CN104041409B - 毛叶木姜子的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，具体来说是一种利用组织培养对毛叶木姜子进行快速繁殖的方法，步骤包括(1)培养室的准备；(2)外植体材料筛选及处理；(3)诱导培养；(4)增殖培养；(5)生根培养；(6)苗木移栽；本发明方法成功实现了毛叶木姜子的组培规模化快繁，可周年生产优良的毛叶木姜子组培苗，用此全光照组培育苗方法，几乎可省去所有照明电，极大降低了用电成本，有效解决了组培生产中电费成本高昂的问题，而所用遮光物品大多成本低廉、简便易得，遮光方法操作方便、简单易学。

Description

毛叶木姜子的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物培养技术领域，具体来说是一种利用组织培养对毛叶木姜子进行快速繁殖的方法。

背景技术

毛叶木姜子(litsea mollifolia Chun)，樟科木姜子属落叶小乔木。目前，毛叶木姜子的组织培养研究国内外尚未见报道。其同属植物的组培研究发现，山苍子较易于建立组培快繁技术体系，而杨叶木姜子、四川木姜子等组培体系建立的效果要达到规模化生产差距仍较大。由于毛叶木姜子组培未见报道，因而只能参考同属植物，与本发明较相似的现有技术方案为一篇学术论文“木姜子组织培养技术体系研究”，但该报道仅建立了技术体系，但并未在生产上推广使用。而我们毛叶木姜子的组培生产技术是已经在进行规模化生产。

与本发明相关的现有技术方案

初代培养中以MS+BA2.0mg·L^-1+IBAO.5mg·L^-1为最佳组合培养基配方。依此配方确定11月中旬为取材的最佳季节,山苍子为首选树种(启动率90.3％、增殖数3.3、污染率30.3％),0.1％升汞对外植体处理时间4+4分钟效果较好。

继代培养，培养基为：MS+BA2.0mg·L^-1+IBAO.1mg·L^-1。其增殖系数高达7.7，丛生芽多且生长适中，30天可增殖一代，年理论增殖系数6.6x10⁷。继代10次以后，用改良MS或B5代替MS可以使继代材料诱导分化恢复正常。防止交叉污染，用500mg·L^-1浓度的硫酸链霉素和500mg·L^-1浓度的硫酸庆大霉素抑菌效果较好。

生根培养,瓶内生根培养基为：1/2MS+IBA0.5mg·L^-1+1.0mg·L^-1活性炭。以纯砂和珍珠岩1:1混合的基质成活率最高(52.0％)，瓶外带菌生根移栽用500mg·L^-1ABT溶液对插条进行基部速蘸8秒钟，插入纯砂中，生根效果较佳。

简化培养程序,在污染率允许范围内(一般5％)可选用已煮沸过的自来水代替蒸馏水，用100℃沸水煮5分钟空培养瓶代替高压灭菌操作，可达到同样效果。

现有技术的缺点

1.以现有木姜子采条接种方法，所选外植体材料多为野外成年树当年生枝条带芽茎段。该方法有着明显的缺点：第一，由于野外环境恶劣，采条接种后污染均较严重(污染率多在50％以上)。第二，此方法选出来的枝条，生理状态受成年母株影响明显，成熟效应较显著，不利于诱导成苗。第三，由该方法所建立的无菌系，在规模化生产一段时间后，瓶苗内生菌情况严重(达到50％以上)。

鉴于此，我们在采条前，进行了优树的促萌条处理。将在林分内选择好的优良单株，直接进行基部的截干或环割处理，待基部萌条产生时再采条。采条时选择两个连续晴天的午后，利用自然光的天然紫外线杀菌，所采外植体为优树基部萌条的半木质化枝条。该方法下所获得的外植体材料污染率低(一般在10％以内)，萌芽率高(一般在90％以上)，最明显的是培养后期内生菌的情况显著好转(基部萌条的内生菌发生率比下部枝条降低70％以上，而中部和上部枝条的内生菌发生率比下部枝条更高)。

