CN104023751A - 靶向递送至表达vla-4的细胞的整联蛋白拮抗剂结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式I化合物，其中在详细描述和权利要求中定义了R1、R2和n。特别是，本发明涉及式I化合物用于制备和递送结合部分，例如小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物，其将VLA-4整联蛋白拮抗剂连接到表达VLA-4的靶细胞上。

Description

靶向递送至表达VLA-4的细胞的整联蛋白拮抗剂结合物
本发明涉及包含适合的连接体和官能团的有效且选择性小分子整联蛋白拮抗剂的合成和反应，所述的官能团与包含活性亲核基团例如硫醇的其它分子发生化学反应，以致在连接部分和靶向实体之间形成共价连接。小分子靶向拮抗剂结合同源受体系统，如VLA-4拮抗剂结合VLA-4二聚体(如α4β1拮抗剂结合整联蛋白α4β1极迟抗原-4二聚体)。共价连接的部分包括小分子治疗剂、聚合物、肽和寡核苷酸。所包括的是含有5’-硫代寡核苷酸，用于形成5’-硫代-siRNA衍生物，作为能靶向递送所述siRNAs的工具。与适合的转染试剂连接的衍生化的siRNAs有助于向表达整联蛋白受体的细胞选择性递送siRNAs，从而通过RNA干扰(RNAi)阻断靶基因的表达。
VLA-4(极迟抗原-4，也称为α4β1)是整联蛋白二聚体。它由两个亚基组成，包括CD49d(α)和CD29(β)。VLA-4表达在白细胞质膜上，其结合血管上的VCAM-1(被细胞因子激活后)，帮助白细胞粘附至血管内皮(引起动脉粥样硬化或其它炎性疾病)。某些癌细胞也可以表达VLA-4，其结合粘附在内皮上的VCAM-1(增加转移的风险)。因此，结合VLA-4的化合物可以阻断与VCAM-1的相互作用，从而潜在地治疗或预防这种相互作用介导的疾病。或者，结合VLA-4的化合物可以用于递送制剂，向表达VLA-4的组织或细胞递送药物、核酸或其它治疗化合物，用于治疗或预防疾病。
RNA干扰是众所周知的方法，其中信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质被互补或部分互补的寡核苷酸的关联或结合而干扰，所述的寡核苷酸例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小RNA(miRNA)或反义寡核苷酸。siRNA是双链RNA分子，通常长度范围在19-25个核苷酸，其与细胞质中一套蛋白质关联，称为RISC(RNA-诱导的沉默复合体)。RISC最终分离双链siRNA，使得一条链结合或与互补的mRNA分子或mRNA分子的部分互补部分关联，之后mRNA被RISC破坏或另外阻断翻译，从而抑制编码蛋白质或基因产物的表达。
核酸例如siRNA用于治疗应用(特别是用于人的全身施用)的一个问题存在于递送核酸至：(1)特定靶组织或细胞类型和(2)那些细胞的细胞质(即存在mRNA并且翻译成蛋白质的地方)。部分递送问题在于这样的事实：核酸带负电荷，并且容易降解(特别是如果没有修饰)，能被肾脏有效过滤，并且无法通过自身容易地转运至细胞质。因此，大量研究集中在用多种载体和制剂(包括脂质体、微团、肽、聚合物、结合物和适配体)解决递送问题。参见Ling等人,Advances in Systemic siRNA Delivery,Drugs Future34(9):721(2009年9月)。一些更有希望的递送载体包括使用脂质系统，包括脂质纳米粒。参见Wu等人,Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery,AAPS J.11(4):639–652(2009年9月)；Hope等人的国际专利申请公布WO2010/042877(“Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery ofNucleic Acids”)。然而，仍需要进一步改善向特定靶细胞和向细胞质靶向siRNA以及其它物质，例如小分子、肽、其它核酸、荧光部分和聚合物。
本发明涉及式I化合物：
其中R1、R2和n在详细描述和权利要求中定义。特别是，本发明涉及式I化合物用于改善向表达整联蛋白α4β1(极迟抗原-4)二聚体的靶细胞递送结合部分，例如小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物，用于多种治疗和其它应用。本发明还涉及制备和使用这类化合物的方法。
附图简述
表1显示了特别的5’-衍生的siRNA单链和双链的组成。
表2显示了小分子siRNA结合物的分析数据。
表3显示了siRNA序列，其中5’-反义链用Nu547衍生。
表4显示了小分子siRNA结合物在整联蛋白拮抗剂分析中的能力和siRNA KD数据。
表5显示了FITC异构体标记的试剂的鉴别、表征和结合能力。
图1显示了直方图(“B”：双链体-27500nM和实施例14010μM；“A”：双链体-27)。
图2显示了代表性的siRNA摄取图(双链体-27(500nM))。
图3显示了与10μM实施例FITC-5结合的FITC(LFA-1拮抗剂-标记的FITC)的Jurkat细胞图。
图4显示了与10μM实施例FITC-14结合的FITC(VLA-4拮抗剂标记的FITC)的Jurkat细胞图。该直方图表示存在含有VLA-4靶向元件的siRNA双链体时的迁移。存在VLA-4拮抗剂实施例140时，这种迁移是扁圆形的。
图5显示了当用siRNA双链体处理时H1299细胞中AHA1表达的降低，所述的双链体在5’-正义链上用整联蛋白靶向小分子衍生化。y-轴表示观察到的AHA1表达水平。更低的棒表示更大程度的敲除(更高程度的siRNA转染)；高棒表示更低程度的敲除(即更低程度的siRNA转染)。蓝色的双链体在正义链的5’-末端上有靶向修饰；粉色那些在正义链的5’-末端上有靶向修饰以及Nu547荧光团连接到反义链的5’-末端。
图6显示了GAPDH mRNA表达水平，细胞健康的一个标志物。对于用衍生的siRNA处理的那些细胞，与模拟和未处理细胞类似的表达水平表明在处理浓度和过程中不存在细胞毒性。
除非另外说明，否则下列描述和权利要求中所用的具体术语和短语如下定义：
术语“部分”表示原子或化学键合的原子的基团，其通过一个或多个化学键连接另一个原子或分子，从而形成分子的部分。例如，式I的变量R1和R2表示通过所示的共价键连接到式I所示结构的部分。
术语“结合部分”表示治疗或可用化合物、肽、聚合物、小分子、荧光团部分、寡核苷酸或核酸部分。实例包括药物、治疗肽、反义寡核苷酸、siRNA和异硫氰酸荧光素(FITC)。
除非另外说明，否则术语“氢”表示氢原子部分(-H)，而不是H2。
术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘部分。
术语“烷基”表示具有1至25个碳原子的脂肪族直链或支链的饱和烃部分。
术语“TFA”表示三氟乙酸。
除非另外说明，否则术语“式…化合物”表示选自结构式定义的化合物类的任何化合物(如果没有另外说明，包括任何此类化合物的任何可药用盐或酯)。
术语“可药用盐”表示保留游离碱或游离酸的生物功效和性质的那些盐，其不是生物学的或另外不需要的。盐可以用无机酸形成，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，优选盐酸，可以用有机酸形成，例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等。此外，盐可以通过向游离酸中加入无机碱或有机碱而制备。无机碱衍生的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙和镁盐等。有机碱衍生的盐包括但不限于伯、仲、叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂等的盐。取决于取代模式，本发明化合物还可以作为两性离子存在。
本发明化合物可以以可药用盐形式存在。本发明化合物还可以以可药用酯形式存在(即式I酸的甲酯和乙酯，用作前药)。本发明化合物还可以是溶剂化的，即水合的。溶剂化可以在制备过程中形成或由于最初的式I无水化合物的吸湿性引起(水合)。
具有相同分子式但性质或它们原子的键合顺序或它们原子空间排列不同的化合物称为“异构体”。它们原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。非对映异构体是在一个或多个手性中心上存在对立构型的立体异构体，其不是对映异构体。存在一个或多个不对称中心且彼此不能重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物含有不对称中心，例如，如果碳原子键合四个不同基团，一对对映异构体是可能的。对映异构体可以通过它的不对称中心的绝对构型来表征，并且通过Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-顺位规则或通过其中分子旋转偏振光平面的方式描述，并命名为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单个对映异构体或作为其混合物存在。含有等比例对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
术语“治疗有效量”表示化合物的量，其能有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长所治疗个体的生存。治疗有效量的确定在本领域技术内。本发明化合物的治疗有效量或剂量可以在宽泛的限量内变化，并且可以以本领域已知的方法测定。该剂量在每个具体病例中将调至单个需求，包括具体施用的化合物、施用途经、治疗的病症以及治疗的患者。日剂量可以以单个剂量或分开的剂量施用，或用于非肠道施用，它可以是连续输注给药。
术语“可药用载体”旨在包括任何和所有与药物施用相容的材料，包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及其它与药物施用相容的材料和化合物。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，其在本发明组合物中的用途值得考虑。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
具体而言，本发明涉及式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n为1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
上面结构中所用的符号用于表示结构或部分通过共价键连接到基础分子的地方。此外，与上面符号一起使用的短语“至PEG”或“至S”或类似语言表示如果存在多重连接点，结构或部分连接到基础分子的地方或如何连接到基础分子。例如，如果R2是下式化合物：
其中X是下式化合物：
那么基于式I的结构是：
其中R1、R3和n如式I所定义的。
本发明还涉及制备和使用式I化合物的方法以及包含这类化合物的药物组合物。式I化合物可用于改善小分子、蛋白质、核酸、聚合物、荧光标志物和其它物质递送至表达VLA-4受体的靶细胞。在特别的实施方案中，本发明涉及包含式I化合物的组合物和制剂，其可用于将siRNA递送至表达VLA-4受体的靶细胞质，通过RNA干扰抑制某些靶蛋白的表达。
在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物在制剂中有助于将核酸例如siRNA递送至表达VLA-4受体的肿瘤细胞和其它细胞类型的用途。而且，式I化合物在合成递送制剂治疗炎症和增殖性障碍例如癌症中的用途是本发明的部分。
R1表示小分子整联蛋白拮抗剂，其靶向式I化合物至VLA-4整联蛋白受体复合物，从而有助于递送至表达这类受体的细胞。
在特别的实施方案中，靶向R1部分的小分子整联蛋白拮抗剂连接在这样位点，以致相比游离的小分子整联蛋白拮抗剂，小分子与整联蛋白受体的结合亲和力基本上没有降低。式I的R1部分靶向VLA-4(整联蛋白α4β1或极迟抗原-4)二聚体。
在特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3。
在其它实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
在其它特别的实施方案中，R1是下式的VLA-4靶向部分：
或其可药用盐或酯。
R2可以表示活性部分，其可以与治疗剂或其它有用化合物或含有强亲核基团的结合部分，例如含硫羟基的分子形成连接。这些活性部分的实例包括选自下列的部分：
或者，R2可以表示已经连接至结合部分的部分，所述的结合部分例如治疗剂或其它有用化合物、蛋白质或寡核苷酸(R3)。更特别地，R2可以表示下式部分：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在特别的实施方案中，R3表示寡核苷酸。在更特别的实施方案中，R3表示RNA分子正义链的5’-末端，其可以以单链或双链体例如siRNA分子存在。该siRNA分子，也称为RNAi剂，抑制细胞中靶基因的表达。在特别的实施方案中，R3是siRNA分子，其基本上由长度15至30个核苷酸的寡核糖核苷酸链组成，其中正义寡核糖核苷酸链的5’端偶联至上面结构所示的R2，并且与对应于靶基因的mRNA的至少一部分互补。在其它实施方案中，R3是在它的5’-末端连接的DNA的寡核苷酸。这些衍生化的DNA可以以单链或与另一个寡核苷酸互补链杂交的一条链存在。寡核苷酸链可以是未修饰的或为了代谢稳定性而修饰的。这些修饰包括但不限于在磷酸酯(例如硫代磷酸酯)和2’-羟基(例如2’-O-甲基和2’-氟)上在特定位点取代。
