CN106405067A - 一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法 - Google Patents

一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其方法特征利用放射性同位素标记的标准物，在全细胞上，检测未被同位素标记的待测化合物与药物靶点结合的停留时间的方法；该法一方面避免了制备细胞膜的繁琐过程，可以获得更加接近于生理条件下的药物受体结合的分子动力学特征，另一方面，避免了对待测化合物进行同位素标记，能够实现大规模的测定药物与受体结合的分子动力学特征，尤其是药物受体停留时间，从而为新药的设计和发现提供更精准的依据。

Description

一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种检测未知化合物与药物靶点的结合分子动力学特征的检测方法，具体涉及一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法。
背景技术
药物受体结合的保留时间是一项近年来新兴的分子结合动力学概念。此概念定义为药物与受体结合后，两者形成复合体的存在时间。测定药物与靶点结合的分子动力学特征，在早期的药物设计与筛选过程中具有重要的意义。研究表明，优化药物在靶点上的停留时间可以改善药物的临床药效或者药物的毒性：针对药物作用的靶点，长停留时间的药物可以表现出更高，更持久的药效，而对于其他非药物作用靶点，具有短停留时间的药物可以有效的避免脱靶效应，减少药物产生的毒性。因此，建立新的检测方法，测定未知化合物的分子动力学特征，能够为早期的药物设计与筛选提供重要的工具。
目前，国内外对于药物受体结合的分子动力学研究，已经取得了一定的进展，包括一系列检测方法的建立。现阶段分子动力学研究主要是依靠制备重组细胞膜，然后通过测定同位素标记的待测物在受体上的结合速率和离解速率。即将具有高度表达药物靶点的细胞收集并分散打碎后，在制备的细胞膜系统上测定药物受体分子动力学特征。然而，这种方式存在着一定的局限性。首先，与使用完整的组织细胞相比，在打碎细胞后，药物受体所处的微环境会产生变化，比如，细胞膜电压、细胞骨架结构等。尤其对于G蛋白偶联受体，制备细胞膜的过程会造成细胞内三磷酸鸟苷的流失，影响G蛋白的激活。此外，在细胞膜实验中，大量的细胞器膜也会暴露在实验系统中，与放射性配体进行结合，导致非特异性的放射性配体结合增加。因此，不能够准确地反映药物与受体在生理条件下的相互作用。其次，现阶段的分子动力学测定方法，往往需要对待测化合物进行同位素或者荧光素标记，才能测定其分子动力学特征。当需要进行大批量的测定待测化合物的分子动力学特征时，对所有化合物都进行同位素标记往往是不现实的。因此，在早期的药物研究与筛选过程中，迫切的需要在检测方法上进行更新，以实现在全细胞上测量未被同位素标记的化合物的分子动力学特征。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术的局限性，提供一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，从而，一方面避免了制备细胞膜的繁琐过程，以获得更加接近于生理条件下的药物受体结合的分子动力学特征，尤其是药物受体停留时间，另一方面，避免了对待测化合物进行同位素标记，能够实现大规模测定药物与受体结合的分子动力学特征，从而为新药的设计和发现提供更精准的依据。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：
一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其方法为：
1.体外培养并收集重组细胞或者组织分离的动物细胞，分成三份，分别标记为a组、b组、c组；
2.将a组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，使a组细胞与放射性同位素标记的标准物在室温孵育20分钟；孵育20分钟后，向a组的1-11小组的反应容器中加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，与1-11小组的细胞混合液分别对应孵育不同的时间，即第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组10分钟, 第7小组12分钟, 第8小组15分钟, 第9小组20分钟,第10小组30分钟, 第11小组60分钟，以启动同位素标记的标准物的离解过程；a组的第12小组的细胞在孵育20分钟结束后，直接加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，孵育60分钟后测量标准物的非特异性同位素结合强弱；待a组细胞孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不同小组中的细胞收集在滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物，所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定标准物的放射性，之后利用单相离解速率模型计算同位素标记的标准物的离解速率常数；
3.将b组细胞分成12个小组，每组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞，分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，之后将放射性同位素标记的标准物加入到b组的1-11小组的反应容器中进行孵育，第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组10分钟, 第7小组12分钟,第8小组15分钟, 第9小组20分钟, 第10小组30分钟, 第11小组60分钟；孵育结束后测量放射性同位素标记的标准物在不同的孵育时间段与细胞的结合强度；在b组的第12小组反应容器中加入放射性同位素标记的标准物的同时，加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，并在孵育60分钟后测量第12小组反应容器中标准物非特异性的放射性结合强度；待b组细胞全部孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不同小组中的细胞收集在滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物，所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定放射性，获得数据后，使用单相结合速率模型计算同位素标记的标准物的结合速率常数；
