的木脂体架(U.S.Pat.No.4,803,153)来处理血液获得血清或血浆，如用d-芝麻素、l-芝麻素、泡桐素、d-asarinin，l-asarinin、2α-泡桐素、6α-泡桐素、pinoresinol，d-eudesmin，l-pinoresinol.beta.-D-glucoside，l-pinoresinol，l-pinoresinol monomethylether.beta.-D-glucoside，epimagnolin，lirioresinol-B，syringaresinol(dl)，lirioresinonB-dimethyl ether，phillyrin，magnolin，lirioresinol-A，2.alpha.，6.alpha.-d-sesamin，d-diaeudesmin，lirioresinol-C dimethyl ether(ddiayangambin)和sesamolin。凝血剂用量从约0.01至50g/L血。

C.同型半胱氨酸检测方法

目前也是检测样本中的HCY的方法。这个方法至少包含以下步骤：a)使用突变的HCY结合酶与样本结合，此突变的HCY结合酶充分保留或增强其与HCY的亲和力，但是削弱其催化活性。b)检测与突变的HCY结合酶结合的HCY或由HCY转化酶即时转化的产物

1.同型半胱氨酸的代谢

同型半胱氨酸是蛋氨酸代谢为半胱氨酸的中间氨基酸产物。人体内有两条同型半胱氨酸快速代谢途径：(1)与丝氨酸缩合成胱硫醚，(2)重新转化为蛋氨酸。

如上所述，样本中的同型半胱氨酸水平具有重要的临床意义。同型半胱氨酸在含巯基氨基酸代谢中扮演着重要的角色；代谢产物在代谢路径中提示有不同的问题，包括特殊的先天的代谢问题。因此，例如高胱氨酸尿(尿中不正常的HCY)是由于缺乏胱硫醚酶β-合成酶或转甲基四氢叶酸甲基转移酶促使HCY甲基化生成蛋氨酸，第二条路径附有插图：##STR1##In the second pathway，which isillustrated as follows：##STR1##

1是亚甲基合酶；2是四氢叶酸(FH4)转甲基酶；3是甲基四氢叶酸还原酶；4是二氢叶酸还原酶；5是胸腺嘧啶合成酶；四氢叶酸和二氢叶酸与HCY水平是相关的，另外和维生素B12的水平也是相关的，在这条路径中不同的酶可以影响HCY的水平。

巯基氨基酸代谢与维生素B12和叶酸有着密切的关系，在很多生化反应中做为底物或辅助因子，HCY堆积指示依赖维生素B12和叶酸代谢的酶紊乱，或其它的功能紊乱，或与维生素B12和叶酸有关的疾病。

HCY代谢也可能受到其它抗叶酸的药物影响，如做为抗癌和治疗哮喘的药物氨甲叶酸，因为HCY转化成蛋氨酸需要S-甲基四氢叶酸提供甲基。HCY也可被用来监测治疗恶性疾病所用的抗叶酸药物。血液中的同型半胱氨酸水平动脉粥样硬化有关(见Clarke et al.，New Eng.J.Med.324：1149-1155(1991))，中度高同型半胱氨酸血症是动脉和心脏疾病的风险因子。因此检测血液中的HCY对于检测和治疗心血管疾病是非常重要的。

2.Mutant Hcy-binding Enzymes突变的HCY结合酶

在HCY实验中，任何突变的HCY结合酶充分保留或增强其与HCY或HCY酶的直接转化产物的亲和力但却消弱了催化活性。例如突变型HCY结合酶包括胱硫醚β-合成酶，突变蛋氨酸合成酶，突变甜菜碱HCY转甲基酶，突变蛋氨酶和突变SAH合成水解酶。

a.选择和生产HCY结合酶Selecting and Producing Hcy-binding Enzymes一旦HCY结合酶核酸编码被破译，这些核酸已经能够被诱变或遮蔽获得，或直接由HCY或HCY酶转化而筛选保持高亲和力或提高亲和力的突变HCY结合酶但是削弱催化活性。利用常用的技术和在C2c中叙述的方法插入、缺失或点突变可能被引入到核酸编码的HCY结合酶中与结构功能相关的HCY结合酶用于突变，选择的Hcy变异酶充分保留甚至增强了其结合Hcy或Hcy酶转化直接产物的亲和力，但削弱了其催化活性。例如，酶的变异位点是与下列物质结合的位点：辅酶，辅助因子，非Hcy底物，变异的酶催化位点，或上述的联合位点。具体地表述，诱变胱硫醚β-合成酶，突变可能发生在胱硫醚β-合成酶的维生素B6 5′-磷酸或L丝氨酸或两者同时变异(Kim et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，71(2)：4821-4825(1974))。例如，人类胱硫醚β-合成酶的Lys1 19可能被删除或诱变成一个中性或酸性的氨基酸残基(Kery et al.，Biochemistry，38(9)：2716-24(1999))。另外地具体表述中，蛋氨酸合成酶被诱变，可能被突变发生在蛋氨酸合成酶的VB12或5甲基四氢叶酸(5-CH₃-THF)或两者同时变异，例如人类蛋氨酸合成酶的Asp946，Glu1097，Arg1134，Ala1136，Gly1138，Tyr1139 and Tyr1189可能被删除或突变成不同的氨基酸残基，Asp和Glu被突变成中性或基础残基i.e，Arg被突变成中性或酸性残基，Ala和Glu被突变成有大侧链的中性残基，Tyr被突变成没有芳香族侧链的残基(Dixon etal.，Structure，4(11)：1263-75(1996))。包含有下列氨基酸序列(在SEQ ID No.3中有表述)的大肠杆菌蛋氨酸合成酶用于Hcy的检测：His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，或Ser810Ala(Amaratunga et al.，Biochemistry，35(7)：2453-63(1996))。另外的具体表述，SAH水解酶被诱变，突变可能生成在SAH合成水解酶的NAD⁺或SAH水解催化酶，如5′-水解活性位点，或两者同时变异。