在特别的实施方案中，式I的R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3包括下面式5(基于式I)所示的RNA的正义链：
其中R1、n和X如式I所定义的。
在其它特别的实施方案中，正义链可以结合至反义链。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示小分子或蛋白质，从而形成共价连接的，特别是式I的靶向实体。
在更特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示治疗小分子或蛋白质。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示可用于使用细胞显微技术显影这些整联蛋白受体结合的荧光部分。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示具有原生活性硫化物的聚合物。更特别地，R3可以表示可用于复合和递送siRNA至细胞表面和细胞质区域的阳离子聚合物。
在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中R3是下面所示的异硫氰酸荧光素(FITC)的一种结构异构体：
在其它更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中R3是下面所示的FITC-14的一种结构异构体：
在其它实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中n是9-13，优选12。
在更特别的实施方案中，本发明涉及选自下列化合物(或其可药用盐或酯)之一的式I化合物：
VLA-4配体试剂1
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂2
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂3
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂4
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-乙基]-环戊烷羰基]-氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸；
VLA-4配体试剂5
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂6
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂7
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；
VLA-4配体试剂8
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁基]环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；
VLA-4配体试剂9
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；
VLA-4配体试剂10
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；
VLA-4配体试剂11
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐；
VLA-4配体试剂12
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐；
VLA-4配体试剂13
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；和
VLA-4配体试剂14
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基]-[4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]-3,5-二氟苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苄基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸。
此外，本发明涉及包含式I化合物的新组合物和制剂用于制备与siRNA组合的纳米粒，导致核酸例如siRNA向表达α4β1复合物的靶细胞质的递送的改善。在特别的实施方案中，本发明涉及siRNA制剂，包含：(1)式I化合物，其中R2包含5’-siRNA寡核苷酸；和(2)聚阳离子转染剂。
本发明还涉及制备和使用这类化合物和组合物的方法。式I化合物可用作组合物或制剂的组分，其改善药物、核酸或其它治疗化合物向表达α4β1复合物的组织或细胞的递送。在特别的实施方案中，本发明涉及包含式I化合物的制剂，其可用于递送siRNA至表达α4β1复合物的靶细胞质，从而通过RNA干扰抑制某些蛋白质的表达。在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物和包含这类化合物的组合物，其可以有效递送siRNA至表达α4β1二聚体的肿瘤细胞和其它细胞类型，用于治疗癌症或炎性疾病。这类化合物和组合物更加有效，并且证明相比不含式I化合物的类似制剂，改善了敲除能力。
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：R1是
其中m是0-3。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3；
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1是下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2是下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，G选自：
(3)下式化合物：
R2是下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2是下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2是下式化合物：
其中R3是单链或双链寡核苷酸，并且X表示硫或下式化合物：
在一个实施方案中提供了式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是siRNA分子。
本发明化合物的通用合成
实施例中提供了合成式I化合物的适合的方法。通常，式I化合物可以根据下面所示的流程图制备。除非另外说明，否则下面流程图中变量n、R1和R2是如先前式I定义的相同方式定义。
马来酰亚胺-(PEG)n-整联蛋白拮抗剂结合剂的通用合成
不同长度PEG的化合物例如流程图1中的26是可商购获得的(例如购自Pierce BioScience)。这类化合物还可以通过将PEG氨基酸的氨基末端与3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸在酰胺键形成条件下酰化，随后通过在成酯条件下N-羟基琥珀酸反应形成活性N-羟基琥珀酸酯而制备。如流程图1所示，化合物26与含有伯胺或仲胺的化合物例如27的反应是在非质子或质子溶剂中在碱性胺例如DIEA(二异丙基乙基胺)的存在下在室温进行，产生PEG化的中间体28。
流程图1
含有不同长度PEG部分的化合物例如流程图2中的29(其中R4是硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基)也是可商购获得的(例如购自PierceBioScience)。含有结构29的化合物与含有伯胺或仲胺的化合物例如27的反应是非质子或质子溶剂中在碱性胺例如DIEA(二异丙基乙基胺)的存在下在室温进行，产生PEG化的中间体30。
流程图2
作为本发明的一个特别而非限制性实例，中间体26与31反应，产生马来酰亚胺中间体32，如流程图3所示：
流程图3
以类似的方式，中间体26可以与33反应，产生马来酰亚胺中间体34，如流程图4所示：
流程图4
以类似的方式，中间体29可以与35反应，产生中间体36，如流程图5所示，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：
流程图5
以类似的方式，中间体29可以与37反应，产生中间体38，如流程图6所示，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：
流程图6
对于通用结构26或29的化合物，不同PEG长度是可获得的或通过本领域技术人员易于制备；优选n＝8-24。这个主题已被充分报道和论述(例如Chemistry for peptide and protein PEGylation,Advanced Drug DeliveryReviews第54卷,第4期,2002年6月17日,第459-476页)。
中间体31可以类似于已经报道的方式合成(例如Sidduri,A.等人Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,12,2475-2478)，如流程图7所示：
流程图7
特别地，如流程图7所示，中间体41是由商购可获得的(S)-3-[4-硝基苯基]-2叔丁氧基羰基氨基-丙酸40制备。商购可获得的原料40的硝基在甲醇溶液中用锌粉在氯化铵存在下在室温还原数小时，产生苯胺41。硝基还原的其它方法是本领域技术人员已知的。苯胺41是用苯甲酰基卤化衍生物例如2,6-二氯苯甲酰氯42在非质子溶剂例如二氯甲烷中在碱例如二异丙基乙基胺的存在下在室温酰化。在这个方法中，形成酰胺43。叔丁基羰基(Boc)胺保护基是根据本领域技术人员已知的标准方法除去，例如用HCl的二烷溶液在室温处理；这产生盐酸盐44。将盐酸盐44用酰胺键形成条件(本领域技术人员熟知的)在已知的1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷甲酸45的存在下处理，产生二酰胺46。中间体46的叠氮基是通过用三烷基膦在非质子溶剂例如四氢呋喃中在室温处理而被还原。进一步，甲酯是通过用氢氧化钠在溶剂混合物例如乙醇和四氢呋喃中在升高的温度例如50℃处理15小时而被皂化。这步处理形成中间体31，其还可以以两性离子存在。
PEG部分的连接也可以用中间体39，其是如流程图8所示的合成。特别地，3,5-二氯苯酚47是用三异丙基甲硅烷基氯在碱例如咪唑的存在下在极性非质子溶剂例如DMF存在下在与强碱例如丁基锂在无水四氢呋喃中在低温例如-78℃反应前被保护。产生的锂复合物用以干冰形式加入的二氧化碳猝灭，产生中间体48，苯甲酸衍生物。然后将中间体48通过在非质子溶剂例如甲苯中用磺酰氯(SOCl2)处理而被氯化形成酰基氯。同时，将酰基氯与胺盐酸盐49在碱例如二异丙基乙基胺(DIPEA)存在下在非质子溶剂例如二氯甲烷(DCM)中反应，从而形成中间体50。中间体50的甲硅烷基保护基是通过用四丁基氟化铵(TBAF)在质子溶剂例如四氢呋喃中在室温处理而被除去。该苯酚中间体在碱例如碳酸钾(K2CO3)存在下在非质子溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)中与3-N-叔丁基-氨基甲酸酯-1-溴丙烷反应。在该方法中形成中间体52，在用三氟乙酸(TFA)脱保护，随后用碱例如氢氧化钠在质子溶剂例如乙醇中水解后其形成中间体39：
流程图8
VLA-4拮抗剂衍生剂的合成
下式化合物的合成：
其中：
可以根据流程图9而有效地完成：
流程图9
不同于2,6-二氯苯甲酰基，G表示的环可以装入中间体55，如流程图9所示。制备中间体55用于以与流程图7所示的类似方法偶联制备靶分子，根据流程图4的偶联制备式I化合物。上面流程图9中制备中间体53的详细合成方法公开在美国专利6,388,084B1和6,380,387B1中。简而言之，芳基或杂芳基锌试剂是由已知的中间体53或54在无水溶剂例如二甲基乙酰胺(DMA)中形成。此时，锌试剂与可商购获得的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-(4-碘)苯基]丙酸乙酯55在钯催化剂例如Pd(dba)2存在下和在钯配体三甲苯酰基膦存在下在非质子溶剂例如四氢呋喃(THF)中在50℃反应。在本方法中，形成通用结构56的中间体。然后将中间体56在流程图7讨论的四步中转化为中间体57。
根据流程图10所示的合成方法，还可以形成靶向基序的二聚体VLA-4拮抗剂。在本方法中，将可以由上面流程图9描述的类似方法制备的中间体58与酰胺形成剂例如HBTU和碱DIPEA在非质子溶剂DMF中在4-溴-2,6-二氟苯甲酸52存在下根据流程图10反应。产生的中间体59用二氰基锌在四(三苯基膦)钯(0)膦存在下在溶剂例如四氢呋喃中处理，形成氰基取代产物中间体60。在正丙醇中用氢气和催化的钯炭在室温氢化，形成仲胺中间体63。此时，将二丙酯转化为二甲酯，随后与N-Cbz-β-丙氨酸的酰氯在碱例如二异丙基乙基酰胺存在下反应，从而形成中间体64。该中间体用水性碱皂化，并且N-Cbz基团通过催化的氢解除去，得到二聚体VLA-4拮抗剂氨基酸65，如流程图10所示。
