CN101320000B - 可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，它是利用已知酶活力的α-淀粉酶的共振散射强度I423nm和试剂空白的共振散射强度I0，求出ΔI423nm＝I0-I423nm做标准曲线，然后测定未知浓度的α-淀粉酶的ΔI，依据工作曲线求得被测物的α-淀粉酶的浓度，本发明的优点是：设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；试剂易得，成本低廉；底物可溶性淀粉无毒。
Description
技术领域：
本发明涉及α-淀粉酶活力的检测方法，具体是可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。
背景技术：
α-淀粉酶(α-Amylase，AMS)的全称为1，4-α-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是一种不均一性的钙依赖金属蛋白质酶，它作用于淀粉的α-1，4葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。它已经广泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药、轻化工业、石油开采等各个领域。在临床上有很高的应用价值，根据体内酶活力的变化诊断疾病，如胰脏疾病和肾脏疾病导致淀粉酶活力升高；肝脏疾病可导致酶活力下降。因此对α-淀粉酶的研究具有重要的意义。目前对于α-淀粉酶的检测，有流动注射光度法、微量量热法、粘度测定法、碘量法、凝胶扩散法3.5二硝基水杨酸法等。其中流动注射光度法的线性范围为0.1-3mmol·L-1，灵敏度较低。粘度测定法因精确性差，底物不稳定很少采用。微量量热法虽然相对较简单，但不够准确。检测α-淀粉酶活力的方法虽然很多，但可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的是要公开一种灵敏度高，简便快速的可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。
溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法包括如下步骤：
一、制备已知α-淀粉酶活力的测试体系：
1、在5mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml 10mg/mL可溶性淀粉和pH 5.3Na2HPO4-KH2PO4溶液，然后再加入0.10mL 0.2％CaAc2溶液和0.1ml 0.9％Nacl溶液，将试管置水浴锅中，50℃预热，放置5min；
2、然后再加入5uL-300uL浓度为5μg/mL α-淀粉酶溶液，摇匀时开始计时，放回50℃水浴锅中温浴，放置85min；
3、然后再依次加入0.40mol/L 0.2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀。
4、用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I423nm；
二、制备试剂空白体系：
用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入α-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度I0；
三、计算ΔI423nm＝I0-I423nm的值；
四、以加入的α-淀粉酶浓度为横坐标，以ΔI423nm为纵坐标，绘制工作曲线；
五、依据步骤一的方法，制备检测体系，加入的α-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得 被测样品的ΔI；
六、根据工作曲线，求得被测样品中α-淀粉酶的浓度。
实验表明，在未加入α-淀粉酶之前，可溶性淀粉体系的同步散射光谱较强(图1)，当有α-淀粉酶存在时，体系的同步散射有所减弱，随着浓度的增加，共振散射强度也逐渐降低，并且，α-淀粉酶的浓度在0.00835-0.501μg/ml范围内，α-淀粉酶的浓度与共振散射强度呈良好的线性关系，线性方程为ΔI＝155C+13。检测限为0.0069μg/ml。
本发明的原理：
可溶性淀粉具有很强共振散射效应，α-淀粉酶水解可溶性淀粉成小颗粒的淀粉微粒，共振散射强度降低。共振散射强度降低的大小与α-淀粉酶的浓度呈正比关系，将可溶性淀粉微粒的共振散射光谱检测与α-淀粉酶的催化反应相结合，建立起可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。
本发明的优点：
(1)设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；
(2)试剂易得，成本低廉；
(3)底物可溶性淀粉无毒。
附图说明：
图1为本发明实施过可溶性淀粉体系的共振散射光谱图；
图中：a：pH5.3-2.6mg/ml starch-0.36mg/mlNacl-0.08mg/ml CaAc2-0.04mol/L NaOHb：pH5.3-2.6mg/ml starch-0.36mg/mlNacl-0.08mg/ml CaAc2-0.04μg/mlAMS-0.04mol/L NaOH c：pH5.3-2.6mg/ml starch-0.36mg/mlNacl-0.08mg/mlCaAc2-0.16μg/ml AMS-0.04mol/L NaOH d：pH5.3-2.6mg/ml starch-0.36mg/mlNacl-0.08mg/ml CaAc2-0.48μg/ml AMS-0.04mol/L NaOH
具体实施方式：