另外具体表述，甜菜碱Hcy甲基转移酶被诱变，突变可能发生在甜菜碱Hcy甲基转移酶的Zn.⁺甜菜碱位点上。例如人类甜菜碱Hcy甲基转移酶的Cys299和Cys300可能缺失或突变成没有SH-侧链的氨基酸残基，如丝氨酸(Millian andGarrow，Arch.Biochem.Biophys.，356(1)：93-8(1998)).。

另外的具体表述，蛋氨酶被诱变，突变可能发生在蛋氨合成酶的R′SH位点上，增加一个硫醇烷基或取代一个硫羟基(Ito et al.，J.Biochem.，(Tokyo)80(6)：1327-34(1976))。

一旦HCY结合酶发生预先设定的突变，则保留或增强对Hcy和Hcy酶直接转化产物的亲和力，而削弱其催化活性，突变的HCY结合酶就可以用B章节叙述的包括基因重组，化学合成，或兼用二种方法制备，用基因重组的方法获得突变的Hcy结合酶。

b.变异的SAH水解酶和核酸编码变异的SAH水解酶

SAH水解酶存在于哺乳动物，分子量大约180-190KD，包含有4分子的作为辅酶的紧密结合NAD⁺，酶的催化过程包括2个连续的反应，伴随着NAD⁺转变成NADH，底物由3′氧转变成3′酮；然后5′-水解生成Hcy和腺嘧啶Ado(Refsum，et al.，Clin.Chem.，31：624-628(1985))。SAH水解酶C端非常容易被保存，包含有水解酶催化作用所必需的氨基酸残基。最近检测与底物类似物抑制剂混合的人类SAH水解酶的晶体结构。SAH水解酶的X-线结构表明最少20个氨基酸残基直接或间接的与底物类似物抑制剂有关，氨基酸残基的辅酶NAD⁺变异可以是位点的直接变异，此残基直接或间接的与底物结合，直接影响其催化活性，变异的酶的基因序列可以与野生型的酶的序列比较，从而来确证此酶为所希望的变异的酶。

假设这里是纯化的变异的SAH水解酶，充分保留甚至增强它对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化活性。

具体地表述，变异的SAH水解酶结合NAD⁺的结合位点或催化位点发生了变异，或两者均发生了变异，可以导致充分保留甚至增强它对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化活性。

另外具体地表述，变异型SAH水解酶削弱了5′端的水解活性，但保留了3′端的氧化活性。

在其他的特异表型中，变异的SAH水解酶固定的结合SAH。

具体的表述，变异的SAH水解酶的酶切速率大约或低于10.0mu.M，变异的SAH水解酶对SAH的酶切速率大约为或低于1.0mu.M。具体的表述，变异的SAH水解酶对SAH的酶催化活性大约或低于0.1S^-。具体的表述，变异的SAH水解酶有一个或多个可插入，缺失或点突变的位点。更具体地说，变异的SAH水解酶来源于SEQ ID No.1表述的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表述的核酸序列编码的氨基酸但是包括下列一处或多处变异：Phe302 of Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431 H和K426A的两次变异。提供单独的核酸片断或者DNA，或者RNA，包括编码变异的SAH水解酶的核酸序列，变异的SAH水解酶充分保留甚至增强它对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化活性。

具体地表述，独立的核酸片断编码变异的SAH水解酶，其催化活性的削弱由

于结合NAD⁺的结合位点或其催化位点发生了变异或两者同时发生变异。

具体地表述，变异型SAH水解酶，变异的SAH水解酶削弱了5′水解，活性；但仍保留3′端的氧化活性

具体地表述，独立的核酸片断编码变异型SAH水解酶，其固定的结合SAH。

具体地表述，独立的核酸片断编码变异型SAH水解酶，变异的SAH水解酶的酶切速率大约或低于10.0mu.M，变异的SAH水解酶对SAH的酶切速率大约为或低于1.0mu.M。具体地表述，独立的核酸片断编码变异型SAH水解酶，变异的SAH水解酶对SAH的酶催化活性大约或低于0.1S^-。

具体地表述，独立的核酸片断编码变异型SAH水解酶，变异的SAH水解酶有一个或多个可插入，缺失或点突变的位点。更具体地说，变异的SAH水解酶来源于SEQ ID No.1表述的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表述的核酸序列编码的氨基酸但是包括下列一处或多处变异：Phe302 of Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431 H和K426A的两次变异。进一步还提供质粒，包括编码上述变异水解酶的核酸片断。更具体地说，此质粒是一种表达载体包含有下列核酸编码的序列：a)启动子区域，b)变异的SAH水解酶，其充分保留甚至增强它对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化活性。核酸编码变异的SAH水解酶的序列与启动子相关，表达SAH水解酶。更具体地说，此质粒包括可选择的标记。

本发明提供包含上述质粒的重组宿主细胞。重组的宿住细胞可以是下列宿主细胞但不局限于：细菌细胞，酵母细胞，真菌细胞，植物细胞，昆虫细胞，动物细胞。

本发明提供制备变异的SAH水解酶方法。重组的宿主细胞可以在一定的环境中生长，变异的SAH在其中通过细胞表达。表达的变异的SAH水解酶被分离或复原。

另外变异的SAH水解酶，按照已知的技术制备，包括B部分的举例中。上述的变异的SAH水解酶此酶充分保留甚至增强它对Hcy或SAH的亲和力，但是削弱其催化活性可用于样本中Hcy的检测。