2.规模化组培生产中，随瓶苗转接次数的增多，会逐渐出现严重的内生菌污染问题，若不及时处理，会给生产造成很大损失。这类污染，主要表现为在培养基表面或材料基部出现粘液状物体、菌丝或浑浊的水浸，有时甚至出现泡沫发酵状。就现有报道的技术而言，多是采用在培养基中加入适量抗生素的办法，通过植物吸收来抑制或消除污染。但在工厂化育苗过程中，这种处理方法有着明显的缺点：首先，不同的菌类会造成不同的污染，根据污染的菌类和不同污染程度，所选用的抗生素种类和浓度会有所不同，这在实际生产中是很难精细操作的，需花费大量的人力来进行分类处理，从成本角度来说，往往是得不偿失的。其次，抗生素不可经高温灭菌，需采用过滤灭菌的方法进行操作，由于操作较麻烦和复杂，普通工人很难有效完成该步骤，这就对技术人员提出了较高的要求，不利于该组培技术的规模化推广。最后，对污染瓶苗的连续用药会使植株产生抗药性或生长受阻，但停药后又很快会再次出现污染现象，始终是治标不治本。

鉴于此，对于规模化组培生产中，随瓶苗转接次数的增多，逐渐出现的严重内生菌污染问题。均采用每次瓶苗转接前坚持要求接种人员在超净工作台上将瓶苗对着光进行透光观察，对于表面非致死的污染瓶苗，采取：无菌弯头剪小心的剪下植株靠近顶部0.5～1cm的芽段，再用无菌镊子取出，剪刀镊子均不要沾到培养基与瓶壁，剪下的茎段接于新的培养基上，一般按此方法转接两次后，就能获得非常干净的组培苗。

3.现有组培方法采用的是室内培养，通过在培养架上面安装灯管提供植物生长的稳定光源，控制植物光照时间约在12～16h/d。该方法的缺点是显而易见的：首先是用电成本高昂，电费的支出占去了组培成本的很大一部分；其次是苗木的生长状态较差，人造光源由于波段不足，光质远远不如自然光源，所培养的苗木较细弱且极易出现玻璃化现象，这在毛叶木姜子这个树种的培养中尤其明显。此外，在瓶苗移栽前还必须进行一定时间的炼苗，增加了出苗时间。

我们在长期摸索的基础上，确定了适合毛叶木姜子组培生长各个阶段的自然光照度范围，利用自然光培养毛叶木姜子组培苗，不但节约用电成本90％以上，还解决了困扰组培生产的玻璃化问题，省却了炼苗环节，缩短了育苗周期，促进了组培规模化生产效益的明显提高

发明内容

本发明的目的是针对毛叶木姜子的组织培养研究国内外尚未见报道的问题，提供一种毛叶木姜子的组织培养方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种毛叶木姜子的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)培养室的准备

(2)外植体材料筛选及处理

选择优良单株，进行基部截干或环割处理，待基部萌条产生后，在有阳光的午后进行采条，得到带芽半木质化萌条，萌条清洗干净后用毛刷轻刷除去杂质，利用自来水流水冲洗2～3h后沥干，然后在无菌条件下利用质量浓度为75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，转入质量浓度为0.1％的HgCl₂消毒4～7min，再以无菌水冲洗5次，沥干水分备用；

(3)诱导培养

将萌条修剪为1cm长茎段，剪去叶片，插入含有1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1的培养基瓶中进行不定芽的诱导，置于全光照培养室内培养架的第二层上，关闭培养室顶部和侧面的遮阴网，培养7d后清除被污染瓶苗，然后将顶部和侧面遮阴网全部打开继续培养，培养时控制光照在5000lux，温度25℃，湿度50～60％；

(4)增殖培养

当外植体长2.0cm以上后切断成长度为0.5～0.7cm后接入MS+6-BA3.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1继代培养基中，然后置于培养架的第一层进行增殖培养，控制光照强度8000lux，温度25℃，湿度50～60％；

(5)生根培养

芽苗增殖培养30天后，将株高2.0cm以上的健壮无根单苗接种于含有4/5MS+IBA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Ac0.1g·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1生根培养基上，然后置于自然光条件下的培养室内培养架的第二层或第三层进行生根培养，将光照控制在3000lux内，培养10天后，提高光照强度至6000lux,温度控制在25℃、湿度50～60％，再培养10天后，芽苗根系长至1～1.5cm后，此时将光照强度提高到10000lux，温度升高至27℃再培养7～10天，再次升高光照强度至15000lux，温度提高至30℃，再培养4～5天后，提高光照强度至25000lux，控制室内外温度保持一致，最后培养3～5天后得到根系健壮发达的苗木；

