JP6182542B2 - Ｌｆａ−１を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体 - Google Patents

Ｌｆａ−１を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体 Download PDF

Info

Publication number
JP6182542B2
JP6182542B2 JP2014553706A JP2014553706A JP6182542B2 JP 6182542 B2 JP6182542 B2 JP 6182542B2 JP 2014553706 A JP2014553706 A JP 2014553706A JP 2014553706 A JP2014553706 A JP 2014553706A JP 6182542 B2 JP6182542 B2 JP 6182542B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ethoxy
compound
formula
phenyl
hydroxy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2014553706A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2015508055A (ja
Inventor
ジュニア ロバート アラン グッドナウ
ジュニア ロバート アラン グッドナウ
マシュー マイケル ハミルトン
マシュー マイケル ハミルトン
アグニエシュカ コヴァルチック
アグニエシュカ コヴァルチック
アチュサラオ シドゥリ
アチュサラオ シドゥリ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JP2015508055A publication Critical patent/JP2015508055A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6182542B2 publication Critical patent/JP6182542B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/02—Monothiocarboxylic acids
    • C07C327/04—Monothiocarboxylic acids having carbon atoms of thiocarboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C327/06—Monothiocarboxylic acids having carbon atoms of thiocarboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to hydrogen atoms or to carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C381/00—Compounds containing carbon and sulfur and having functional groups not covered by groups C07C301/00 - C07C337/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/22—Amino derivatives of triarylmethanes containing OH groups bound to an aryl nucleus and their ethers and esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/444—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5
    • C07D207/448—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide
    • C07D207/452—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, directly attached to the ring nitrogen atom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

本発明は、結合体化される部分と標的化実体との間に共有結合が形成されるような、チオールなどの反応性求核剤を含有する他の分子との化学反応に適したリンカーおよび官能基を含有する、強力かつ選択的な小分子インテグリンアンタゴニストの合成および反応に関する。LFA-1アンタゴニストおよび/またはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストがICAM-1受容体に結合するように、当該小分子標的化アンタゴニストは同族受容体系に結合する。共有結合により連結された部分としては、小分子治療薬、ポリマー、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられる。5'-チオ-siRNAの標的化送達を可能にする手段としての5'-チオ-siRNA誘導体を形成するための5'-チオ含有オリゴヌクレオチドが含まれる。そのような誘導体化siRNAと適切なトランスフェクション剤との組み合わせは、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)を通じて標的遺伝子の発現を防止する。
LFA-1としても知られるリンパ球機能関連抗原1は、すべてのT細胞上、ならびにB細胞、マクロファージおよび好中球上に見られかつ感染部位への動員に関与する、インテグリンである。それは抗原提示細胞上のICAM-1に結合し、接着分子として機能する。CD54(表面抗原分類54)としても知られるICAM-1(細胞間接着分子1)は細胞表面糖タンパク質である。異常なレベルのLFA-1/ICAM-1相互作用が炎症性疾患および炎症性障害において機能すると考えられ、したがって、そのような系への拮抗作用が治療手段であると考えられる。したがって、これらの系への高親和性小分子の標的化は、ICAM-1受容体を発現する細胞系にsiRNAなどの治療薬を選択的に送達する手段を与えることができる。
RNA干渉は周知のプロセスであり、このプロセスでは、メッセンジャーRNA(mRNA)のタンパク質への翻訳が、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの相補的もしくは部分相補的オリゴヌクレオチドとの会合または結合によって干渉される。siRNAは、通常は長さが19〜25ヌクレオチドの範囲である二本鎖RNA分子であり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)として知られる細胞質中の一組のタンパク質と会合する。RISCが最終的に二本鎖siRNAを分離することで、1本の鎖がmRNA分子の相補的もしくは部分相補的部分と結合または会合し、その後mRNAはRISCによって破壊されるかまたは翻訳を妨げられ、結果的に、コードされたタンパク質または遺伝子産物の発現が抑制される。