3.使用变异的SAH水解酶检测Hcy

具体地表述，变异的Hcy结合酶在Hcy实验中使用的是变异的SAH水解酶，它保留或增强对Hcy和SAH的亲和力，但是催化活性被削弱。这个实验下面具体表述。Hcy检测系统可以降解Hcy，可以利用变异的SAH水解酶与Hcy的结合来定量或检测，野生型的SAH水解酶使得Hcy转化为SAH。如上面所述，使用底物捕获技术来代替使用单克隆抗体来定量检测(见，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767 andU.S.Pat.No.5,631,127)。使用荧光标记的捕获目标S-腺苷半胱氨以竞争形式结合，变异的SAH用来捕获底物。任何合适的标记物的合适的定量检测都可以使用底物捕获方法。下面有举例以微孔板形式的反应；以及使用荧光标记腺苷半胱氨酸的标记举例。具体地表述，SAH水解酶的催化活性由于变异的SAH水解酶的结合NAD⁺的位点或其催化位点发生了变异或两者同时发生变异。具体地表述，变异的SAH水解酶削弱5′水解活性，但仍保留3′氧化活性。具体地表述，变异的SAH水解酶可以固定结合SAH。具体地表述，变异的SAH水解酶的酶切速率Km小于或等于为10.0.mu.M.，更具体地说，变异的SAH水解酶对SAH的酶切速率大约或小于1.0.mu.。具体地表述，变异的SAH水解酶对SAH的酶催化活性大约或低于0.1S^-1。具体地表述，变异的SAH水解酶有一个或多个可插入，缺失或点突变的位点。更具体地说，变异的SAH水解酶来源于SEQ ID No.1表述的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表述的核酸序列编码的氨基酸但是包括下列一处或多处变异：Phe302，Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431 H和K426A的两次变异。

样品和变异的SAH水解酶反应前，必须预先用还原剂将氧化型Hcy转化成还原型Hcy，还原剂如磷酸三丁酯(TBP)，β-ME(巯基乙醇)，二硫赤鲜醇(DTT)，二硫赤鲜糖醇，巯基乙酸，谷胱苷肽，Tris磷酸，腈硼氢钠，NaBH⁴，KBH⁴和金属离子。

具体地表述，样品和变异的SAH水解酶接触反应前，需要去除或降解游离的

腺苷，腺苷通过腺苷脱氨酶，嘌呤核苷磷酸酶和黄嘌呤氧化酶被降解。

具体实施方式

下面举例说明但是不仅仅局限于下面发明的范围。

例一

准备变异的SAH水解酶编码核酸

人类的SAH水解酶基因编码(SEQ ID No.1)EcoR I作用重组复制表达质粒PKK223-3(Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。质粒PKK223-3包括强的TAC启动子，此启动子位于多克隆位点的上游，还包括强的rrnB核醣体终端，此终端位于下游，控制蛋白质的表达。包含SAH水解酶基因的表达质粒转录到E.coli单链JM109上(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。SAH水解酶位点的直接变异通过下列两种形式：1)M13方法单链DNA变异2)PCP方法双链DNA变异。

单链DNA变异

单链DNA变异是Taylor et al，Nucleic Acids Res.，13：8765-8785(1985)创建的方法，使用无活性的Ncil解开含硫基的DNA链。使用了Sculptor.TM.体外变异系统RPN1526(Amersham Life science，UK)。pKK223-3质粒包含包含有SAH水解酶野生基因，此质粒准备用于减弱碱性的方法中，此方法用Promega’s DNA纯化试剂盒纯化质粒(Wizard plus Minipreps，Promega，Madison Wis.)。纯化的质粒由限制性内切酶水解，37℃孵育2小时，使Promega DNA用Promega DNA纯化试剂盒通过琼脂糖凝胶电泳得EcoR I切隔片断。纯化的EcoR I切隔片断由T₄ DNA连接酶克隆到M13mp 19 DNA中(Pharmacia Biotech Piscataway，N.J.)。连接酶在One-phor-All缓冲液(10mM tris-Ac，pH 7.5，10mM Mg(Ac)2，50mM KAc；Pharmacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden)中4℃过夜。90.mu.l的TG1细胞与10.mu.l的M13在0℃孵育30分钟，42℃孵育75秒，连接产物转录到TG1细胞中(Stratagene，La Jolla，Calif.)。冷却到0℃2分钟，500.mu.l的2XYT加入到细胞中，37℃孵育10分钟。200.mu.l未转录的TG1细胞于转录的TG1细胞混合，加入2.5ml的42℃的软琼脂中。混合的细胞立即加入预热的LB琼脂盘中，37℃孵育过夜。噬菌体克隆株用于检测SAH水解酶的插入，定位DNA的序列，从而限制酶的分析活性。选择的噬菌体克隆株用于准备单链DNA的模版的准备。

包含有SAH水解酶基因的M13噬菌体TG1细胞在3ml的2XYT界质中孵育过夜。在30ml的2XYT中加入一滴对数成长的TG1细胞。细胞孵育8小时并且不断振摇。离心，收集上清液，即是纯化的单链模版DNA。根据Amersham生命科学的操作程序进行纯化。

点突变的引体

通过CruaChem(Sterling，Va.)合成低聚核酸(15-30个碱基)，低聚核酸的顺序预计用于补充包括变异位点的区域的顺序，例如，Lys变异为glu426。用于引子的低聚核酸包含下列顺序：GGCCCCTTCGAGCCGGATCACTACCGC(SEQ ID No.63)，其中的GAG编码glu，从而代替原始的AAG编码lys。Oligonucleotides(15-30bases)were synthesized by CmaChem(Sterling，Va.)。

变异位点的选择基因人类SAH水解酶的X线照射的底物结合位点和辅酶结合位点(Tumer et al.，Nature Structural Biology，5：369-376(1998))。氨基酸残基例如Thr157，Asp131，His301，Lys186，Asn191，Glu156，Asp190，Phe362，Phe302，Asn181，His353，Glu59，Ser83，His55，Leu54，Cys79，His301，Arg343，Asp303，Leu344，Asn80，Asn346，Asp107和完整的C端残基能够成为变异的靶子(请看下列Table2的特殊变异发生表)结合辅酶的区域包括从Tyr193到Asn346的残基。

低聚核酸在水中被溶解浓度为5ng/ml。低聚核酸溶液在多聚核酸激酶的催化下5’端被磷酸化，磷酸化作用与下列物质混合：2.5ml的低聚核酸(5ng/ml)，3ml的One-phor-all10倍浓度的激酶缓冲液(Pharmacia Biotech)，21.5ml的水，2ml的10mM的ATP，1ml多聚核酸激酶(100000U/ml)(Pharmacia Biotech)。反应混合液37℃孵育30分钟，加热到70℃10分钟，灭活酶的活性。