流程图10
用途
式I化合物可用于递送结合部分例如治疗剂、小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物至表达VLA-4整联蛋白受体复合物的靶细胞，用于多种治疗和其它应用。因此，式I化合物可以用于治疗与VLA-4表达或过表达相关的多种疾病和病症。这些疾病和病症可以包括炎症、癌症和代谢相关的疾病。
在特别的实施方案中，本发明包括治疗或预防需要该治疗的哺乳动物(优选人)中的癌症，其中该方法包括施用治疗有效量的式I化合物。这些组合物可以以符合良好医学实践的方式施用。本文考虑的因素包括所治疗的具体障碍、所治疗的具体哺乳动物、单独患者的临床情况、障碍原因、活性剂的递送部位、施用方法、施用方案和医师所知的其它因素。施用的化合物的“有效量”通过这些考虑来调节，如治疗或预防疾病或病症(例如抑制靶蛋白的表达)所需的最小量并且避免不可接受的毒性。例如，该量可以低于对正常细胞或整个哺乳动物有毒的量。包含本发明的式I化合物的组合物可以通过非肠道、腹膜内和肺内施用。非肠道输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
实施例
本发明将通过参考下列实施例更全面地理解。然后，它们不应被理解为限制本发明范围。
试剂购自Aldrich、Sigma和Pierce BioScience或下面所示的其它供应商，并且无需进一步纯化而使用。毫克级至克级规模的纯化是通过本领域已知的方法完成的，例如硅胶快速柱洗脱。在某些情况下制备型快速柱纯化还通过使用一次性预装克级硅胶柱(RediSep)完成，用CombiFlash系统洗脱。BiotageTM和ISCOTM也是快速柱仪器，其可以用于本发明纯化中间体。
为了判断化合物真伪和纯度的目的，LC/MS(液相色谱/质谱)谱用下列系统记录。对于质谱测定，系统包括Micromass Platform II谱仪：ES离子化，正离子模式(质量范围：150-1200amu)。并行的色谱分离是用下列HPLC系统完成：ES Industries Chromegabond WR C-183u(3.2×30mm)柱；流动相A：水(0.02％TFA)，流动相B：乙腈(0.02％TFA)；梯度3分钟内由10％B至90％B；平衡时间1分钟；流速2mL/分钟。在某些情况下，20毫摩尔浓度的乙酸铵用作改性剂，用于制备型HPLC过程中的有效离子化。在此类情况下，分离铵盐。
对于某些分离，使用超临界流体色谱法也是有用的。超临界流体色谱法分离是用Mettler-Toledo Minigram系统进行的，使用下列典型条件：100巴，30℃，2.0mL/分钟洗脱12mm AD柱，在超临界流体CO2中使用40％MeOH。在含有碱性氨基的分析物情况下，向甲醇改性剂中添加0.2％异丙胺。
化合物是通过用Varian Inova400MHz NMR谱仪或Varian Mercury300MHz NMR谱仪的1H-NMR以及通过Bruker Apex-II高分辨4.7T FT-质谱仪的高分辨质谱法表征。最终化合物还通过使用Thermo Electron销售的LTQ CL Orbitrap的高分辨质谱法表征。
本文所用的缩略语如下：
AIBN           2,2’-偶氮二异丁腈
Bu             丁基
DCE            1,2-二氯乙烷
DCM            二氯甲烷
DBU            1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯
DIAD           偶氮二甲酸二异丙酯
DIEA           二乙胺
DIPEA          二异丙基乙基胺
DMF            N,N-二甲基甲酰胺
DMSO           二甲亚砜
EDC-HCl        1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
EtOAc          乙酸乙酯
EtOH           乙醇
FCC            快速柱色谱
h              小时
HBTU           O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六
               氟磷酸盐
HOBt           羟基苯并三唑
HPLC          高压液相色谱
HRMS          高分辨质谱
LRMS          低分辨质谱
LC            液相色谱
L-Pro         L-脯氨酸
MCPBA         间-氯过氧基苯甲酸
MeOH          甲醇
MW            微波
NIS           N-碘琥珀酰亚胺
NBS           N-溴琥珀酰亚胺
NMP           1-甲基-2-吡咯烷酮
PdCl2(dppf)   [1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)
PEGn          重复n次的聚乙二醇(例如
              PEG2＝-OCH2CH2OCH2CH2-)
PG            保护基
PyBroP        溴-三-吡咯烷子基-磷六氟磷酸盐
rt            室温
TBAF          四丁基氟化铵
TBDMS         叔丁基二甲基甲硅烷基
TBTU          2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟
              硼酸盐
TMS           三甲基甲硅烷基
TEA           三乙胺
TFA           三氟乙酸
THF           四氢呋喃
TLC           薄层色谱
TPP           三苯基膦
靶向VLA-4的化合物的合成
实施例1
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸；VLA-4配体试剂1:
步骤1：1-(2-溴乙基)环戊烷甲酸甲酯的制备：
在-10℃向二异丙基胺(56mL，396mmol)的THF(85mL)溶液中滴加正丁基锂(240mL，393mmol，1.6M)的己烷溶液，同时保持温度低于0℃。加入后，将溶液在0℃搅拌30分钟。在-70℃向该溶液中滴加环戊烷甲酸甲酯(37.4g，263mmol)的THF(50mL)溶液，保持内部温度在-60至-70℃之间。加入后，将反应混合物在-50至-60℃搅拌1小时。然后，滴加1,2-二溴乙烷(47mL，545mmol)的THF(50mL)溶液，并且将淡棕色混悬液在-70至-60℃搅拌1小时。然后，将其温至室温并且搅拌过夜。将反应混合物倒入饱和的氯化铵水溶液(200mL)中，并且将有机化合物萃取到醚(2×100mL)中。将合并的萃取物用饱和的氯化钠溶液(150mL)洗涤，并且经无水硫酸镁干燥。过滤干燥剂后，将溶液真空浓缩，并且将产生的残留物在95-105℃/2.5mm Hg蒸馏，得到49.6g(80％产率)1-(2-溴乙基)环戊烷甲酸甲酯，为无色油状物。
步骤2：1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸甲酯的制备：
将1-(2-溴乙基)环戊烷甲酸甲酯(49.6g，211mmol)和叠氮化钠(54g，831mmol)的DMF(200mL)溶液在50℃在氮气气氛下搅拌5小时。然后，过滤固体，并且将滤液浓缩至接近干燥。将残留物用乙酸乙酯(500mL)稀释，并且过滤收集未溶解的固体，并且浓缩滤液，得到粗制的1-(2-叠氮基乙基)环戊烷甲酸乙酯，其通过250g硅胶色谱纯化，用在己烷中的5％乙酸乙酯洗脱，得到36.2g(87％产率)1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸甲酯，为淡棕色油状物。EI(+)-HRMS m/e计算值C9H15N3O2(M-H)+196.1086，实测值196.1342。
步骤3：1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸的制备：
将1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸甲酯(36.2g，184mmol)溶于THF(500mL)和甲醇(250mL)中，并且加入LiOH一水合物(15.44g，368mmol)的水(300mL)溶液。将产生的溶液在40℃搅拌过夜并且浓缩。将残留物溶于含有40mL1N NaOH的1L水中，并且用己烷(500mL)洗涤。将水层用1N盐酸酸化，并且将有机化合物用醚(2×500mL)萃取。将合并的萃取物用饱和的氯化钠溶液洗涤，并且将有机层经无水Na2SO4干燥。过滤干燥剂并且浓缩，得到32.5g(96％产率)1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸，为琥珀色液体。ES(+)-HRMS m/e计算值C8H13N3O2(M+Na)+206.0900，实测值206.0900。
步骤4：(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸(70.2g，226.2mmol)和碳酸钠(95g，1.13mol)的DMF(500mL)混悬液中加入碘甲烷(70.4mL，1.13mol)。将混悬液在室温搅拌15小时，同时TLC分析混合物表明不含原料，并且在高真空下除去过量的碘甲烷和一些DMF。然后，将其倒入水(2L)中，并且在室温搅拌72小时，缓慢形成沉淀物。过滤收集沉淀的固体，并且用水(2L)洗涤。空气和真空干燥后，分离72g(98％产率)的(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯，为淡黄色固体(mp95-96℃)。ES(+)-HRMS m/e计算值C15H20N2O6(M+H)+325.1400，实测值325.1404。
步骤5：(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯(72g，222mmol)、锌粉(～325目，145.2g，2.2mol，10当量)和氯化铵(178.1g，3.3mol，15当量)的混合物中加入甲醇(1L)和水(500mL)。加入水后，接着发生放热反应，并且内部温度升至45至50℃。将混悬液在室温搅拌30分钟至1小时，同时TLC分析混合物表明不含原料，并且经硅藻土填料过滤反应混合物，并且将滤饼用甲醇(1L)和水(500mL)洗涤。浓缩除去大部分甲醇和一些水，得到白色固体，过滤收集并且用水洗涤。空气干燥后，分离65.5g(100％产率)的(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯，为白色固体(mp86-89℃)。ES(+)-HRMS m/e计算值C15H22N2O4(M+H)+294.1621，实测值294.1614。
步骤6：(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-3-[4-氨基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯(37.57g，127.6mmol)和2,6-二氯苯甲酰氯(29.45g，140.6mmol)的二氯甲烷(350mL)溶液中加入DIPEA(24.8g，192mmol)。将棕色溶液在室温搅拌15小时，得到白色混悬液，同时TLC分析混合物表明不含原料。然后，过滤收集固体，并且将固体用二氯甲烷(150mL)洗涤，并且空气干燥，得到52.75g(88.4％产率)的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯，为白色固体：mp192-194℃。ES(+)-HRMS m/e计算值C22H24Cl2N2O5(M+H)+466.1062，实测值466.1069。
步骤7：(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐的制备：
在室温将在二烷(90mL)中的固体(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯(43.45g，92.97mmol)用在二烷中的166mL4.0N盐酸处理。5分钟后，固体变成溶液，并且将混合物搅拌2小时。然后，真空除去一些二烷，得到黄色浆液，并且加入250mL乙醚。形成胶状物，将其溶于THF(100mL)和甲醇(100mL)中。真空除去溶剂，得到43.7g(100％产率)的(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐，为白色固体：mp180-195℃。将其在氩气气氛下储存于冰箱中。ES(+)-HRMS m/e计算值C17H16Cl2N2O3(M+H)+367.0616，实测值367.0611。