治療用途で(特にヒトにおける全身投与に)siRNAなどの核酸を使用する上での問題の1つは、(1) 特定の標的細胞または標的細胞型、および(2) それらの細胞の細胞質(すなわち、mRNAが存在しかつタンパク質に翻訳される場所)に核酸を送達することにあった。送達上の問題の一部は、核酸が負に帯電しており、容易に分解され(特に無修飾の場合)、腎臓によって効率的に濾過され、それ自体では細胞の細胞質に容易に輸送することができないという事実に基づく。したがって、著しい量の研究が、リポソーム、ミセル、ペプチド、ポリマー、結合体およびアプタマーを含む様々な担体および製剤に関する送達上の問題を解決することに重点を置いた。Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)（非特許文献1）を参照。一部の比較的有望な送達媒体は、脂質ナノ粒子を含む脂質系の使用を包含している。Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)（非特許文献2）；Hopeらによる国際特許出願公開第WO 2010/042877号（特許文献1）(「Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids」)を参照。しかし、特定の標的細胞およびそのような細胞の細胞質へのsiRNA、ならびに小分子、ペプチド、他の核酸、蛍光部分およびポリマーなどの他の物質の標的化について、さらなる改善が依然として必要である。
国際特許出願公開第WO 2010/042877号
Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009) Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)
本発明は、式I：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、R1、R2およびnは詳細な説明および特許請求の範囲に定義されている、化合物に関する。特に、本発明は、様々な治療用途および他の用途のための、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の、インテグリンα4β1(最晩期抗原4)二量体、αVβ3二量体、またはリンパ球機能関連抗原1（LFA-1）を発現する標的細胞への改善された送達のための、式Iの化合物に関する。本発明はまた、そのような化合物を製造および使用する方法に関する。
[本発明1001]
式I：
Figure 0006182542
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル：
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(4) 式：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す、化合物
からなる群より選択される。
[本発明1002]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
QがHである、本発明1004の化合物。
[本発明1006]
QがOHである、本発明1004の化合物。
[本発明1007]
R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1008]
R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1009]
R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1010]
R2が式：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつXは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す、本発明1001〜1006のいずれかの化合物。
[本発明1011]
Xが硫黄を表す、本発明1010の化合物。
[本発明1012]
R3がsiRNA分子である、本発明1010または1011のいずれかの化合物。
[本発明1013]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1007〜1012のいずれかの化合物。
[本発明1014]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、本発明1007〜1012のいずれかの化合物。
[本発明1015]
R1が式：
Figure 0006182542
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、本発明1007〜1012のいずれかの化合物。
[本発明1016]
以下からなる群より選択される、本発明1001の化合物：
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸。
[本発明1017]
以下からなる群より選択される、本発明1001の化合物：
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8。
[本発明1018]
以下からなる群より選択される、本発明1001の化合物：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸。
[本発明1019]
以下からなる群より選択される、本発明1001の化合物：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
[本発明1020]
以下からなる群より選択される、本発明1001の化合物：
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; および
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
[本発明1021]
本発明1001〜1020のいずれかの化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1022]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明1001〜1020のいずれかの化合物を投与する段階を含む、方法。
[本発明1023]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、本発明1001〜1020のいずれかの化合物の使用。
[本発明1024]