(6)苗木移栽

芽苗根系长至2～2.5cm时，清除培养基，将芽苗移栽至利用2g·l^-1的高锰酸钾溶液消毒24小时的基质中培育成苗，浇水后利用遮阴网遮阴60～90％，控制湿度85％以上，逐步转入正常管理。

进一步的，步骤(6)中，所述基质是由重量比为75％的泥炭土和25％的黄心土组成。

本发明的有益技术效果是：

1.成功实现了毛叶木姜子的组培规模化快繁，可当年生产优良的毛叶木姜子组培苗。

2.用此全光照组培育苗方法，几乎可省去所有照明电，极大降低了用电成本，有效解决了组培生产中电费成本高昂的问题。而所用遮光物品大多成本低廉、简便易得，遮光方法操作方便、简单易学。

3.用此全光照组培育苗方法，腋芽萌动可提前3d，转接时间可提前10d，生根时间提前10d。无需特别炼苗，生根与炼苗属于同时进行，整个生根炼苗阶段需时34～40d(夏季34d，冬季40d，春秋季37d左右)。而我们采用常规培养方法作对比，生根阶段需30d，炼苗阶段还需15～25d(夏季45d，冬季55d，春秋季50d左右)。此方法节省育苗周期1/4以上，且炼苗所得的苗木粗壮程度、叶色浓绿程度和根系匀称发达程度均高于前期室内光照培养，后期再炼苗的产品。

4.利用自然光培养的苗木，对于外界环境的适应性强，苗木的生长速度、健壮程度、形态色泽等均优于人工光源培养的瓶苗。不但彻底解决了毛叶木姜子室内培养中玻璃化严重的现象，也大大提高了苗木质量。

5.利用每次转接前的观察与上部茎段转接处理，简便而长期有效的解决了组培规模化生产中内生菌污染严重的问题。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.光照培养室的准备

自然光培养室的顶部和四周一般均采用透光阳光板或玻璃，这样可保证光照度的充足。在最顶层安装一副遮光率90％的遮阴网，第二层安装一副遮光率50％的遮阴网，培养架上部再安装一层遮阴网(4～9月用较厚的布，10月-次年3月用纱即可)。培养室周围，设双层遮阴帘，一层为遮光率75％的厚布，一层为遮光率30％的薄纱(类似家用双层窗帘)。通过顶部三层遮阴网和四周两层遮阴帘的不同组合搭配，获得我们育苗所需的各种光照强度。培养室内设培养架，层数根据生产规模而定。

2.外植体材料的筛选及处理

选取优良单株进行基部的截干或环割处理，待基部萌条时，在两个连续晴天的午后，采基部萌条的半木质化枝条。剪其带芽茎段作为外植体，用市售洗衣粉清洗10～15min，用毛刷轻刷以除去杂质，再用自来水流水冲洗2～3h，沥干。在超净工作台上，将外植体用质量浓度为75％酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，转入0.1％HgCl₂消毒4～7min，再以无菌水冲洗5次，沥干表面水分备用。

3.诱导培养：将枝条修剪为1cm长茎段，剪去叶片，插入1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+0.7％琼脂+市售白糖30g.L^-1(灭菌后pH5.8)的培养基中进行不定芽的诱导。接好的瓶苗置于全光照培养室的培养架第二层，顶部遮阴网全部关闭，侧面遮光帘全部拉拢。培养7d后清除污染瓶苗，顶部遮阴网与侧面遮光帘全部打开，通过顶部遮阴网与侧边遮阴帘的配合使用，将光照强度控制在5000lux以内。培养温度25℃，湿度50～60％。

4.增殖培养：外植体接种7天后，腋芽开始萌动(室内培养的腋芽萌动需10d)，25d后(室内培养需35d)将长至2.0cm以上的芽苗切段(0.5cm左右)接入继代培养基：MS+6-BA3.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+0.7％琼脂+市售白糖30g.L^-1(灭菌后pH5.8)。增殖阶段的瓶苗需置于培养架第一层，通过顶部遮阴网与侧边遮阴帘的配合使用，将光照强度控制在8000lux以内。培养温度控制在25℃，湿度50～60％。