步骤8：(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐(10g，24.79mmol)和1-[2-叠氮基乙基]环戊烷甲酸甲酯(5.0g，27.29mmol)的DMF(100mL)溶液中加入HBTU(10.37g，27.33mmol)和DIPEA(8.82g，68.3mmol)。将澄清的溶液在室温搅拌48小时，并且向反应混合物中加入水(～200mL)，沉淀产物。过滤收集固体，并且用水(100mL)和己烷(～100mL)洗涤。空气干燥后，得到11.2g产物，为淡砖色固体，将其用乙腈(100mL)在热条件下处理。所有杂质进入乙腈中，并且过滤收集固体，得到8.24g偶联的产物。真空除去乙腈溶液，并且将残留物溶于乙酸乙酯中，并且加入己烷沉淀产物。再次过滤收集固体，并且空气干燥固体，另外得到2.03g(78％总产率)的(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯，为白色固体。ES(+)-HRMSm/e计算值C25H27Cl2N5O4(M+Na)+554.1332，实测值554.1334。
步骤9：(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸的制备：
在室温向(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯(14.77g，27.7mmol)的THF(200mL)和乙醇(200mL)的混悬液中加入1.0N氢氧化钠水溶液(150mL)。将混合物在室温搅拌15小时，同时TLC分析混合物表明不含原料。然后，将其用水(20mL)稀释，并且旋转蒸发除去THF和乙醇，并且用100mL水稀释，并且用乙醚(200mL)萃取，除去任何中性杂质。水层用1N HCl中和，并且过滤收集产生的白色固体，并且用水和己烷洗涤。空气干燥后，得到13.37g(93％产率)的(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C24H25Cl2N5O4(M+Na)+540.1176，实测值540.1177。
步骤10：(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体–1
在0℃向(S)-2-[[1-(2-叠氮基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(6.28g，12.11mmol)的THF(91mL)溶液中加入三甲基膦的THF溶液(48.5mL，48.46mmol，1.0M)。最初它是澄清溶液，30分钟后形成一些沉淀，将该混合物搅拌过夜，同时TLC分析混合物表明不含原料。然后，加入10当量的水(120mmol，2.16mL)，并且将混合物在室温搅拌2小时。真空除去溶剂，并且将残留物用甲苯共沸两次，得到糊状物质，其用HPLC纯化，得到4.57g(77％产率)的(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸，为无定形白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C24H27Cl2N3O4(M+H)+492.1452，实测值492.1451。
步骤11：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂1：
在室温和氮气气氛下向(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(191.5mg，0.39mmol)和3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(200mg，0.39mmol)的DMSO(2mL)溶液中加入过量DIPEA(151mg，203μL，1.17mmol)。将产生的淡黄色溶液搅拌1小时，同时LCMS分析表明不含原料。然后，真空除去过量的DIPEA，并且将所需的产物通过HPLC法纯化分离，得到90mg(26％产率)的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C42H53Cl2N5O12(M+H)+890.3141，实测值890.3140。
实施例2
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂2：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(607mg，1.0mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(689mg，1.0mmol)和DIPEA(388mg，522μL，3.0mmol)开始，HPLC纯化后，产生淡黄色固体(788mg，74％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C50H69Cl2N5O16(M+H)+1066.4189，实测值1066.4182。
实施例3
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂3：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(100mg，0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(176mg，0.2mmol)和DIPEA(258mg，191μL，2.0mmol)开始，HPLC纯化后，产生白色固体(28mg，11％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C58H85Cl2N5O20(M+H)+1242.5238，实测值1242.5248。
实施例4
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-乙基]-环戊烷羰基]-氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂4：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(2-氨基乙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(194mg，0.32mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(190mg，0.32mmol)和DIPEA(124mg，167μL，0.96mmol)开始，HPLC纯化后，产生黄色粘稠油状物(220mg，70％)。ES(+)-HRMSm/e计算值C45H65Cl2N3O14S(M+H)+974.3637，实测值974.3631。
实施例5
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；VLA-4配体试剂5:
步骤1：(3,5-二氯苯氧基)-三异丙基硅烷的制备
在室温向3,5-二氯苯酚(16.3g，100mmol)、咪唑(14.98g，220mmol)和三异丙基氯硅烷(21.21g，110mmol)的混合物中加入DMF(200mL)。将产生的棕色溶液搅拌15小时，然后将其用水(500mL)稀释。将有机化合物萃取到乙酸乙酯(2×100mL)中，并且将合并的有机层用盐水溶液洗涤，并且经无水MgSO4干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，其用ISCO(400g)柱色谱纯化，得到31.1g(97％)的(3,5-二氯苯氧基)-三异丙基硅烷，为无色油状物。EI(+)-HRMS m/e计算值C15H24Cl2OSi(M)+318.0973，实测值318.0971。
步骤2：2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酸的制备：
在-78℃向THF(110mL)溶液中加入正丁基锂(28mL，70mmol，2.5M)的己烷和四甲基乙二胺(8.42g，10.94mL，72.45mmol)溶液。将产生的淡黄色溶液在该温度搅拌30分钟，然后历时30分钟滴加(3,5-二氯苯氧基)-三异丙基硅烷(15.97g，50mmol)的THF(20mL)溶液。将产生的淡黄色溶液搅拌3小时，然后向反应混合物中通入二氧化碳气体。在CO2鼓气过程中，反应混合物的颜色在10分钟内由棕色变成淡黄色溶液，并且在-75℃继续鼓气1小时，然后在30分钟内温至室温，继续鼓入CO2。然后，将其倒入1N HCl中，并且将有机化合物萃取到二氯甲烷(2×150mL)中。合并的有机层用盐水溶液洗涤，并且经无水MgSO4干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，其用ISCO(400g)柱色谱纯化，得到7.02g(39％)的2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酸，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C16H24Cl2O3Si(M+H)+363.0945，实测值363.0944。
步骤3：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯的制备：
在室温向2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酸(3.63g，10mmol)的甲苯(50mL)溶液中加入过量的亚硫酰氯(11.89g，7.2mL，100mmol)。将产生的无色溶液加热至回流达5小时，然后将其冷却至室温并且真空除去溶剂和过量的亚硫酰氯。将产生的残留物用甲苯共沸一次。然后，将上面2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰氯溶于二氯甲烷(50mL)中，并且在室温加入固体(S)-2-氨基-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐(4.1g，10mmol)和DIPEA(3.87g，5.26mL，30mmol)。将产生的溶液在室温搅拌15小时，并且向反应混合物中加入水(～200mL)。然后，将有机化合物萃取到二氯甲烷(2×150mL)中。合并的有机层用盐水溶液洗涤，并且经无水MgSO4干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，其用ISCO(120g)柱色谱纯化，得到6.48g(95％)的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C33H38Cl4N2O5Si(M+H)+711.1377，实测值711.1377。
步骤4：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯的制备：
在0℃向(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯(6.76g，9.48mmol)的THF(150mL)溶液中加入TBAF(14.22mL，14.22mmol，1M)的THF溶液。将产生的溶液缓慢温至室温，并且搅拌15小时。然后，反应混合物用水稀释，并且有机化合物萃取到乙酸乙酯(2×150mL)中。合并的有机层用盐水溶液洗涤，并且经无水MgSO4干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，将其在热条件下溶于乙酸乙酯中，然后用己烷稀释。产生的固体经过滤收集，并且用己烷洗涤。空气干燥后，得到5.23g(99％)的(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C24H18Cl4N2O5(M-H)-552.9897，实测值552.9897。
步骤5：(S)-2-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-(2,6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)丙酸甲酯(5.05g，9.07mmol)、3-叔丁氧基羰基氨基丙基溴(2.59g，10.89mmol)和碳酸钾(3.77g，27.29mmol)的混合物中加入DMF(66mL)和丙酮(132mL)。然后，将产生的混悬液加热至回流达15小时，同时TLC分析表明不含原料。然后，反应混合物冷却至室温，并且用水稀释，并且将有机化合物萃取到乙酸乙酯(2×150mL)中。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，并且经无水MgSO4干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，其用ISCO(150g)柱色谱纯化，得到5.75g(89％)的(S)-2-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C32H33Cl4N3O7(M+Na)+734.0965，实测值734.0961。
步骤6：(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯的制备：