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、本発明1001〜1020のいずれかの化合物の使用。
[本発明1025]
以上に記載の発明。
表1は、特定の5'-誘導体化siRNA一本鎖および二本鎖の組成を示す。 表2は、小分子siRNA結合体の分析データを示す。 表3は、アンチセンス鎖の5'がNu547で誘導体化されたsiRNA配列を示す。 表4は、インテグリンアンタゴニストアッセイにおける小分子-siRNA結合体の効力、およびsiRNAのKDデータを示す。 表5は、FITC異性体標識試薬の同一性、特徴づけおよび結合能を示す。 ヒストグラフを示す(「B」: 二本鎖-27 500nMおよび例140 10μM；「A」: 二本鎖-27)。 代表的siRNA取り込み画像(二本鎖-27(500nM))を示す。 例FITC-5(LFA-1アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。 例FITC-14(VLA-4アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。ヒストグラフは、VLA-4標的化要素を伴うsiRNA二本鎖の存在の変化を示す。VLA-4アンタゴニスト例140の存在下では、この変化は扁平状である。 5'-センス鎖においてインテグリン標的化小分子によって誘導体化されたsiRNA二本鎖で処理された際のH1299細胞におけるAHA1発現の減少を示す。y軸はAHA1の実測発現レベルを示す。比較的低い棒は比較的高度のノックダウン(比較的高度のsiRNAトランスフェクション)を示し、高い棒は比較的低度のノックダウン(すなわち比較的低度のsiRNAトランスフェクション)を示す。青色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾を有し、桃色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾、およびアンチセンス鎖の5'-末端に結合したNu547フルオロフォアを有する。 細胞の健康状態のマーカーであるGAPDH mRNA発現のレベルを示す。誘導体化siRNAで処理された細胞とモック細胞および未処理細胞とで発現レベルが類似していることは、当該処理の濃度および期間で細胞毒性が存在しないことを示している。
別途指定がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語および語句は以下のように定義される。
「部分」という用語は、1つもしくは複数の化学結合によって別の原子または分子に結合することで分子の一部を形成する、原子または化学結合した原子の群を意味する。例えば、式Iの可変要素R1およびR2は、式Iに示す構造に対して、示された位置で共有結合によって結合している、部分を意味する。
「結合体化された部分」という用語は、治療用のまたは有用な化合物、ペプチド、ポリマー、小分子、蛍光部分、オリゴヌクレオチドまたは核酸である、部分を意味する。例としては、薬物、治療用ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が挙げられる。
別途指定がない限り、「水素」または「ヒドロ」という用語は水素原子部分(-H)を意味し、H2を意味しない。
「ハロゲン」という用語はフッ素部分、塩素部分、臭素部分またはヨウ素部分を意味する。
「アルキル」という用語は、1〜25個の炭素原子を有する脂肪族直鎖または分岐鎖飽和炭化水素部分を意味する。
「TFA」という用語はトリフルオロ酢酸を意味する。
別途指定がない限り、「下記式の化合物(a compound of the formula)」または「下記式の化合物(a compound of formula)」または「下記式の化合物(compounds of the formula)」または「下記式の化合物(compounds of formula)」という用語は、その式によって定義される化合物の部類より選択される任意の化合物(別途記載がなければそのような任意の化合物の薬学的に許容される任意の塩またはエステルを含む)を意味する。
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の理由で望ましくないということがない塩を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、好ましくは塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、N-アセチルシステインなどの有機酸によって形成することができる。さらに、塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることで調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂など）の塩が挙げられるが、それらに限定されない。置換パターンに応じて、本発明の化合物は双性イオンとして存在してもよい。
本発明の化合物は薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。本発明の化合物は薬学的に許容されるエステル(すなわち、プロドラッグとして使用される式Iの酸のメチルおよびエチルエステル)の形態で存在してもよい。本発明の化合物は溶媒和、すなわち水和していてもよい。溶媒和は製造プロセスの途中で行われてもよく、例えば当初は無水である式Iの化合物の吸湿性の結果(水和)として行われてもよい。
同一の分子式を有するが原子の性質もしくは結合順序または原子の空間配置が異なる化合物を「異性体」と呼ぶ。原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。ジアステレオマーとは、鏡像異性体ではない、1つまたは複数のキラル中心において相対する立体配置を有する立体異性体のことである。重ね合わせられない互いの鏡像である、1つまたは複数の不斉中心を有する立体異性体を「鏡像異性体」と呼ぶ。ある化合物が不斉中心を1つ有する場合、例えば炭素原子が4つの異なる基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、不斉中心の絶対配置によって特徴づけることができ、Cahn、IngoldおよびPrelogのR-およびS-順位則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性または左旋性(すなわちそれぞれ(+)または(-)-異性体)と命名される。キラル化合物は個々の鏡像異性体またはその混合物として存在し得る。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させるか、または治療される対象の生存を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は当技術分野における技能の範囲内である。本発明の化合物の治療上有効な量または投薬量は、広い範囲内で変動し得るし、当技術分野において公知の様式で決定することができる。そのような投薬量は、投与される特定の化合物、投与経路、治療される状態および治療される患者を含む、特定の各症例における個々の要件に対して調整される。1日の投薬量は、単一用量または分割用量で投与してもよく、非経口投与では持続注入として投与してもよい。