4. 将c组细胞分成四大组即C1,C2,C3和C4,每一大组分为12个小组，每组重复2次，共96个反应容器，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中；之后向C1组中的1-12小组加入反应缓冲液与放射性同位素标记的标准物混合液，向C2组中的1-12小组加入低浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液, 向C3组中的1-12小组加入中浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液，向C4组中的1-12小组加入高浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液；然后将C1,C2,C3和C4大组中的1-11小组的细胞混合液进行孵育，即第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组15分钟, 第7小组30分钟, 第8小组60分钟, 第9小组90分钟, 第10小组120分钟, 第11小组180分钟，孵育结束后，检测在不同的孵育时间段下，加入了不同浓度待测物的细胞的放射性；与此同时向C1,C2,C3和C4的第12小组反应容器中，加入高浓度的竞争取代物，并测量C1,C2,C3和C4的第12小组反应容器中标准物非特异性的放射性结合强度；待c组细胞全部孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将不同组中的细胞收集在GF/C滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物；所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定放射性，利用Motulsky-Mahan数学模型，并根据步骤2和3中测定的放射性同位素标记的标准物的结合速率常数和离解速率常数，推算未被同位素标记的待测物的结合速率常数和离解速率常数，在此基础上，测定药物受体停留时间。
附图说明
下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。
图1是基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法操作流程图。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明
实例1、在大鼠脂肪细胞上测定药物在腺苷A1受体上的停留时间
具体步骤如下：
1.体外培养并收集重组细胞或者组织分离的动物细胞，分成三份，分别标记为d组、e组、f组；
2. 将d组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞；向d组的24个反应容器中加入浓度为2.5nM的[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤（A1受体拮抗剂，同位素标记的标准物），并在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,5mM 氯化镁, 0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，pH=7.4的反应缓冲液中，室温条件下孵育20 分钟；之后向1-11小组的反应容器中加入5 µL浓度为1μM的环戊腺苷即A1受体竞争取代物，第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组10分钟, 第7小组12分钟, 第8小组15分钟, 第9小组20分钟, 第10小组30分钟, 第11小组60分钟，以检测同位素标记的标准物的离解过程中的放射性强度；第12小组的反应容器中加入0.1mM环戊腺苷，并孵育60分钟以测量标准物的非特异性同位素结合强弱；孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将大鼠脂肪细胞收集在GF/C滤膜上，并使用含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5 mM 氯化镁，pH=7.4的洗脱液，分离游离态与结合态的[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤。所得滤膜在低温下，用洗涤缓冲液洗3次后，加入3.5 mL闪烁液；用闪烁光谱法测定其放射性。利用单相离解速率模型计算[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤即同位素标记的标准物的离解速率常数。
3. 将e组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞，分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH =7.4的反应缓冲液中；之后将浓度为2.5nM的[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤不重复的加入到1-12小组的反应容器中，并将1-11小组分别对应孵育0.5分钟, 1分钟, 2分钟, 4分钟, 8分钟, 10分钟, 12分钟, 15分钟, 20分钟, 30分钟, 60分钟后，测量放射性同位素标记的标准物在不同的孵育时间段与细胞的结合强度；同时在第12小组反应容器中，加入0.1mM的环戊腺苷，孵育60分钟后直接测量第12小组容器中非特异性同位素结合强弱；1-12组孵育结束后，使用快速真空抽滤方法，在GF/C滤膜上分离游离与结合的[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤。所得滤膜在低温下，使用含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液, 5mM 氯化镁, pH=7.4的洗脱液，洗3次后，加入3.5 mL闪烁液。用闪烁光谱法测定放射性。获得数据后，使用单相结合速率模型计算标记物的结合速率常数。
4. 将f组细胞分成四大组即f1,f2,f3和f4,每一大组分为12个小组，每组重复2次，共96个反应容器，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中；之后向f1组中的1-11小组细胞中加入反应缓冲液与放射性同位素标记的标准物混合液，向f2组中的1-11小组细胞中加入1nM的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液,向f3组中的1-11小组细胞中加入100nM的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液,向f4组中加入10μM的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液；之后将f1,f2,f3和f4组中1-11小组的细胞混合液分别对应孵育0.5分钟, 1分钟, 2分钟, 4分钟, 8分钟, 15分钟, 30分钟, 60分钟，90分钟，120分钟，180分钟，之后检测f1,f2,f3和f4组中1-11小组在不同孵育时间段下，加入了不同浓度待测物后，细胞的放射性；此外，在f1,f2,f3和f4组中的第12小组反应容器中，加入0.1mM的环戊腺苷，并测量f1,f2,f3和f4组中第12小组中标准物非特异性的放射性结合数据；孵育结束后，使用快速真空抽滤方法，在GF/C滤膜上，分离游离与结合的[3H]-8-环戊-1,3-二丙基黄嘌呤；所得滤膜在低温下，用洗涤缓冲液洗3次后，加入3.5mL闪烁液；用闪烁光谱法测定放射性，利用Motulsky-Mahan数学模型，并根据步骤2和3中测定的放射性配体的结合速率常数和离解速率常数，推算未被同位素标记的待测物的结合速率常数和离解速率常数，在此基础上，测定药物受体停留时间。