在室温向(S)-2-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯(7.5g，7.98mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入过量的TFA(9.12g，5.9mL，80mmol)。将产生的溶液搅拌15小时。然后，真空除去溶剂，并且将残留物用甲苯共沸一次。高真空干燥后，得到5.8g(99％)的(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C27H25Cl4N3O5(M+H)+612.0621，实测值612.0619。
步骤7：(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体2：
在室温向(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸甲酯(5.8g，7.98mmol)的THF(200mL)溶液中加入氢氧化锂(2.4g，100mmol)水(30mL)溶液。将混合物在室温搅拌15小时，同时TLC分析混合物表明不含原料。然后，旋转蒸发除去溶剂，并且将残留物通过HPLC法纯化，得到3.7g(65％产率)的(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C26H23Cl4N3O5(M+H)+598.0465，实测值598.0465。
步骤8：(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂5：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(214mg，0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(154mg，0.3mmol)和DIPEA(388mg，522μL，3.0mmol)开始，HPLC纯化后，产生白色固体(52mg，17％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C44H49Cl4N5O13(M+Na)+1018.1973，实测值1018.1965。
实施例6
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；VLA-4配体试剂6:
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(107mg，0.15mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(100mg，0.145mmol)和DIPEA(194mg，261μL，1.5mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生白色固体(50mg，28％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C52H65Cl4N5O17(M+Na)+1194.3022，实测值1194.3028。
实施例7
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；VLA-4配体试剂7:
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸(143mg，0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(173mg，0.2mmol)和DIPEA(258mg，348μL，2.0mmol)，并且HPLC纯化后，产生白色固体(45mg，16.6％)。ES(+)-HRMSm/e计算值C60H81Cl4N5O21(M+Na)+1370.4070，实测值1370.4066。
实施例8
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁基]环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；VLA-4配体试剂8:
步骤1：1-(4-溴丁基)环戊烷甲酸甲酯的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤1中描述的类似方法制备，由二异丙基胺(21mL，150mmol)、正丁基锂(58mL，145mmol)、环戊烷甲酸甲酯(13.1g，100mmol)和1,4-二溴丁烷(21.59g，100mmol)开始，并且蒸馏后，产生无色油状物(12.8g，48％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C11H19BrO2(M+H)+262.0568，实测值262.0565。
步骤2：1-[4-叠氮基丁基]环戊烷甲酸甲酯的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤2中描述的类似方法制备，由1-[4-溴丁基]环戊烷甲酸甲酯和叠氮化钠开始。
步骤3：1-[4-叠氮基丁基]环戊烷甲酸的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤3中描述的类似方法制备，由1-[4-叠氮基丁基]环戊烷甲酸甲酯和氢氧化锂开始。
步骤4：(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯的制备：
在室温向锌粉(52.29g，800mmol)的THF(26.0mL)混悬液中加入1,2-二溴乙烷(4.58mL，53.2mmol)。将该混悬液用加热枪加热至60-65℃，直至乙烯气体蒸发停止(观察到的)。将混悬液冷却至室温，加入三甲基氯硅烷(3.38mL，26.6mmol)，并且将混合物搅拌15分钟。将5-碘-1,3,6-三甲基尿嘧啶(74.6g，266mmol)的DMA(225mL)混悬液温热，得到澄清溶液，并且一次性加入到反应混合物中。加入后，将混合物加热至70℃。由于放热反应，反应混合物的内部温度升至80-85℃。反应混合物在70℃下搅拌3-4小时，同时用饱和氯化铵猝灭的等份部分的TLC表明不含原料。反应混合物用THF(140mL)稀释，冷却至室温，并且将过量的锌粉沉淀2-3小时。
在室温将含有锌化合物(266mmol)的溶液加入到Pd(dba)2(4.6g，8mmol)、三-o-甲苯基膦[P(Tol)3](9.0g，29.6mmol)和(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-(4-碘)苯基]丙酸甲酯(75.56g，186mmol)的THF(280mL)溶液中，并且将淡黄色混合物在50-55℃下搅拌48小时。将反应混合物倒入饱和的氯化铵溶液中，并且用乙酸乙酯(3×750mL)萃取。将合并的萃取物用盐水溶液(1.5L)洗涤，并且经无水硫酸镁干燥。过滤干燥剂并且浓缩得到粗产物，其通过硅胶柱色谱纯化，使用Biotage(75m)柱，得到57.88g(72％产率)的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯，为无定形白色固体。EI-HRMS m/e计算值C22H29N3O6(M+)431.2056，实测值431.2054。
步骤5：(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐的制备：
将上面获得的一部分(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯(7.4g，17.15mmol)固体用在二烷中的4N盐酸(17mL，68mmol)在室温处理，并且将溶液搅拌1小时，形成白色沉淀。混合物用乙醚稀释，并且倾倒上清液，并且将残留物先在选择蒸发仪上干燥，然后在高真空下干燥，得到6.28g(99％产率)的(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸甲酯盐酸盐，为无定形黄色固体。FAB-HRMS m/e计算值C17H21N3O4(M+H)332.1610，实测值332.1617。
步骤6：(S)-2-[[1-(4-叠氮基丁基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤8中描述的类似方法制备，由(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(10.78g，30mmol)、1-[4-叠氮基丁基]环戊烷甲酸(8.24g，39mmol)、HBTU(14.79g，39mmol)和DIPEA(11.63g，15.68mL，90mmol)开始，并且ISCO柱色谱纯化后，产生无定形类白色固体(14.1g，85％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C29H40N6O5(M+H)+553.3133，实测值553.3133。
步骤7：(S)-2-[[1-(4-叠氮基丁基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤9中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(4-叠氮基丁基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(4.1g，7.42mmol)和NaOH(35mL，35mmol，1M)开始，产生白色固体(3.75g，99％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C26H34N6O5(M+H)+511.2664，实测值511.2664。
步骤8：(S)-2-[[1-(4-氨基丙基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体3：
标题化合物是用实施例1，步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(4-叠氮基丁基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸(1.02g，2mmol)和三甲基膦(8mL，8mmol，1M)开始，得到白色固体(0.96g，99％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C26H36N4O5(M+H)+485.2759，实测值485.2757。
步骤9：(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁基]环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂8：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[[1-(4-氨基丁基)环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸(300mg，0.62mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(318mg，0.62mmol)和DIPEA(160mg，215μL，1.24mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生淡黄色固体(274mg，50％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C44H62N6O13(M+H)+883.4448，实测值883.4449。
实施例9
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；VLA-4配体试剂9:
步骤1：(S)-2-(2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤8中描述的类似方法制备，由(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(3.95g，11mmol)、2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酸(3.63g，10mmol)、HBTU(5.42g，14.3mmol)和DIPEA(4.26g，5.75mL，33.0mmol)开始，并且ISCO柱色谱纯化后，产生无定形白色固体(1.7g，24％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C35H47Cl2N3O6Si(M+H)+704.2684，实测值704.2683。
步骤2：(S)-2-(2,6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
标题化合物是用实施例5，步骤4中描述的类似方法制备，由(S)-2-(2,6-二氯-4-三异丙基硅烷基氧基-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(1.66g，2.35mmol)和TBAF(3.5mL，3.5mmol，1M)开始，并且ISCO柱色谱纯化后，产生白色固体(884mg，69％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C26H27Cl2N3O6(M+H)+548，实测值548。