          表2

人SAH水解酶的核酸变异位点

                                            密码子

Mutant  Mutagenic oligonucleotide      改变       SEQ ID

K186A   GACTTCGTCACCGCCAGCAAGTTTGGG    AAG.fwdarw.GCC 64

F302S   AACATTGGACACTCTGACGTGGAGATC    TTT.fwdarw.TCT 65

H301D   TGTAACATTGGAGACTTTGACGTGGAG    CAC.fwdarw.GAC 66

H353S   TGTGCCATGGGCTCCCCCAGCTTCGTG    CAC.fwdarw.TCC 67

R343A   CTGGCCGAGGGTGCGCTGGTCAACCTG    CGG.fwdarw.GCG 68

D190A   AAGAGCAAGTTTGCCAACCTCTATGGC    GAC.fwdarw.GCC 69

F82A    AGCTGCAACATCGCCTCCACCCAGGAC    TTC.fwdarw.GCC 70

N181D   AACCTCTATGGCGACCGGGAGTCCCTC    AAT.fwdarw GAC 71

R431A  CCGGATCACTACGCCTACTGAGAATTC    CGC.fwdarw.GCC 72

K426R  TGTGATGGCTTCCGCCCGGATCACTAC    AAG.fwdarw.CGC 73

C195S  AACCTCTATGGCTCCCGGGAGTCCCTC    TGC.fwdarw.TCC 74

.sub..DELTA.432 GATCACTACCGCTGATGAGAATTCGAG  ATC.fwdarw.TGA 75

在低聚核酸∶模版为2∶1的比例中的退火缓冲液中，5’-磷酸化低聚核酸DNA与单链DNA(M13噬菌体包含有野生的SAH水解酶基因)退火，退火反应70℃孵育3min，然后37℃30min，然后转到55℃微量离心试管中打碎，冷却到室温。退火混合液17ml，19mldNTPA(α-S)混合，加入1.5mlT₇ DNA，室温10分钟，37℃30分钟，加热70℃15分钟，使其丧失活性停止反应，在反应液中加入T₅核酸外切酶(2000单位)和核酸外切酶缓冲液37℃，30分钟从而去除单链非变异的DNA。然后加入70℃的Ncil中15min，然后在37℃，90min基因组合非变异的单链。非变异的单链被加入16单位外切酶III消化，37℃孵育30min，失去活性。多聚切口的DNA，dNTP混合B，3.5单位的DNA聚合酶I和2.5单位的T₄ DNA连接酶加入反应中，37℃孵育1小时。

M₁₃噬菌体包含有SAH水解酶基因，通过热振摇方法转入目的TG1宿主细胞中。10ml的变异的M₁₃噬菌体加入90ml水中，与目的TG1细胞在冰中混匀40min，TG1细胞42℃振匀孵育45秒，立即冷却到0℃，5min。转录的TG1细胞升到室温，与200ml正在生长期的非转录TG1细胞(象菌胎细胞一样切断)，加入3ml熔化的热琼脂，混匀，立即倒入在L-型盘子的细胞中，37℃过夜。用牙签挑起菌落放入3ml的2XYT的试管中，混匀过夜，离心收集细胞。双链DNA M₁₃噬菌体使用Promega DNA纯化试剂盒纯化(Wizard plus Minipreps)。

离心得到的上清液用于纯化单链M₁₃ DNA。使用SEQ 2.0(Unites StatesBiochemical)的单链M₁₃DNA发生变异。选择双链M₁₃ DNA包含正确的变异顺序，用EcorI限制性内切酶消化。EcorI限制性内切酶包含有SAH水解酶基因，利用琼脂糖电泳使用Qlaquick Gel Extraction kit清除法纯化。纯化的EcoR I片段使用T₄连接酶克隆表达Pkk223-3载体，在10ml纯化的变异插入DNA中，处理过的2ml的EcoR I和5’-脱磷酸Pkk223-3载体孵育10分钟，在载体中以2∶1比例插入。连接酶反应在包含0.01M的ATP的One-phore-All缓冲液中，16℃过夜。包含有SAH水解酶基因的连接载体通过热振摇的方法转入目标E.Coli JM109细胞中。选择抗氨苄青霉素的转录细胞。挑取耐氨苄青霉素菌株，在10ml含有35ml/mi的氨苄青霉素的2XYT界质中，37℃生长2小时，1mM的IPTG中诱变，37℃过夜生长。离心收集细胞，加入0.8ml，50mM的Tris-Hcl，PH7.5的缓冲液中，含有2mM的EDTA的缓冲液中。细胞由于快速冻融而溶解。4℃，13500转离心1小时，收集上清夜；通过SDS-PAGE分析表达SAH水解酶变异蛋白。大约分子量围47000道尔顿的重蛋白带即为SAH水解酶蛋白质的表达。

利用PCR技术变异方法

使用ExSitePCR直接位点变异试剂盒(Stratagene，La Jolla，Calif.)利用PCR技术变异。ExSite方法使用增高的模板浓度，进行小于10个循环的PCR扩增。使用Dpn I和Pfu DNA聚合酶处理模板DNA，重新合成的DNA，杂合亲代或重新合成的DNA混合物。DpnI外部消化甲基化的亲代模板和杂交的DNA，Pfu DNA聚合酶修饰末端产生钝端PCR产物。末端修饰的PCR产物分子内连接转录到E.coli细胞中。具体的实验产物如下描述：

在微量离心管中加入0.5pmol的DNA模板，2.5ml的10倍浓度的变异缓冲液，1ml的25mM的dNTP混合，每个启动子15pml，加水使容量达到24ml。在反应混合液中然后加入1ml的Exsite DNA聚合酶混合物(5U/ml)。反应液用20ml的石油覆盖，然后经过7012次热循环扩增DAN。扩增参数见表3。

                      表3

突变生成的循环参数(Mutagenesis Cycling Parameters)

片段    循环    温度(摄氏度)    时间

1       1           94          4min.