「薬学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合性のある他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合性のあるあらゆる材料を含むように意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。
詳しくは、本発明は、式I：
Figure 0006182542
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物（式中、QはHまたはOHである）
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(4) 式：
Figure 0006182542
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルに関する。
上記構造中で使用されている
Figure 0006182542
という記号は、構造または部分が共有結合によってベース分子（base molecule）に結合する場所を示すために使用される。さらに、上記の記号との組み合わせで使用される「PEGへ」もしくは「Sへ」という語句または同様の文言は、複数の結合点が存在する場合に構造または部分がベース分子に結合する場所または方法を示す。例えば、R2が式：
Figure 0006182542
（式中、Xは式：
Figure 0006182542
の化合物である）の化合物である場合、
式Iに基づく構造は、式：
Figure 0006182542
（式中、R1、R3およびnは式Iに定義の通りである）である。
本発明はまた、式Iの化合物、およびそのような化合物を含有する薬学的組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、ICAM-1受容体を発現する標的細胞への小分子、タンパク質、核酸、ポリマー、蛍光マーカーおよび他の物質の送達を改善する上で有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定の標的タンパク質の発現を阻害するために、ICAM-1受容体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する組成物および製剤に関する。
より特定の態様では、本発明は、ICAM-1受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型へのsiRNAなどの核酸の送達を促進する製剤のための、式Iの化合物の使用に関する。さらに、炎症、およびがんのような増殖性障害を治療する送達用製剤を合成するための式Iの化合物の使用が、本発明の一部である。
R1は、式Iの化合物をLFA-1インテグリンに標的化することで、そのような受容体を発現する細胞への該化合物の送達を促進する、小分子インテグリンアンタゴニストを表す。
特定の態様では、R1の小分子インテグリンアンタゴニスト標的化部分は、インテグリンに対する小分子の結合親和性が遊離小分子インテグリンアンタゴニストに比べて実質的に減少しない位置で結合する。式IのR1部分は（ICAM-1受容体に対するLFA-1アンタゴニストまたはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストを介して）ICAM-1受容体を標的化する。
特定の態様では、R1は、式：
Figure 0006182542
のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩もしくはエステルである。
他の態様では、R1は、式：
Figure 0006182542
のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩またはエステルである。
他の態様では、R1は式：
Figure 0006182542
（式中、QはHまたはOHである）のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩またはエステルである。
R2は、チオール含有分子などの強力な求核剤を有する、治療用のまたは他の有用な化合物または結合体化される部分との共有結合を形成可能な、反応性部分を表し得る。そのような反応性部分の例としては、
Figure 0006182542
からなる群より選択される部分が挙げられる。
あるいは、R2は、治療用のまたは他の有用な化合物、タンパク質またはオリゴヌクレオチドなどの結合体化された部分(R3)に既に結合した部分を表し得る。より具体的には、R2は、式：
Figure 0006182542
部分を表し得、
式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す。
特定の態様では、R3はオリゴヌクレオチドを表す。より特定の態様では、R3は、一本鎖または二本鎖で存在し得るRNA分子、例えばsiRNA分子のセンス鎖の5'-末端を表す。RNAi剤としても知られるそのようなsiRNA分子は、細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する。特定の態様では、R3は、長さが15〜30ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチド鎖から本質的になるsiRNA分子であり、センスオリゴリボヌクレオチド鎖の5'末端は、上記構造に示すようにR2に結合しており、標的遺伝子に対応するmRNAの少なくとも一部に相補的である。他の態様では、R3は、5'-末端において結合したDNAのオリゴヌクレオチドである。そのような誘導体化DNAは、一本鎖として、または別のオリゴヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズした1本の鎖として存在し得る。オリゴヌクレオチド鎖は無修飾でもよく、代謝安定性のために修飾されていてもよい。そのような修飾としては、ホスフェート上の特定位置における置換(例えばホスホロチオエート)ならびに2'-ヒドロキシ上の特定位置における置換(例えば2'-O-メチルおよび2'-フルオロ)が挙げられるが、それらに限定されない。
特定の態様では、式IのR2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、（式Iをベースとする）式5：
Figure 0006182542
（式中、R1、nおよびXは式Iに定義の通りである）中に示すRNAのセンス鎖を含む。
他の特定の態様では、センス鎖はアンチセンス鎖に結合し得る。
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3（式中、R3は小分子またはタンパク質を表す）を表し、それによって、共有結合により連結された、式Iの特異的標的化実体が形成される。