步骤3：(S)-2-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
标题化合物是用实施例5，步骤5中描述的类似方法制备，由(S)-2-(2,6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(558mg，1.07mmol)、3-叔丁氧基羰基氨基丙基溴(306mg，1.28mmol)和碳酸钾(445mg，3.22mmol)开始，并且ISCO柱色谱纯化后，产生白色固体(654mg，87％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C34H42Cl2N4O8(M+H)+705.2453，实测值705.2451。
步骤4：(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯三氟乙酸盐的制备：
标题化合物是用实施例5，步骤6中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(781mg，1.1mmol)和TFA(1.14g，742μL，10mmol)开始，产生易潮湿的白色固体(790mg，99％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C29H34Cl2N4O6(M+H)+605.1928，实测值605.1929。
步骤5：(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐的制备：
标题化合物是用实施例5，步骤7中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(852mg，1.1mmol)和LiOH(53mg，2.2mmol)开始，产生无定形白色固体(740mg，99％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C26H28Cl2N4O6(M+H)+563.1459，实测值563.1455。
步骤6：(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂9：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐(203mg，0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(154mg，0.3mmol)和DIPEA(194mg，261μL，1.5mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生无定形白色固体(175mg，61％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C44H54Cl2N6O14(M+H)+961.3148，实测值961.3156。
实施例10
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂10：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-(3-氨基丙氧基)-2,6-二氯苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐(98mg，0.145mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(100mg，0.145mmol)和DIPEA(187mg，252μL，1.45mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生易潮湿的白色固体(88mg，53％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C52H70Cl2N6O18(M+H)+1137.4197，实测值1137.4196。
实施例11
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐；VLA-4配体试剂11:
步骤1：(S)-2-(4-溴-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤8中描述的类似方法制备，由(S)-2-氨基-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(4.67g，13mmol)、4-溴-2,6-二氟苯甲酸(3.12g，13.16mmol)、HBTU(4.99g，13.16mmol)和DIPEA(6.8mL，39mmol)开始，并且ISCO柱色谱纯化后，产生无定形类白色固体(6.71g，89％)。ES-HRMS m/e计算值C26H26BrF2N3O5(M+H)+578.1097，实测值578.1096。
步骤2：(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
在室温向(S)-2-(4-溴-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(5.78g，10mmol)的混悬液中加入氰化锌(940mg，8mmol)和四(三苯基膦)钯(1.16g，1mmol)(在DMF(40mL，蒸馏并脱气)中)。将产生的溶液加热至85℃，并且搅拌24小时，同时TLC分析混合物表明不含原料。然后，将反应混合物冷却至室温，并且将其倒入水(100mL)中，得到浑浊的混悬液。然后，将有机化合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的萃取物用盐水溶液(100mL)洗涤，并且经无水硫酸镁干燥。过滤干燥剂并且浓缩溶剂，得到粗产物，其用ISCO(150g)柱色谱纯化，得到5.2g(99％产率)的(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯，为无定形白色固体。ES-HRMS m/e计算值C27H26F2N4O5(M+H)+525.1944，实测值525.1942。
步骤3：(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯的制备：
向硼氢化钠(0.29g，7.62mmol，2当量)的THF(5mL)溶液中加入TFA(566μL，7.62mmol，2当量)，将反应搅拌10分钟，然后滴加(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟-苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)-苯基]-丙酸丙酯(2.0g，3.81mmol)的THF(6mL)溶液(烧瓶用w/THF(2×1mL)淋洗并且加入到反应中)。将反应在室温和氮气下搅拌1.3小时。将反应混合物在冰浴中冷却，并且用水(20mL)和氯化钠溶液(20mL水，100mL饱和溶液)猝灭。水性混合物用DCM(2×200mL)萃取，然后有机层用盐水洗涤，合并并且经硫酸镁干燥，然后浓缩，得到类白色固体，1.77g。粗产物悬浮于乙酸异丙酯(75mL)和异丙醇(0.75mL)中，滴加TMSCl(1mL)。反应在室温搅拌2小时，并且过滤白色沉淀物，并且用乙酸异丙酯和己烷洗涤，得到1.5g(63％产率)的(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯，为无定形白色固体。ES-HRMS m/e计算值C27H30F2N4O5(M+H)+529.2257，实测值529.2258。
步骤4：(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐的制备；VLA-4配体4：
在室温向(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(508mg，0.96mmol)的THF(10mL)混悬液中加入氢氧化锂(240mg，10mmol)的水(2mL)溶液。将混合物搅拌15小时，同时TLC分析表明不含原料。然后，在减压下除去THF，并且将残留物用水(100mL)稀释，并且将混合物用TFA酸化。粗产物经HPLC纯化，得到450mg(78％产率)的(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸，为白色固体的TFA盐。ES-LRMS m/e计算值C24H24F2N4O5(M+H)+487，实测值487。
步骤5：(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸TFA盐(120mg，0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(103mg，0.2mmol)和DIPEA(129mg，174μL，1.0mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生白色固体(75mg，43％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C42H50F2N6O13(M+Na)+907.3296，实测值907.3296。
实施例12
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐的制备；VLA-4配体试剂12：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸TFA盐(121mg，0.2mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(100mg，0.145mmol)和DIPEA(258mg，348μL，2.0mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生白色固体(80mg，38％)。ES(+)-HRMSm/e计算值C50H66F2N6O17(M+H)+1061.4526，实测值1061.4521。
实施例13
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂13：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-(4-氨基甲基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基]丙酸(64mg，0.11mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(64mg，0.11mmol)和DIPEA(42mg，56μL，0.32mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生粘稠油状物(90mg，87％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C45H62F2N4O15S1(M+H)+969，实测值969。
实施例14
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基]-[4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]-3,5-二氟苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苄基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸的制备；VLA-4配体试剂14:
步骤1：(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-丙氧基羰基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸丙酯的制备：
向含有溶于正丙醇(20mL)中的(S)-2-(4-氰基-2,6-二氟苯甲酰基氨基)-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基]丙酸丙酯(524mg，1.0mmol)并且通入氮气的100mL烧瓶中加入钯炭(10％，106mg)。将反应密封，通过三次暴露于氮气和常压下脱气，然后暴露于氢气球过夜。反应用EA稀释，再次脱气，并且暴露于氢气过夜。反应经硅藻土过滤，浓缩并且通过HPLC纯化，得到标题化合物(204mg，19％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C54H57F4N7O10(M+H)+1041，实测值1041。
步骤2：(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸的制备：