                    50          2min.

                    72          2min.

2       8           94          1min.

                    56          2min.

                    72          1min.

                    72          5min.

        3           72          5min.

扩增后，反应管放到冰中2分钟，冷却反应降到低于37℃，在反应管中加入1ml的Dpn I限制酶(10IU/ml)和0.5ml的克隆Pfu DNA聚合酶(2.5U/ml)，37℃孵育30分钟，加热到72℃，30分钟终止扩增。连接产物，在反应管中加入100ml重蒸水，10ml10倍浓度的变异缓冲液，5ml 10mM的rATP。10ml上述反应液转移到新的离心管中，加入1ml的T4 DNA连接酶(4U/ml)，连接液37℃孵育1小时。2ml的连接DNA加入80ml的Epicurian Coli XL1-Blue冰的上清夜细胞中，孵育30分钟，然后42℃孵育45秒，冰中2分钟。转移细胞立即转入LB氨苄青霉素琼脂培养基中，此培养基其中有20ml10％X-gal DMF和20ml 100M的IOTG的水中，37℃过夜，选取兰色菌落，此菌落含有变异的噬菌体。选取的菌落含有DNA序列，蛋白质表达和底物捕获的筛选如上所述。

含有SAH水解酶的双链PKK233-3用Promega DNA纯化试剂盒(Wizard plusMinipreps)从50ml的E.coli JM109培养基中纯化。纯化的质粒被包含有希望变异序列的PCP启动子退火。

使用ExSite PCR直接位点变异试剂盒进行缺失和插入变异。两种变异或混合变异使用变异的或缺失DNA的模版来进行，对于第二次变异或缺失使用M13的突变或PCP突变方法。

鉴别底物捕获SAH水解酶

从可诱导表达SAH水解酶蛋白的菌株中萃取的细胞，利用FPLC系统进行套色复制。使用0到1M的10mM的磷酸钠洗涤。在同一或相近的时间中，洗涤的主要蛋白峰是野生型的SAH水解酶收集。收集了大部分的SAH水解酶(1-10.mu.g)与SAH(10mCi/mmole，200.mu.M)，30mM的DTNB室温孵育5-30分钟。

反应液通过一种分界限30000的；滤过膜离心过滤，过滤液经1ml50mM的PH7.0的磷酸缓冲液洗涤，在412nm处测定HCY(酶活性)，膜上³H的放射活性的检测，既在膜上有高放射活性，在与野生型酶类过滤液中有低的吸光度的变性水解酶被选为候选者。因为其特性有酶速率的检测活性下能够结合酶。

变异型SAH水解酶于SAH反应低于(10mCi/mmole，200.mu.M)的酶切速率，酶活性低于0.1kat/s，这样的酶可以有高量的表达(1-2L的大肠杆菌培养基)酶蛋白的纯化结合SDA-PAGE来判断。

例2

大批量表达和纯化野生型和变异型的SAH水解酶

纯化

IPTG诱变E.Coli JM109培养基在(PKK-223-3载体中结合SAH水解酶基因)的细胞萃取液与DEAE-cellulose(Sigma，St.Louis，Mo.)混合，与0.1M钠磷酸，PH7.2，包含1mM的EDTA的缓冲液平衡细胞萃取液和DEAE-cellulose的混合液真空过滤，用3体积的Buffer A冲洗。用氨基酸盐沉淀过滤液。过滤蛋白用13000转离心收集，重新溶于50mM PH7.2含1mM EDTA的磷酸缓冲液中。此蛋白通过DEAE-sephrose离子交换柱(2.5times，100cm)(Pharmacial Biotech，Piscataway，N.J.)层染，然后用不通梯度浓度的Nacl DEAE-Sepharose离子交换柱(2.5.times.30cm)冲洗，从DEAE-Sepharose离子交换洗脱的主要的蛋白峰通过SDS-PAGE检测，大多数情况下纯化后的反应液在通过SDS-PAGE检测应该得到单一的蛋白带，有些情况下可以分析其他小的蛋白带，如果出现这种情况，应重新通过DEAE-sephrose离子交换柱层染，从而保证得到纯化的蛋白质。SAH水解酶活性或3HSAH结合活性通过蛋白峰来确定。

纯化后SAH水解酶的保存

纯化的野生型和变异型SAH水解酶在5mM的PH7.2的PB中，4℃透析6小时。然后在液氮中冷冻，真空或冻干粉保存。冻干粉在-70℃保存可以稳定2年。纯化后的蛋白也可在20％的甘油中-20℃保存。对于野生型酶类，加入含有5mol腺嘌呤的20％的甘油，酶活性会更加的稳定。

酶活性的检测

直接检测水解反应来检测SAH水解酶活性(Yuan et al.，J.Biol Chem.，271：28008-28016，1996).检测SAH水解腺嘌呤和Hcy的能力。反应产物Hcy由硫代的DTNB发生有色的变化，在412nm处检测。SAH水解酶可以利用HPLC检测(see，Yuan et al.，J.Biol.Chem.，268：17030-17037(1993)。一个单位的酶活性定义为水解或合成1μmol的min/mg SAH酶量。

亲和力活性的检测

对于变异型酶，酶活性完全丧失，亲和力使用滤膜分析平衡技术检测，此检测使用3H标记的SAH和Spectrum 5-cell Equilibrium分析仪(Spectrum，Houston，Tex.)。过滤膜为25000。

例3

试剂准备

准备荧光标记的腺嘌呤和SAH类似物

方法1

ADO-5′-羧酸(Sigma，St.Louis，Mo.)来源于9-羟甲基蒽(HMA)(Fluka，Buchs，Switzerland)，加入50mg HOBT，在氮气中进行干化学染色，加入300mgN-ethyl-N′(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride在300ml氯仿中，在加入5ml的三乙胺。上述液体在0℃放置30分钟，加入200mgHMA、100ml氯仿，混合液室温放置10分钟，在氮气流中干燥，残渣溶于10ml HPLC流动液相中(甲醇∶水＝90∶10)。1ml的上述液体注入一个半-prepative柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)，使用平衡过滤方法，流速为2m/min，260nm为检测峰，荧光分析在415nm和365nm，在260nm和荧光吸收峰处的物质为HMA标记的Ado-5′-酯。