より特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は治療用の小分子またはタンパク質を表す。
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、細胞顕微鏡観察技術を使用するこれらのインテグリン受容体結合の可視化に有用な蛍光部分を表す。
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、一級反応性スルフィドを有するポリマーを表す。より具体的には、R3は、細胞表面および細胞の細胞質ドメインに対するsiRNAの複合体形成および送達に有用なカチオン性ポリマーを表し得る。
より特定の態様では、本発明は、R3が、
Figure 0006182542
に示すフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
より特定の他の態様では、本発明は、R3が、
Figure 0006182542
に示すFITC-14の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
他の態様では、本発明は、nが9〜13、好ましくは12である、式Iの化合物に関する。
より特定の態様では、本発明は、以下の化合物（または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル）のうちの1つからなる群より選択される式Iの化合物に関する：
LFA-1リガンド試薬1
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬2
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬3
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬4
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8；
LFA-1リガンド試薬5
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬6
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬7
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬8
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬9
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬10
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
さらに、本発明は、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する標的細胞の細胞質へのsiRNAなどの核酸の改善された送達をもたらす、siRNAと組み合わせた際にナノ粒子を創製するための、式Iの化合物を含有する新規組成物および製剤に関する。特定の態様では、本発明は、(1) R2が5'-siRNAオリゴヌクレオチドを含む、式Iの化合物と、(2) ポリカチオン性トランスフェクション剤とを含む、siRNA製剤に関する。
本発明はまた、そのような化合物および組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する組織または細胞への薬物、核酸または他の治療用化合物の送達を改善する組成物または製剤の成分として有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定のタンパク質の発現を阻害するために、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する製剤に関する。より特定の態様では、本発明は、がんまたは炎症性疾患の治療のための、ICAM-1受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型にsiRNAを有効に送達可能な、式Iの化合物およびそのような化合物を含有する組成物に関する。そのような化合物および組成物は、式Iの化合物を欠く同様の製剤に比べて、より有効であるし、改善されたノックダウン能力を示す。
本発明の一態様では、式I：
Figure 0006182542
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物（式中、QはHまたはOHである）
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(2) 式：
Figure 0006182542
の化合物；
(3) 式：
Figure 0006182542
の化合物；および
(4) 式：
Figure 0006182542
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルが提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
（式中、QはHまたはOHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
（式中、QはHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
（式中、QはOHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄を表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
の化合物であり、
R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
の化合物であり、
R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、R1が式：
Figure 0006182542
（式中、QはHまたはOHである）の化合物であり；
R2が式：
Figure 0006182542
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
Figure 0006182542
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸。
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8。
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸。
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; および
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