5.生根培养

芽苗于增殖培养基上生长30d后(室内培养需40d)，将株高2.0cm以上的健壮无根单苗接于生根培养基上：4/5MS+IBA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Ac0.1g·L^-1+0.7％琼脂+市售白糖30g.L^-1(灭菌后pH5.8)。生根阶段的芽苗置于培养架第二、三层，通过遮阴网与遮阴帘的配合使用，将光照强度控制在3000lux以内。培养10d后，提高光照强度至6000lux。培养温度25℃，湿度50～60％。培养20d后，芽苗根系可长至1～1.5cm左右(室内需30d)，此时将光照强度提高到10000lux，培养温度27℃。培养7～10d后，将光照强度提高到15000lux，培养温度提高到30℃。再培养4～5d后，将光照强度提高到25000lux，关闭空调，打开培养室门窗，使室内外温度保持一致，3～5d后，苗木粗壮，木质化程度高，根系发达健壮，可直接从培养室移至室外栽植。

6.苗木移栽

芽苗根系长到2～2.5cm时，无需炼苗，将瓶苗上附着的培养基清洗干净，再栽至泥炭土：黄心土＝3:1的基质中培育成苗。移栽基质需用2g·L^-1的高锰酸钾溶液消毒24h，栽入的组培苗可直接移栽，也可用0.2％多菌灵溶液浸泡10min后移栽，栽后淋足定根水，培养前期用塑料薄膜保持湿度在85％以上，用遮阴网遮阴60～90％，之后逐渐降低湿度和增强光照，逐步转入正常管理。

7.污染处理

对于规模化组培生产中，随瓶苗转接次数的增多，逐渐出现的严重内生菌污染问题。均采用每次瓶苗转接前坚持要求接种人员在超净工作台上将瓶苗对着光进行透光观察，对于表面非致死的污染瓶苗，采取：无菌弯头剪小心的剪下植株靠近顶部0.5～1cm的芽段，再用无菌镊子取出，剪刀镊子均不要沾到培养基与瓶壁，剪下的茎段接于新的培养基上，一般按此方法转接两次后，就能获得非常干净的组培苗。

实施例2

(1)培养室的准备

(2)外植体材料筛选及处理

选择优良单株，进行基部截干或环割处理，待基部萌条产生后，在有阳光的午后进行采条得到带芽半木质化萌条，萌条清洗干净后用毛刷轻刷除去杂质，利用自来水流水冲洗2h后沥干，然后在无菌条件下利用质量浓度为75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，转入质量浓度为0.1％的HgCl₂消毒4min，再以无菌水冲洗5次，沥干水分备用；

(3)诱导培养

将萌条修剪为1cm长茎段，剪去叶片，插入含有1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1的培养基瓶中进行不定芽的诱导，置于全光照培养室内培养架的第二层上，关闭培养室顶部和侧面的遮阴网，培养7d后清除被污染瓶苗，然后将顶部和侧面遮阴网全部打开继续培养，培养时控制光照在5000lux，温度25℃，湿度50％；

(4)增殖培养

当外植体长2.0cm后切断成长度为0.5cm后接入MS+6-BA3.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1继代培养基中，然后置于培养架的第一层进行增殖培养，控制光照强度8000lux，温度25℃，湿度50％；

(5)生根培养

芽苗增殖培养30天后，将株高2.0cm的健壮无根单苗接种于含有4/5MS+IBA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Ac0.1g·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1生根培养基上，然后置于自然光条件下的培养室内培养架的第二层或第三层进行生根培养，将光照控制在3000lux内，培养10天后，提高光照强度至6000lux,温度控制在25℃、湿度50％，培养10天后，芽苗根系长至1cm后，此时将光照强度提高到10000lux，温度升高至27℃培养7天，再次升高光照强度至15000lux，温度提高至30℃，再培养4天后，提高光照强度至25000lux，控制室内外温度保持一致，再培养3天后得到根系健壮发达的苗木；

(6)苗木移栽

芽苗根系长至2cm时，清除培养基，将芽苗移栽至利用2g·l^-1的高锰酸钾溶液消毒24小时的基质中培育成苗，浇水后利用遮阴网遮阴60％，控制湿度85％以上，逐步转入正常管理。

其中，基质是由重量比为75％的泥炭土和25％的黄心土组成。

实施例3

(1)培养室的准备

(2)外植体材料筛选及处理

选择优良单株，进行基部截干或环割处理，待基部萌条产生后，在有阳光的午后进行采条得到带芽半木质化萌条，萌条清洗干净后用毛刷轻刷除去杂质，利用自来水流水冲洗3h后沥干，然后在无菌条件下利用质量浓度为75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，转入质量浓度为0.1％的HgCl₂消毒7min，再以无菌水冲洗5次，沥干水分备用；