方法2

Ado-5′caroboxylic acid和4-bromomethyl-7-methoxycoumarin(Br-Mmc)(Sigma，St.Louis，Mo.)以1∶3比例溶于乙酰乙酸(ethyl acetate)中，25ml反应液中加入2g K2CO3，然后冷却，反应液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分离，过滤，使用不通梯度甲醇洗脱：20-100％的浓度，洗脱30分钟，流速2ml/min。

方法3

腺苷-L-半胱氨酸和4-溴甲基-7-甲基氧化香豆素以1∶3比例溶于乙酰乙酸中，最后溶液为25ml(ca，1mg Ado-Cys)，加入200mg的K2CO3，此溶液在80℃回流1小时，冷却，反应液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分离，过滤，使用不通梯度甲醇洗脱：20-100％的浓度，洗脱30分钟，流速2ml/min。

方法4

Ado-Cys溶液PH 9.0，1mmol/l的CB中，异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于5ml的DMSO中，用PH9.0，1M的CB稀释等体积的Ado-Cys和FITC，混匀，室温温育1小时。Ado-Cys-FITC结合物用C18标记，用HPLC分离(Econsphere，C18，Alltech，Dearfield，Ill.)，过滤液在260nm处检测，484nm，520nm用荧光检测。流动相是水和甲酚的不同梯度浓度溶液，从0到80％，35分钟洗脱。

微孔板上包被变异的SAH水解酶

变异的SAH水解酶(F302S)包被于96微孔板上(Dynex Technologies，Chantilly，Va.)，每孔200μl，F302S水解酶20μg/ml，磷酸缓冲液50mmol/l，PH7.6，4℃过夜，倒空，用10mM的PBS(NaCL0.05％，0.05％的T-20)洗涤3次，排干。4℃保存备用。

标准和化学试剂的准备

1.制作标准曲线

人白蛋白(Fraction V powder，Sigma)溶于PBS中，白蛋白的浓度于血浆中的浓度相同。10ml的白蛋白加入4ml的1％的TBP，室温孵育15分钟，经过一定大小的(Sephacryl-S100，2.times.90cm)凝胶过滤，白蛋白浓度使用白蛋白浓度调整仪调整到于人血浆类似的浓度。L-Hcy的系列浓度已知，L-Hcy加入TBP处理人血浆白蛋白中的最终浓度为0-50μM，37度孵育1h后，L-Hcy结合的白蛋白每管中70ml，作为标准品，使用前-20℃保存。

2.野生型SAH水解酶溶液

野生型SAH水解酶溶液(20mU/50.mu.l)溶解于50mM磷酸缓冲液，PH7.2，1mM EDTA，0.25mM Ado和1mg/ml BSA.

3.TBP溶液

TBP(Sigma)溶于1％的DMF中。

4.异硫氰酸荧光素溶液(FLAC)

Br-Mmc-labeled Ado-Cys或FITC标记的腺苷半胱氨酸溶于50mM磷酸缓冲液，PH7.2，浓度为0.5mM。

5.SAH水解酶抑制剂稀释液

Neplanocin A，一种SAH水解酶抑制剂，腺苷脱氨酶的底物，溶于50mM PH7.2的PB中抑制剂溶液(50.mu.M)以1∶1.5使用。

6.多酶溶液

腺苷(0.2U/.mu.l)，核苷磷酸酶(0.2U/l)，黄嘌呤氧化酶(0.2U/.mu.l)溶解于50mM磷酸盐缓冲液，PH7.2，所有的酶均来源于Sigma。

7.洗液

洗板液成分：10mM PBS，pH7.2，，0.1M NaCl和0.05％Tween 20。

例4

使用变异的SAH酶检测

血浆中的HCY检测程序

步骤1.HCY转化为SAH

微量离心管或未包被的96孔板中，50ul的血浆样本加入20ulTBP和50ul稀释液，25℃孵育15分钟，加入20ul酶抑制剂，孵育10分钟后加入无活性SAH水解酶。步骤2移去剩余的ADO和酶抑制剂。在步骤1的溶液中加入30ul的多酶稀释液，室温孵育15分钟。步骤3使用变异的SAH水解酶诱捕SAH。150ul步骤2的溶液转移到包被有变异的SAH水解酶的微孔板中，室温孵育30分钟，倒掉液体。步骤4，清洗液洗涤3遍，拍干。步骤5荧光标记的Ado-Cys与变异的酶结合100ul荧光标记的Ado-Cys或荧光标记的Ado-5′酯加入到步骤4的微孔板中，室温孵育20分钟，清洗液清洗3次。步骤6检测荧光标记的Ado-Cys与变异的酶结合物。

将200ul PH7.2，50mM的磷酸缓冲液加入到步骤4的微孔板中，使用荧光仪读取(Molecular Devices，fmax)，依据吸光度血浆中Hcy的浓度，可以依据标准曲线中查找。