本発明の別の態様では、式Iの化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
本発明の化合物の一般的合成
式Iの化合物を合成するための好適な方法を実施例に示す。一般に、式Iの化合物は、以下に示すスキームに従って調製することができる。別途指定がない限り、以下のスキーム中の変数nならびにR1およびR2は、式Iの部類に関する以前の定義と同様に定義される。
マレイミド-(PEG)n-インテグリンアンタゴニスト結合剤の一般的合成
様々な長さのPEGのスキーム1の26などの化合物は市販されている(例えばPierce BioScienceから)。そのような化合物は、PEGアミノ酸のアミノ末端をアミド結合形成条件下で3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオン酸によってアシル化した後、エステル形成条件下でのN-ヒドロキシコハク酸との反応によって反応性N-ヒドロキシコハク酸エステルを形成することで作製することもできる。スキーム1に示すように、化合物26と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体28を生成させる。
Figure 0006182542
R4がチオアセチルまたは2-ジチオピリジルであって、様々な長さのPEG部分を有する、スキーム2の29などの化合物も市販されている(例えばPierce BioScienceから)。構造29を有する化合物と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体30を生成させる。
Figure 0006182542
本発明の特定の非限定的な例として、スキーム3に示すように、中間体26と31とを反応させることでマレイミド中間体32を生成する。
Figure 0006182542
同様に、スキーム4に示すように、中間体26と33とを反応させることでマレイミド中間体34を生成することができる。
Figure 0006182542
同様に、スキーム5に示すように、中間体29と35とを反応させることで中間体36を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
Figure 0006182542
同様に、スキーム6に示すように、中間体29と37とを反応させることで中間体38を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
Figure 0006182542
一般構造26または29の化合物では、異なるPEGの長さが利用であるかまたは当業者によって容易に作製され、好ましくはn = 8〜24である。このトピックは徹底的に報告および考察されてきた(例えばChemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476)。
スキーム7に示すように、中間体31は既報(例えばSidduri, A. et al. Bioorganic &amp；Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478)と同様に合成することができる。
Figure 0006182542
具体的には、スキーム7に示すように、中間体41を市販の(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸40から作り出した。メタノール溶液中の市販の出発原料40のニトロ基を塩化アンモニウムの存在下、亜鉛末によって室温で数時間かけて還元してアニリン41を得た。ニトロ還元の他の方法は当業者に公知である。アニリン41をジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピル-エチルアミンなどの塩基の存在下、室温で、塩化2,6-ジクロロベンゾイル42などのハロゲン化ベンゾイル誘導体によってアシル化した。こうしてアミド43を形成した。t-ブチルカルボニル(Boc)アミン保護基を、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば室温でのジオキサン中HCl溶液による処理によって除去し、これにより塩酸塩44を得た。塩酸塩44を公知の1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボン酸45の存在下、アミド結合形成条件(やはり当業者に周知)で処理することで、ジ-アミド46を生成した。中間体46のアジド基をテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、室温でのトリ-アルキルホスフィンによる処理によって還元した。さらに、メチルエステルをエタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒混合物中、50℃などの高温で15時間の水酸化ナトリウムによる処理によって鹸化した。この方法によって、双性イオンとして提示されることもある中間体31を形成した。
PEG部分の結合は、スキーム8に示すように合成される中間体39によっても可能である。具体的には、3,5-ジクロロフェノール47をDMFなどの極性非プロトン性溶媒中、イミダゾールなどの塩基の存在下で塩化トリ-イソプロピルシリルによって保護した後、無水テトラヒドロフラン中、-78℃などの低温でブチルリチウムなどの強塩基と反応させる。得られたリチウム錯体を、ドライアイスの形態で加えられる二酸化炭素で反応停止させることで、安息香酸誘導体である中間体48を得る。次に中間体48をトルエンなどの非プロトン性溶媒中での塩化スルホニル(SOCl2)による処理によって塩素化することで塩化アシルを形成する。この時点で、塩化アシルとアミン塩酸塩49とをジクロロメタン(DCM)などの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの塩基の存在下で反応させることで中間体50を形成する。中間体50のシリル保護基をテトラヒドロフランなどのプロトン性溶媒中、室温でのフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理によって除去する。このフェノール中間体と3-N-t-ブチル-カーボネート-1-ブロモプロパンとをジメチルホルムアミド(DMF)などの非プロトン性溶媒中、炭酸カリウム(K2CO3)などの塩基の存在下で反応させる。こうして中間体52を形成し、これをトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護し、続いてエタノールなどのプロトン性溶媒中で水酸化ナトリウムなどの塩基によって加水分解することで中間体39を形成する。
Figure 0006182542
LFA-1アンタゴニスト誘導体化剤の合成