Claims (2)

1.一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其方法步骤特征为：
（1）体外培养并收集重组细胞或者组织分离的动物细胞，分成三份，分别标记为a组、b组、c组；
（2）将a组细胞分成12个小组，每小组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，使a组细胞与放射性同位素标记的标准物在室温孵育20分钟；孵育20分钟后，向a组的1-11小组的反应容器中加入高浓度的未被同位素标记的取代物，并将1-11小组的细胞混合液分别对应孵育不同的时间，即第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟,第5小组8分钟, 第6小组10分钟, 第7小组12分钟, 第8小组15分钟, 第9小组20分钟, 第10小组30分钟, 第11小组60分钟，以启动同位素标记的标准物的离解过程；a组的第12小组的细胞在孵育20分钟结束后，直接加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，孵育60分钟后测量标准物的非特异性同位素结合强弱；待a组细胞孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不同小组中的细胞收集在滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物，所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定标准物的放射性，之后利用单相离解速率模型计算同位素标记的标准物的离解速率常数；
（3）将b组细胞分成12个小组，每组重复2次，置于24个反应容器中，每个反应器中含3000个细胞，分散在含有50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中，之后将放射性同位素标记的标准物加入到b组的1-11小组的反应容器中进行孵育，即第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组10分钟, 第7小组12分钟, 第8小组15分钟, 第9小组20分钟, 第10小组30分钟, 第11小组60分钟；孵育结束后测量放射性同位素标记的标准物在不同的孵育时间段与细胞的结合强度；在b组的第12小组反应容器中加入放射性同位素标记的标准物的同时，加入高浓度的未被同位素标记的竞争取代物，并在孵育60分钟后测量第12小组反应容器中标准物非特异性的放射性结合强度；待b组细胞全部孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将1-12不同小组中的细胞收集在滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物，所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定放射性，获得数据后，使用单相结合速率模型计算同位素标记的标准物的结合速率常数；
（4）将c组细胞分成四大组即C1,C2,C3和C4,每一大组分为12个小组，每组重复2次，共96个反应容器，每个反应器中含3000个细胞；将上述细胞分散在50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液中；之后向C1组中的1-12小组加入反应缓冲液与放射性同位素标记的标准物混合液，向C2组中的1-12小组加入低浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液, 向C3组中的1-12小组加入中浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液，向C4组中的1-12小组加入高浓度的待测物与放射性同位素标记的标准物混合液；然后将C1,C2,C3和C4大组中的1-11小组的细胞混合液孵育不同的时间，即第1小组孵育0.5分钟, 第2小组1分钟, 第3小组2分钟, 第4小组4分钟, 第5小组8分钟, 第6小组15分钟, 第7小组30分钟,第8小组60分钟, 第9小组90分钟, 第10小组120分钟, 第11小组180分钟，孵育结束后，检测在不同的孵育时间段下，加入了不同浓度待测物的细胞的放射性；与此同时向C1,C2,C3和C4的第12小组反应容器中，加入高浓度的取代物，并测量C1,C2,C3和C4的第12小组反应容器中标准物非特异性的放射性结合强度；待c组细胞全部孵育测量结束后，使用快速真空抽滤方法，将不同组中的细胞收集在GF/C滤膜上，并使用含有三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、氯化镁的洗脱液，分离游离态与结合态的放射性同位素标记的标准物；所得滤膜加入闪烁液后，用闪烁光谱法测定放射性，利用Motulsky-Mahan数学模型，并根据步骤2和3中测定的放射性同位素标记的标准物的结合速率常数和离解速率常数，推算未被同位素标记的待测物的结合速率常数和离解速率常数，在此基础上，测定药物受体停留时间。
2.根据权利要求1所述的一种基于全细胞的药物靶点停留时间的检测方法，其特征是：所述50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、5mM 氯化镁、0.1% (w/v) 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、pH=7.4的反应缓冲液；此缓冲体系能够保证细胞的完整性和生理状态，因此能够获得更加接近于生理条件下的药物受体结合的分子动力学特征。
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