用本发明的方法检测20个人的唾液的α-淀粉酶的含量：
1、所用试剂的仪器：
Cary Eclipse分光光度计(Varian Company，Palo Alto，CA)、HH-S2电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)、TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；
可溶性淀粉(中国医药集团上海化学试剂公司)，α-淀粉酶(165，000U/g丰特斯化学试剂公司)，聚丙烯酰胺(分子量在500万以上，上海化学试剂采购供应站分装厂)；可溶性淀粉溶液：取可溶性淀粉0.25g于小烧杯中，加入约5mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒盛有20ml沸水的50ml烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移到50ml的烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min，冷却至30℃以下，加入10mg/mL PAM，用蒸馏水定容至50ml。缓冲溶液：取0.2387g Na2HPO4·12H2O，加水溶解后定容至100ml。取0.0908g KH2PO4加水溶解后定容至100ml。将此二者按体积比配制成pH Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，置冰箱保存。所用试剂为分析纯，所用水均为二次蒸馏水；
2、制备已知α-淀粉酶浓度的测试体系：
在5ml具塞试管中，依次加入0.65ml 10mg/mL可溶性淀粉，0.70mL pH 5.3Na2HPO4-KH2PO4溶液，0.10mL 0.2％CaAc2溶液和0.1ml 0.9％NaCl溶液，将试管置水浴锅中，50℃预热，5min 后取出，加入5uL-300uL浓度为5μg/mLα-淀粉酶溶液，摇均匀时开始计时，放回50℃水浴锅中温浴，85min后取出，依次加入0.40mol/L 0.2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀。取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上。电压400V，狭缝为5nm，同步扫描激发波长λex和发射波长λem(λex＝λem)得到体系的RS光谱。在423nm处测定体系的散射光强度I423nm；
3、用上述2的方法制备试剂空白体系，测的共振散射强度Io；
4、计算ΔI423nm＝I0-I423nm的值，并做标准曲线：
在最佳实验条件下，取不同浓度AMS标准液，按实验方法进行测定，并以其共振散射强度ΔI423nm与AMS浓度C作图。AMS在0.00835-0.501μg/ml(0.00138-0.0827U/ml)范围内与ΔI423nm之间呈现良好的线性关系。其线性回归方程为：ΔI＝155C+13，相关系数R＝0.9857，检测限为0.0069μg/ml；
5、分别取20个人的唾液各1ml，10000rps离心30min，收集上清液，加蒸馏水稀释100倍，分别制成测试体系，求20个样品的ΔI，依据工作曲线，求得被测的20个人的唾液的α-淀粉酶浓度，见表1。
表1样品分析结果
采用本发明方法的测定与其它测定方法的结果进行比较，见表2：
表2 AMS测定方法比较
*1FAU定义为每1小时酶水解5.26g淀粉为1单位
Claims (2)
1.可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，其特征是：测定方法包括如下步骤：
1)制备已知α-淀粉酶活力的测试体系：
(1)在5mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml 10mg/mL可溶性淀粉和pH 5.3Na2HPO4-KH2PO4溶液，然后再加入0.10mL 0.2％CaAc2溶液和0.1ml 0.9％NaCl溶液，将试管置水浴锅中，50℃预热，放置5min；
(2)然后再加入5-300μL浓度为5μg/mLα-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回50℃水浴锅中温浴，放置85min；
(3)然后再依次加入0.40mol/L 0.2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀；
(4)用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I423nm；
2)制备试剂空白体系：
用步骤1)的方法制备试剂空白体系，但不加入α-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度I0；
3)计算ΔI423nm＝I0-I423nm的值；
4)以步骤1)中加入的α-淀粉酶的最终浓度为横坐标，以ΔI423nm为纵坐标，绘制工作曲线；
5)依据步骤1)的方法，制备检测体系，加入的α-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得被测样品的ΔI423nm；
6)根据工作曲线，求得被测样品中α-淀粉酶的浓度。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征是：α-淀粉酶在0.00835-0.501μg/mL范围内，α-淀粉酶的浓度与ΔI423nm呈良好的线性关系，线性方程ΔI423nm＝155C+13，检出限为0.0069μg/mL。
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