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える小分子を、以下のスキーム11、12、13および14に示す。スキーム11に示すように、3-(3-メトキシ)-プロパン酸エステル70の一級アミドを当業者に公知の標準的条件下で形成し、還元する。これとは別に、尿素、アセトアルデヒドおよび3-オキソ-ブタン酸エチルエステルとのBignelli反応を使用してジヒドロピリミジンを形成する。50%硝酸でのジヒドロピリミジンの処理によってこの生成物のピリミジンを形成することで、4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルを得る。
POCl3(オキシ塩化リン)との反応によってこの物質の塩化物を形成することで72を形成する。アミン71と塩化物72とを反応させることで二級アミンエステル73を形成する。この時点で、非プロトン性溶媒中での三臭化ホウ素などのルイス酸での処理によってメトキシ基を除去することでフェノール74を形成する。このフェノール74を塩基水溶液の存在下で鹸化した後、S-3-N-t-ブチル-カルバメート-2-カルボキシ-ジアミノプロパン塩酸塩(H-DAP(Boc)OMe塩酸塩)の存在下でアミドカップリング条件を適用することで、中間体77を形成する。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子21を形成する。
例としてのLFA-1リガンド試薬1、LFA-1リガンド試薬2、LFA-1リガンド試薬3のための反応スキーム11：
Figure 0006182542
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える他の小分子を、以下のスキーム12に示す。具体的には、トルエンなどの非プロトン性溶媒中の2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸79を塩素化試薬である塩化チオニルによって還流条件下で処理する。次に、ワークアップ時に塩化アシルをジ-イソプロピルエチルアミンなどの塩基、および(S)-3-(4-アミノ-フェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル80で処理することでアミド81を作り出す。Bocアミノ保護基を標準的条件下で除去し、得られた一級アミン83を標準的アミド結合形成反応条件下でカップリングする。メチルエステル84はWO 01/58853号に報告されており、メチルエステル84のシリル保護を当業者に周知の標準的条件によって行った。カップリングおよび脱保護後、アミド88を(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステルで処理した。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子22を形成する。
例としてのLFA-1リガンド試薬4、LFA-1リガンド試薬5、LFA-1リガンド試薬6、LFA-1リガンド試薬7のための反応スキーム12：
Figure 0006182542
同様に、LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える他の小分子の生成を、以下のスキーム13に示す。具体的には、アセトンおよびDMFなどの溶媒混合物中、炭酸カリウムの存在下などの塩基性条件下で、安息香酸3-ヒドロキシメチルを(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステルでアルキル化することで、中間体91を作り出す。メチルエステル91を鹸化し、得られた遊離酸92を標準的アミド結合形成条件下で中間体93(スキーム11)とカップリングすることで中間体94を得る。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子96を形成する。
例としてのLFA-1リガンド試薬8のための反応スキーム13：
Figure 0006182542
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える、以下のスキーム14に示す化合物102を作り出すために、同様の反応順序を使用する。安息香酸3-ヒドロキシメチルで出発する代わりに、出発原料の安息香酸3,5-ジヒドロキシメチル97を同様の順序において使用して、やはりスキーム14に示す中間体103を作り出す。
例としてのLFA-1リガンド試薬9、LFA-1リガンド試薬10のための反応スキーム14：
Figure 0006182542
有用性
式Iの化合物は、様々な治療用途および他の用途で、LFA-1インテグリン受容体複合体を発現する標的細胞に治療薬、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分を送達する上で有用である。したがって、式Iの化合物は、LFA-1の発現または過剰発現に関連する様々な疾患および状態を治療するために使用することができる。そのような疾患および状態としては炎症、がん、および代謝関連疾患を挙げることができる。
特定の態様では、本発明は、がんの治療または予防を、そのような治療を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において行う方法であって、治療有効量の式Iの化合物を投与する段階を含む方法を含む。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、式Iの化合物の使用が提供される。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、式Iの化合物の使用が提供される。
そのような組成物は良質の医療のための原則(good medical practice)に一致する様式で投与することができる。この文脈で考慮される要素としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与すべき化合物の「有効量」は、疾患または状態を治療もしくは予防し(例えば標的タンパク質の発現を阻害し)かつ許容されない毒性を回避するために必要な最小量などの考慮事項によって左右される。例えば、そのような量は正常細胞、または哺乳動物全体に毒性のある量を下回ることができる。本発明の式Iの化合物を含有する組成物は非経口投与、腹腔内投与および肺内投与によって投与することができる。非経口注入としては筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
試薬をAldrich、SigmaおよびPierce BioScience、または以下に示す他の供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。マルチミリグラム〜マルチグラムのスケールの精製を当業者に公知の方法、例えばシリカゲルフラッシュカラムの溶離により行った。また、いくつかの場合では、分取フラッシュカラム精製を、CombiFlashシステムで溶離される使い捨て予備充填マルチグラムシリカゲルカラム(RediSep)の使用により行った。また、Biotage(商標)およびISCO(商標)は、中間体の精製に本発明で使用可能なフラッシュカラム機器である。