向包含(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-丙氧基羰基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸丙酯(1004mmg，0.97mmol)的200mL烧瓶中加入THF(25mL)、水(25mL)和LiOH(193mg，4.6mmol)，并且将反应在室温搅拌过夜。浓缩反应，乙腈干燥，得到白色固体，其与DMSO(13mL)和水(12mL)混合。将混合物最低限度地加热，过滤，并且向滤液中加入TFA(0.25mL)，产生沉淀物。将沉淀物用水(50mL)稀释，过滤并且用水和己烷洗涤，并且高真空干燥，得到标题化合物，为白色固体(696mg，75％)。ES(+)-LRMSm/e计算值C48H45F4N7O10(M+H)+956，实测值956。
步骤3：(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-甲氧基羰基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸甲酯的制备：
向含有(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸(560mg，0.59mmol)的烧瓶中加入甲醇(50mL)和TMSCl(398mg，460mL，3.66mmol)，并且将反应搅拌过夜。反应用EA(10mL)、DCM(140mL)稀释，并且用NaHCO3水溶液(水:饱和溶液50mL:50mL，10mL盐水)和盐水(100mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤并且浓缩，得到标题化合物，为白色固体，并且直接使用。ES(+)-LRMS m/e计算值C50H49F4N7O10(M+H)+984，实测值984。
步骤4：(S)-2-[4-[[3-苄氧基羰基氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-甲氧基羰基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸甲酯的制备：
向含有CBZ-β-丙氨酸(123mg，0.55mmol)和DCM(1mL)的烧瓶中滴加溶于DCM(5mL)的草酰氯(710mg，0.488mL，5.5mmol)。将反应在室温搅拌2.5小时，然后浓缩至固体。将固体悬浮于DCM(1mL)，并且分批滴加至(S)-2-[4-[[3,5-二氟-4-[(S)-1-甲氧基羰基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸甲酯(0.59mmol)的DMF(5mL)和DIPEA(131mg，0.178mL，1.0mmol)溶液中，再用DCM(2×0.4mL)淋洗，并且将反应在室温搅拌过周末。反应用EA(200mL)稀释，用NaHCO3水溶液(水:饱和溶液100mL:100mL)和盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并且通过快速色谱法纯化，增加在DCM中的10％MeOH/DCM浓度至30％。分离标题化合物，为白色固体(400mg，67％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C61H60F4N8O13(M+H)+1189，实测值1189。
步骤5：(S)-2-[4-[[3-苄氧基羰基氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸的制备：
标题化合物是用实施例5，步骤7中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-[[3-苄氧基羰基氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-甲氧基羰基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸甲酯(380mg，0.32mmol)、THF(8mL)、水(8mL)、LiOH(51mg，1.21mmol)和1N HCl开始，沉淀，溶解并且并浓缩后，产生白色固体(325mg)。ES(+)-LRMS m/e计算值C59H56F4N8O13(M+H)+1161，实测值1161。
步骤6：(S)-2-[4-[[3-氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸的制备；VLA-4配体6：
标题化合物是用实施例14，步骤1中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-[[3-苄氧基羰基氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸(313mg，0.27mmol)、钯炭(10％)和1个大气压下氢气开始。四次暴露(3×65mg，0.061mmol，室温3小时、4小时、18小时；和205mg，0.19mmol，40℃，4.5小时)并且过滤后得到标题化合物，为类白色固体(79mg，28％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C51H50F4N8O11(M+H)+1027，实测值1027。
步骤7：(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基]-[4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]-3,5-二氟苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苄基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸的制备：
标题化合物是用实施例1，步骤11中描述的类似方法制备，由(S)-2-[4-[[3-氨基丙酰基]-3,5-二氟-4-[(S)-1-羧基-2-[4-[[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-((1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)苯基丙酸(84.3mg，0.082mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(49.1mg，0.082mmol)和DIPEA(31mg，43μL，0.246mmol)开始，并且HPLC纯化后，产生白色固体(57mg，46％)。ES(+)-LRMS m/e计算值C72H88F4N8O21S1(M/2+H)+755，实测值755。
荧光素(FITC)标记的靶向试剂的制备
靶向试剂可以用荧光基团衍生化，所述的荧光基团可以用于研究跟踪表达靶向小分子受体的细胞的结合。这类分子可以以一种或两种方法制备。首先，可能完成靶向马来酰亚胺与2-[(5-荧光素基(fluoroseinyl))氨基羰基]乙基硫醇反应。或者，整联蛋白拮抗剂小分子靶向配体与2-[(5-荧光素基)氨基羰基]乙基硫醇和双功能PEG试剂的一锅法反应，如流程图17和18所示。
方法a)的实施例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC的制备
在室温和氮气气氛下向(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(37.5mg，0.03mmol)和2-[(5-荧光素基)氨基羰基]乙基硫醇(FITC试剂)(15.6mg，0.036mml)的甲醇(5mL)黄色混悬液中加入过量的DIPEA(38.7mg，52μL，0.3mmol)。将产生的淡黄色混悬液搅拌2小时，同时LCMS分析表明不含原料。然后，真空除去过量的DIPEA，并且将所需的产物通过HPLC纯化分离，得到25mg(50％产率)的(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC衍生物，为棕色固体。
ES(+)-HRMS m/e计算值C80H104N10O28S(M+2H)2+843.3444，实测值843.3437。
LCMS数据＝M+H，1687.6。
方法b)的实施例
流程图17
步骤1.将胱胺二盐酸盐(68mg，0.301mmol)和DIEA(110μL，2.1当量)溶于DMF(10mL)中，随后加入NHS-荧光素、5-和6-羧基荧光素的混合物(300mg，0.634mmol)，并且将产生的反应混合物在室温搅拌过夜。然后将其用乙酸乙酯稀释，并且用水洗涤三次，并且用盐水洗涤一次。萃取物经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，重溶于少量甲醇和乙酸乙酯中，然后用乙醚研磨，得到140mg荧光素-胱胺加合物，为鲜橙色固体。
步骤2.将荧光素-胱胺加合物(80mg，0.092mmol)溶于3:1的甲醇和水混合物(4mL)中，并且加入TCEP盐酸盐(80mg，3当量)。产生的反应混合物在室温搅拌2小时。产物通过HPLC纯化，得到78mg产物。LRMS(ESI)435.0。
荧光素标记的小分子-PEG结合物的制备
流程图18
通用方法：向配体(1当量)的DMSO溶液中加入DIEA(2当量)和SM(PEG)4n(1当量)。将产生的反应混合物在室温搅拌1小时。然后，加入含有硫羟基柄的荧光素(1当量)，并且将反应混合物再搅拌10分钟。产物通过HPLC纯化。
用于共价连接小分子整联蛋白靶向配体至5’-硫羟基-siRNA寡核苷酸的方法
siRNA制备
寡核糖核苷酸合成
寡核糖核苷酸是根据亚磷酰胺技术在固相上用ABI394合成仪(Applied Biosystems)以10μmol规模合成。
siRNA正义链：SEQ ID NO.1
siRNA反义链：SEQ ID NO.2
相应的siRNA靶向管家基因AHA1。合成是在可控孔度玻璃制成的固相(CPG，载量75μmol/g，购自Prime Synthesis,Aston,PA,USA)上进行。规则的RNA亚磷酰胺，2’-O-甲基亚磷酰胺以及辅助试剂购自Proligo(Hamburg,Germany)。具体而言，使用下列合成试剂(amidite)：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2’-O-甲基亚磷酰胺含有相同的保护基，作为规则的RNA合成试剂。所有的合成试剂溶于无水乙腈(100mM)中，加入分子筛()。为了在寡聚体的5’-末端上产生巯基连接体，使用购自Glen Research(Sterling,Virginia,USA)的1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺连接体。在小分子结合前，使用三-(2-羧基乙基)膦(TCEP，见下)还原二硫化物连接体。为了用Nu547荧光基团标记5’-末端，使用购自Thermo Fisher(Milwaukee,Wisconsin)的相应亚磷酰胺。5-乙基硫代四唑(ETT，500mM，在乙腈中)用作激活剂溶液。偶联时间6分钟。为了引人硫代磷酸连接，使用100mM的3-乙氧基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮(EDITH，购自Link Technologies,Lanarkshire,Scotland)的无水乙腈溶液。
支持物结合的寡聚体的裂解和脱保护
完成固相合成后，将干燥的固体支持物转移至15mL试管中，并且用在甲醇中的甲胺(2M，Aldrich)在45℃处理180分钟。离心后，将上清液转移至新的15mL试管中，并且将CPG用1200μL N-甲基吡咯烷-2-酮(NMP,Fluka,Buchs,Switzerland)洗涤。将洗涤液与甲醇化的甲胺溶液合并，并且加入450μL三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF，Alfa Aesar,Karlsruhe,Germany)。将混合物加热至65℃达150分钟。冷却至室温后，加入0.75mLNMP和1.5mL乙氧基三甲基硅烷(Fluka,Buchs,Switzerland)。10分钟后，离心收集沉淀的寡核糖核苷酸，弃去上清液，并且将固体重构于1mL缓冲液A(见下)。
寡核糖核苷酸的纯化
粗制的寡核糖核苷酸是通过强阴离子交换(SAX)HPLC纯化，在AKTA Explorer系统(GE Healthcare)上使用制备型22×250mm DNA Pac100柱(Dionex,Idstein,Germany)。缓冲液A由10mM NaClO4、1mMEDTA、10mM Tris、pH7.4、6M尿素和20％乙腈组成。缓冲液B含有在缓冲液A中的500mM NaClO4。使用4.5mL/分钟的流速。在260nm和280nm处记录UV迹线。使用在55分钟内20％B至45％B的梯度。合并适当的级分，并且用3M NaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。