选择的Hcy检测

有选择的，Hcy检测可以用于预先包被SAH于微孔板中，使用荧光标记变异的SAH水解酶，去竞争性结合检测，下面是详细阐述：

1.预先包被SAH在微孔板上。

2.在PCL3中50℃环境下，通过激活SAH3羧基基团，SAH与多聚赖氨酸结合，SAH-多聚赖氨酸结合物通过HPLC纯化，然后溶于溶于0.1M PH9.6的碳酸缓冲液中，每孔加入300ul 100g/ml的SAH多聚核酸溶液，37℃孵育6小时，10mMPBS，0.1M NaCL洗板3次，然后拍干，使用前保存于4℃。荧光标记的变异SAH水解酶Fluorophore-labeled Mutant SAH Hydrolase变异的SAH水解酶(e.g.，F302S)特异性标记在Cys421的一个非本质的半胱氨酸残基，他位于蛋白质表层，不包括在底物的结合和催化位点。Cys421残基是硫代活化基团，不影响酶结合活性的情况下被修饰。硫代反应探针例如7-diethylamino-3(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin(CPM)能够标记蛋白。变异的SAH水解酶(F302S)(0.5mg/ml)，加入PH7.250mM的PB缓冲液中用于保护其他底物结合位点的硫基的腺苷2ml，共同孵育使其最后浓度为50mM，反应液室温孵育30分钟，加入一定大小的分离柱中进行分离凝胶过滤(Sephacryl S-300，4.5mm.times.60cm)，去除腺嘌呤和多余的CPM。CPM标记的F302S变异的SAH水解酶(2mg/ml)放入50mM PB缓冲液中-20℃保存，其中含有20％的甘油。野生型的SAH与变异的F302S酶切速率和催化活性比较如下表4：

                        表4

野生型的SAH与变异的F302S酶切速率和催化活性比较

              type SAH水解酶

酶            Km(SAH)          Kcat(SAH)

野生型        7.9.mu.M         3.8S.sup.-1

F302S         1.0.mu.M         0.1S.sup.-1

血浆中Hcy的检测程序2

步骤1，Hcy转化为SAH

微量离心管或未包被的96孔板中，50ul的血浆样本加入20ulTBP和50ul稀释液，25℃孵育15分钟，加入20ul酶抑制剂，孵育10分钟后加入无活性SAH水解酶。步骤2，移去剩余的ADO和酶抑制剂。在步骤1的溶液中加入30ul的多酶稀释液，室温孵育15分钟。步骤3，竞争性地SAH与变异的SAH水解酶。

100ul步骤2的溶液转入预先包被多聚赖氨酸-SAH结合物的微孔板中，加入150ul的荧光标记的变异的SAH水解酶。室温孵育30分钟，用清洗液清洗3遍，拍干。步骤4检测微孔板中荧光标记的SAH水解酶的结合。200ul的10nM的磷酸盐缓冲液加入步骤3中的微孔板中，在390nm和460nm处用读板机(MolecularDevices，fmax)读数。血浆中的Hcy的浓度依照标准曲线求得。

                        序列表

<110>北京九强生物技术有限公司

<210>SEQ ID NO 1

<211>长度：432

<212>类型：PRT

<213>：人

<223>：人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶蛋白

Met Ser Asp Lys Leu Pro Tyr Lys Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala

  1              5                   10                 15

Trp Gly Arg Lys Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu

            20                   25                  30

Met Arg Met Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys Pro Leu Lys Gly Ala

        35                   40                  45

Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Val Glu Thr Ala Val Leu Ile

     50                  55                  60

Glu Thr Leu Val Thr Leu Gly Ala Glu Val Gln Trp Ser Ser Cys Asn

 65                  70                  75                  80

Ile Phe Ser Thr Gln Asn His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Lys Ala Gly

                 85                  90                  95

Ile Pro Val Tyr Ala Trp Lys Gly Glu Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Trp

100                            105                 110

Cys Ile Glu Gln Thr Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Leu Asn Met Ile

        115                 120                  125

Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr Asn Leu Ile His Thr Lys Tyr Pro

    130                  135                140

Gln Leu Leu Pro Gly Ile Arg Gly Ile Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly

 145                 150                 155                160

Val His Asn Leu Tyr Lys Met Met Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Pro

                165                  170                 175

Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn Leu

            180                 185                 190

Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Ile Asp Gly Ile Lys Arg Ala Thr Asp

         195                 200                205

Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp Val

     210                215                  220

Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ala Leu Arg Gly Phe Gly Ala Arg Val Ile

225                 230                 235                 240

Ile Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly

                245                  250                255

Tyr Glu Val Thr Thr Met Asp Glu Ala Cys Gln Glu Gly Asn Ile Phe

            260                 265                 270

Val Thr Thr Thr Gly Cys Ile Asp Ile Ile Leu Gly Arg His Phe Glu

        275                 280                 285

Gln Met Lys Asp Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Val

    290                 295                 300

Glu Ile Asp Val Lys Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys Val Asn