(3)诱导培养

将萌条修剪为1cm长茎段，剪去叶片，插入含有1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1的培养基瓶中进行不定芽的诱导，置于全光照培养室内培养架的第二层上，关闭培养室顶部和侧面的遮阴网，培养7d后清除被污染瓶苗，然后将顶部和侧面遮阴网全部打开继续培养，培养时控制光照在5000lux，温度25℃，湿度60％；

(4)增殖培养

当外植体长2.2cm后切断成长度为0.7cm后接入MS+6-BA3.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1继代培养基中，然后置于培养架的第一层进行增殖培养，控制光照强度8000lux，温度25℃，湿度60％；

(5)生根培养

芽苗增殖培养30天后，将株高2.2cm健壮无根单苗接种于含有4/5MS+IBA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Ac0.1g·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1生根培养基上，然后置于自然光条件下的培养室内培养架的第二层或第三层进行生根培养，将光照控制在3000lux内，培养10天后，提高光照强度至6000lux,温度控制在25℃、湿度60％，培养10天后，芽苗根系长至1.5cm后，此时将光照强度提高到10000lux，温度升高至27℃培养10天，再次升高光照强度至15000lux，温度提高至30℃，再培养5天后，提高光照强度至25000lux，控制室内外温度保持一致，再培养5天后得到根系健壮发达的苗木；

(6)苗木移栽

芽苗根系长2.5cm时，清除培养基，将芽苗移栽至利用2g·l^-1的高锰酸钾溶液消毒24小时的基质中培育成苗，浇水后利用遮阴网遮阴90％，控制湿度85％以上，逐步转入正常管理。

其中，基质是由重量比为75％的泥炭土和25％的黄心土组成。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.毛叶木姜子的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养室的准备

(2)外植体材料筛选及处理

选择优良单株，进行基部截干或环割处理，待基部萌条产生后，在有阳光的午后进行采条，得到带芽半木质化萌条，萌条清洗干净后用毛刷轻刷除去杂质，利用自来水流水冲洗2～3h后沥干，然后在无菌条件下利用质量浓度为75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，转入质量浓度为0.1％的HgCl₂消毒4～7min，再以无菌水冲洗5次，沥干水分备用；

(3)诱导培养

将萌条修剪为1cm长茎段，剪去叶片，插入含有1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1的培养基瓶中进行不定芽的诱导，置于全光照培养室内培养架的第二层上，关闭培养室顶部和侧面的遮阴网，培养7d后清除被污染瓶苗，然后将顶部和侧面遮阴网全部打开继续培养，培养时控制光照在5000lux，温度25℃，湿度50～60％；

(4)增殖培养

当外植体长2.0cm以上后切断成长度为0.5～0.7cm后接入MS+6-BA3.0mg·L^-1+IBA0.2mg·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1继代培养基中，然后置于培养架的第一层进行增殖培养，控制光照强度8000lux，温度25℃，湿度50～60％；

(5)生根培养

芽苗增殖培养30天后，将株高2.0cm以上的健壮无根单苗接种于含有4/5MS+IBA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Ac0.1g·L^-1+0.7％琼脂+白糖30g·L^-1生根培养基上，然后置于自然光条件下的培养室内培养架的第二层或第三层进行生根培养，将光照控制在3000lux内，培养10天后，提高光照强度至6000lux,温度控制在25℃、湿度50～60％，再培养10天后，芽苗根系长至1～1.5cm后，此时将光照强度提高到10000lux，温度升高至27℃再培养7～10天，再次升高光照强度至15000lux，温度提高至30℃，再培养4～5天后，提高光照强度至25000lux，控制室内外温度保持一致，最后培养3～5天后得到根系健壮发达的苗木；

(6)苗木移栽

芽苗根系长至2～2.5cm时，清除培养基，将芽苗移栽至利用2g·L^-1的高锰酸钾溶液消毒24小时的基质中培育成苗，浇水后利用遮阴网遮阴60～90％，控制湿度85％以上，逐步转入正常管理。

2. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(6)中，所述基质是由重量比为75％的泥炭土和25％的黄心土组成。