粗制的Nu547标记的寡聚体是通过RP HPLC纯化，在AKTAExplorer系统(GE Healthcare)上使用XTerra Prep MS C810×50mm柱(Waters,Eschborn,Germany)。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵(Biosolve,Valkenswaard,The Netherlands)，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的50％乙腈。使用5mL/分钟的流速。在260、280和547nm(在Nu547标记的寡核糖核苷酸情况下)处记录UV迹线。使用在58个柱体积(CV)5％B至60％B的梯度。合并适当的级分，并且用3M NaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。
最后，纯化的寡聚体是通过尺寸排阻色谱法在含有Sephadex G-25(GE Healthcare)的柱上脱盐。溶液的浓度是通过UV光度计(BeckmanCoulter,Krefeld,Germany)在260nm处吸光度测量来测定。退火后将单个链以冷冻溶液保存于-20℃。
小分子RNA结合物的制备
将马来酰亚胺官能团装配的小分子通过硫醚连接共价偶联结合至RNA上。为了完成该化学反应，将～60mg含有5’-二硫化物连接体的RNA在水(5mL)中用1mL TCEP(0.5M，在水中，购自Sigma Aldrich)还原成相应的硫醇。一旦分析型阴离子交换HPLC表明反应完成(室温约2小时)，用30mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32:1(v/v)在-20℃过夜沉淀RNA。离心收集沉淀物，并且用于随后的小分子结合。
在典型的结合反应中，将10mg RNA溶于2mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH7.0)中。向该溶液中历经5分钟加入在ACN/NMP1:1(v/v)中的小分子(0.12mM)。一旦RP LC-ESI MS显示耗尽投入的RNA，将混合物用水(～10mL)稀释，并且加入～40mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32:1(v/v)，在-20℃过夜沉淀结合的RNA。离心收集沉淀物，溶于水中，并且如果需要，采用上述方法通过阴离子交换HPLC纯化。如果结合物足够纯，通过尺寸排阻柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)过滤反应混合物。
寡核糖核苷酸的退火，产生siRNA
通过混合等摩尔RNA溶液退火互补链。冷冻干燥混合物，并且用合适体积的退火缓冲液(100mM NaCl，20mM磷酸钠，pH6.8)重构，得到所需的浓度。将该溶液放入95℃水浴中，在3小时内将其冷却至室温。表3：siRNA序列信息；小写字母：2’-OMe核苷酸；s：硫代磷酸连接体；dT：脱氧胸腺嘧啶核苷；(C6SSC6)：C-6二硫化物连接；(Cy5)：酞菁5染料。
下列分析方法用于评价本发明的靶向VLA-4化合物在Jurkat细胞的VLA-4/VCAM结合分析中的抑制功效。
先前已经报道了下列粘附分析，少许修改后用于本发明。参见美国专利号6,229,011和6,380,387，将两者的全部内容并入本文作为参考。VLA-4(α4β1)靶向脂质体(来自实施例)的体外功效是用基于Jurkat细胞的分析(下面)测定，因为Jurkat细胞在其膜表面表达高水平VLA-4。每个分析是在96-孔板中进行，VCAM-1用作细胞的反配体(即VCAM-1结合到孔的表面)。
更特别的是，用25ng/孔的VCAM-1过夜包被96-孔高结合F96Maxisorp免疫微孔板(Nunc)。在试验当天，将板用含有1％无脂肪干燥乳的PBS缓冲液封闭1小时，消除非特异结合。然后用DPBS(杜伯科磷酸缓冲盐溶液)洗涤板，并且拍干。从孔中小心吸走任何过量的液体。
作为对照，向含有4％DMSO缓冲液的对照孔中加入抑制上述VLA-4的小分子拮抗剂(140)，并且逐级稀释在板中，通常浓度范围为1000nM至0.2nM。将Jurkat克隆E6-1细胞(ATCC)用100μg/mL6-羧基荧光素二乙酸盐(一种荧光染料)标记，然后用含有0.5mM二价阳离子Mn2+和0.05％牛血清白蛋白的RPMI1640培养基活化。值得注意的是活化需要获得最大的配体结合，并且可能通过体内细胞因子和趋化因子模拟整联蛋白的活化。测定的对照化合物(27)的IC50约12nM(即50％的细胞不结合孔表面的VCAM-1，因为推测细胞的VLA-4受体结合对照化合物或联合对照化合物)。
为了评价本发明的靶向VLA-4的化合物(来自实施例)的VLA-4抑制，将Jurkat细胞(表达高水平的VLA-4)以在96-孔板中终浓度2×105个细胞/孔加入到VCAM-1-包被的板中，并且与试验化合物(衍生的siRNA，小分子)在37℃温育45分钟。用PBS轻轻洗涤孔除去未结合细胞后，在TecanSafire2微孔板读数器上在450nm处读取结合的细胞的荧光信号。将数据点作图，并且使用浓度-响应曲线的线性部分经回归分析测定每种试验化合物的IC50。下表4和5显示了这些结果。
为了靶向递送而将整联蛋白拮抗剂共价连接至FITC荧光基团和 siRNA的小分子衍生物的细胞渗透性和定位的证据
方法
将在生长培养基(含有10％FBS的RPMI1640)中的AML MV4-11细胞与双链体-27(500nM)在37℃温育1小时。为了测定VLA-4非依赖性结合，将140(10μM)包含在一种条件中以阻断VLA-4依赖性结合。温育后，将细胞用D-PBS洗涤两次，并且在1％低聚甲醛中固定10分钟。使用ImageStreamx(Aminis Corporation,Seattle)通过成像流式细胞术分析siRNA的摄取。表A和图1-4显示了结果。
表A
化合物(浓度) Cy3平均强度
无 638
140(10μM) 663
双链体-27(500nM) 4007
140(10μM)+双链体-27(500nM) 2273
5’-正义链修饰的siRNA敲除细胞体系中AHA1mRNA的分析 材料与方法
参考基因：GAPDH
细胞系：H1299_Nut-Onc
平板接种密度：5,000个细胞/孔
平板接种形式：96-孔
平板接种至处理的时间：0
对照处理：模拟试验、未处理、对照siRNA
转染试剂：DharmaFect1
转染方法：反向TF
TF试剂体积/孔：0.15mL
siRNA终浓度：50nM
分析方法：第1天操作/第2天清洗
反向转染：用终浓度50nM的所示siRNA转染H1299细胞，使用0.15μL/孔的DharmaFect-1转染试剂。然后将细胞以5000个细胞/孔铺在96-孔板中，并且在37℃温育48小时。
用商家报道的Branched DNA分析测量siRNA敲除的功效；图5显示了敲除的结果。通过相同孔中GAPDH的绝对表达评价相对细胞活力(图6)。
除非相反地陈述，否则如所描述的那样制备和表征实施例中的所有化合物。将本文所引的所有专利和出版物的全部内容并入本文作为参考。

Claims (25)

1.式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n是1-24，并且其中：
R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0-3，并且G选自：
(2)下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5独立地是氢或卤素，W是O或CH2，并且G选自：
(3)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
2.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3。
3.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3。
4.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3。
5.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3。
6.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
7.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
8.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
9.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0-3，R4和R5是氢或卤素，并且W是O或CH2。
10.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
11.权利要求1至10任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
12.权利要求1至10任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
13.权利要求1至10任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
14.权利要求1至10任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
其中R3是单链或双链寡核苷酸，并且X表示硫或下式化合物：
15.权利要求14的化合物，其中R3是siRNA分子。
16.权利要求1的化合物，其选自：
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸；
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基]丙酸；
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙基]环戊烷羰基]氨基]丙酸；和
(S)-2-[[1-[2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-乙基]-环戊烷羰基]-氨基]-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]丙酸。
17.权利要求1的化合物，其选自：
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；
(S)-3-[4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)苯基]-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]丙酸；和
(S)-2-[[1-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁基]环戊烷羰基]氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸。
18.权利要求1的化合物，其选自：
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；
(S)-2-[2,6-二氯-4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；和
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐。
19.权利要求1的化合物，其选自：
(S)-2-[4-[(3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基)甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸三氟乙酸盐；
(S)-2-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]-2,6-二氟苯甲酰基氨基]-3-[4-(1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)苯基]丙酸；和
(S)-2-[4-[[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙酰基]-[4-[(S)-1-羧基-2-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]乙基氨基甲酰基]-3,5-二氟苄基氨基]甲基]-2,6-二氟苄基氨基]-3-[4-[1,3,6-三甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基]苯基]丙酸。
20.权利要求1的化合物，其是：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC。
21.包含权利要求1至20任意一项的化合物和可药用载体的药物组合物。
22.治疗炎症、癌症或者代谢疾病或病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至20任意一项的化合物。
23.权利要求1至20任意一项的化合物在治疗或预防炎症、癌症或者代谢疾病或病症中的用途。
24.权利要求1至20任意一项的化合物在制备用于治疗或预防炎症、癌症或者代谢疾病或病症的药物中的用途。
25.上面描述的本发明。
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