 305                310                 315                 320

Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Arg Arg Ile

                 325                 330                335

Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys Ala Met Gly

            340                 345                 350

His Pro Ser Phe Val Met Ser Asn Ser Phe Thr Asn Gln Val Met Ala

        355                  360                 365

Gln Ile Glu Leu Trp Thr His Pro Asp Lys Tyr Pro Val Gly Val His

     370                 375                380

Phe Leu Pro Lys Lys Leu Asp Glu Ala Val Ala Glu Ala His Leu Gly

385                 390                 395                400

Lys Leu Asn Val Lys Leu Thr Lys Leu Thr Glu Lys Gln Ala Gln Tyr

405                     410                           415

Leu Gly Met Ser Cys Asp Gly Pro Phe Lys Pro Asp His Tyr Arg Tyr

420                            425                 430

<110>北京九强生物技术有限公司

<210>SEQ ID NO 2

<211>长度：2211

<212>类型：DNA

<213>人

<223>人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶cDNA

ctgaggccca gcccccttcg cccgtttcca tcacgagtgc cgccagcatg tctgacaaac60

tgccctacaa agtcgccgac atcggcctgg ctgcctgggg acgcaaggcc ctggacattg120

ctgagaacga gatgccgggc ctgatgcgta tgcgggagcg gtactcggcc tccaagccac180

tgaagggcgc ccgcatcgct ggctgcctgc acatgaccgt ggagacggcc gtcctcattg240

agaccctcgt caccctgggt gctgaggtgc agtggtccag ctgcaacatc ttctccaccc300

agaaccatgc ggcggctgcc attgccaagg ctggcattcc ggtgtatgcc tggaagggcg360

aaacggacga ggagtacctg tggtgcattg agcagaccct gtacttcaag gacgggcccc420

tcaacatgat tctggacgac gggggcgacc tcaccaacct catccacacc aagtacccgc480

agcttctgcc aggcatccga ggcatctctg aggagaccac gactggggtc cacaacctct540

acaagatgat ggccaatggg atcctcaagg tgcctgccat caatgtcaat gactccgtca600

ccaagagcaa gtttgacaac ctctatggct gccgggagtc cctcatagat ggcatcaagc660

gggccacaga tgtgatgatt gccggcaagg tagcggtggt agcaggctat ggtgatgtgg720

gcaagggctg tgcccaggcc ctgcggggtt tcggagcccg cgtcatcatc accgagattg780

accccatcaa cgcactgcag gctgccatgg agggctatga ggtgaccacc atggatgagg840

cctgtcagga gggcaacatc tttgtcacca ccacaggctg tattgacatc atccttggcc900

ggtaggtgcc agatgggggg tcccggggag tgagggagga gggcagagtt gggacagctt960

tctgtccctg acaatctccc acggtcttgg gctgcctgac aggcactttg agcagatgaa1020

ggatgatgcc attgtgtgta acattggaca ctttgacgtg gagatcgatg tcaagtggct1080

caacgagaac gccgtggaga aggtgaacat caagccgcag gtggaccggt atcggttgaa1140

gaatgggcgc cgcatcatcc tgctggccga gggtcggctg gtcaacctgg gttgtgccat1200

gggccacccc agcttcgtga tgagtaactc cttcaccaac caggtgatgg cgcagatcga1260

gctgtggacc catccagaca agtaccccgt tggggttcat ttcctgccca agaagctgga1320

tgaggcagtg gctgaagccc acctgggcaa gctgaatgtg aagttgacca agctaactga1380

gaagcaagcc  cagtacctgg  gcatgtcctg  tgatggcccc  ttcaagccgg  atcactaccg1440

ctactgagag  ccaggtctgc  gtttcaccct  ccagctgctg  tccttgccca  ggccccacct1500

ctcctcccta  agagctaatg  gcaccaactt  tgtgattggt  ttgtcagtgt  cccccatcga1560

ctctctgggg  ctgatcactt  agtttttggc  ctctgctgca  gccgtcatac  tgttccaaat1620

gtggcagcgg  gaacagagta  ccctcttcaa  gccccggtca  tgatggaggt  cccagccaca1680

gggaaccatg  agctcagtgg  tcttggaaca  gctcactaag  tcagtccttc  cttagcctgg1740

aagtcagtag  tggagtcaca  aagcccatgt  gttttgccat  ctaggccttc  acctggtctg1800

tggacttata  cctgtgtgct  tggtttacag  gtccagtggt  tcttcagccc  atgacagatg1860

agaaggggct  atattgaagg  gcaaagagga  actgttgttt  gaattttcct  gagagcctgg1920

cttagtgctg  ggccttctct  taaacctcat  tacaatgagg  ttagtacttt  tagtccctgt1980

tttacagggg  ttagaataga  ctgttaaggg  gcaactgaga  aagaacagag  aagtgacagc2040

taggggttga  gaggggccag  aaaaacatga  atgcaggcag  atttcgtgaa  atctgccacc2100

actttataac  cagatggttc  ctttcacaac  cctgggtcaa  aaagagaata  atttggccta2160

taatgttaaa  agaaagcagg  aaggtgggta  aataaaaatc  ttggtgcctg  g

Claims (16)

1.检测样本中同型半胱氨酸(Hcy)的方法，包括：

a)样本与变异的S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶结合，SAH水解酶在核苷酸序列NO.1中明确描述其氨基酸顺序，包含一次或多次选择性的变异，Phe302突变为Lys(F302K)，Lys186突变为Ser(K186S)，His301突变为Asn(H301N)，His353突变为Thr(H353T)，Arg343突变为Phe(R343F)，Asp190突变为Arg(D190R)，Phe82突变为Arg(F82R)，Thr157突变为Lys(T157K)，Asn181突变为Ala(N181A)，和两次突变：Arg431突变为His(R431 H)and Lys426突变为Ala(K426A)；

b)检测与变异的SAH水解酶结合的HCY，SAH；

从而检测样本中的Hcy的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其中在样本与变异的SAH水解酶结合之前，样本中的氧化型或结合型的Hcy需要转化成游离型的Hcy。

3.如权利要求1所述的方法，其中在样本与变异的SAH水解酶结合之前，样本中的游离型的Hcy需要转化成SAH。

4.如权利要求1所述的方法，其中样本中的Hcy被野生型的SAH水解酶转化成SAH。

5.如权利要求1所述的方法，其中的SAH与变异的SAH水解酶结合过程中存在着SAH水解酶催化抑制剂。

6.如权利要求1所述的方法，其中SAH与变异的SAH水解酶结合过程中标记SAH或其派生物或类似物，因此标记的SAH数量竞争性地抑制变异性SAH水解酶与样本中的SAH数量的作用。

7.如权利要求1所述的方法，其中的标记SAH衍生物或类似物是一种荧光标记。

8.如权利要求1所述的方法，其中变异的SAH水解酶是一种标记变异的SAH水解酶。

9.如权利要求1所述的方法，其中标记的变异性SAH水解酶是一种荧光标记或酶标记的变异的SAH水解酶。

10.如权利要求1所述的方法，其中的样本是体液或生物组织。

11.如权利要求1所述的方法，其中体液应从下列中选择：尿液，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，唾液，脑脊液，泪液，粘液和羊水。

12.如权利要求11所述的方法，其中的体液是血液。

13.如权利要求12所述的方法，其中的血液样本需要进一步分离出血浆或血清。

14.如权利要求13所述的方法，其中的生物组织应从下列组织中选择：关节组织，上皮组织，肌肉组织，神经组织，器官，肿瘤，淋巴结，动脉和单独的细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中的标记SAH或其衍生物或类似物是固定的。

16.如权利要求1所述的方法，其中的变异的SAH水解酶是固定的。