化合物の同一性および純度を判定する目的で、以下のシステムを使用してLC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析)スペクトルを記録した。質量スペクトルの測定では、システムはMicromass Platform II分光計: ポジティブモードのESイオン化(質量範囲: 150〜1200amu)からなる。同時クロマトグラフィー分離を以下のHPLCシステムで実現した: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å(3.2x30mm)カラムカートリッジ；移動相A: 水(0.02% TFA)および相B: アセトニトリル(0.02% TFA)；勾配10% B〜90% B、3分；平衡化時間1分；流量2mL/分。いくつかの場合では、分取HPLC中に20ミリモル濃度の酢酸アンモニウムを有効イオン化用調節剤として使用した。そのような場合ではアンモニウム塩を単離した。
いくつかの分離では、超臨界流体クロマトグラフィーの使用も有用であり得る。超臨界流体クロマトグラフィー分離は以下の典型的条件でMettler-Toledo Minigramシステムを使用して行った: 12mm ADカラムを超臨界流体CO2中40% MeOHによって100bar、30℃、2.0mL/分で溶離。塩基性アミノ基を有する分析物の場合、0.2%イソプロピルアミンをメタノール調節剤に加えた。
化合物を、Varian Inova 400 MHz NMR分光計またはVarian Mercury 300 MHz NMR分光計を使用する1H-NMR、およびBruker Apex-II高分解能4.7T FT-質量分析計を使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。また、最終化合物を、Thermo Electronが販売するLTQ CL Orbitrapを使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。
本明細書において使用される略語は以下の通りである。
AIBN 2,2'-アゾビスイソブチロニトリル
Bu ブチル
DCE 1,2-ジクロロエタン
DCM ジクロロメタン
DBU 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DIAD ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIEA ジエチルアミン
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
EDC-HCl 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
EtOAc 酢酸エチル
EtOH エチルアルコール
FCC フラッシュカラムクロマトグラフィー
h 時間
HBTU O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート
HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC 高圧液体クロマトグラフィー
HRMS 高分解能質量スペクトル
LRMS 低分解能質量スペクトル
LC 液体クロマトグラフィー
L-Pro L-プロリン
MCPBA メタ-クロロ過安息香酸
MeOH メチルアルコール
MW マイクロ波
NIS N-ヨードスクシンイミド
NBS N-ブロモスクシンイミド
NMP 1-メチル-2-ピロリジノン
PdCl2(dppf) [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
PEGn ポリエチレングリコールのn回繰り返し(例えばPEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG 保護基
PyBroP ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
rt 室温
TBAF フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDMS tert-ブチル-ジメチルシリル
TBTU 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート
TMS トリメチルシリル
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TLC 薄層クロマトグラフィー
TPP トリフェニルホスフィン
標的化剤として使用される、ICAM-1受容体に対する小分子LFA-1アンタゴニストおよび/またはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストの合成
パート1: 好ましい中間体
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオンアミドの調製
Figure 0006182542
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオン酸(15g、83.2mmol)および4-メチル-モルホリン(10.1ml、91.56mmol)のTHF(150ml)溶液を0℃に冷却し(氷水浴)、クロロギ酸イソプロピル(トルエン中1M、91.6ml、91.56mmol)を20分かけて加えた。混合物を0℃でさらに30分間攪拌した後、7N NH3/MeOH(24ml、168mmol)を滴下した。混合物を室温に昇温させ、2時間攪拌した。それを10% K2CO3水溶液で反応停止させ、EtOAcで抽出した。有機抽出物を一緒にし、水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて所望のアミド(11.15g、収率75%)を得た。MS m/e 179.9 (M+H+)。
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミンの調製
Figure 0006182542
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオンアミド(11.15g、62.26mmol)のTHF(100ml)溶液にTHF中BH3(2.2g、188mmol)を室温で加えた。溶液を還流温度に4時間加熱し、室温に冷却し、MeOH(50ml)で反応停止させた。溶液を還流温度に30分間加熱し、濃縮し、水で処理し、EtOAcで抽出した。抽出物を10% K2CO3水溶液、水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて標記化合物(9.26g、収率90%)を得た。MS m/e 165.9 (M+H+)。
4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
Figure 0006182542
350ml加圧フラスコ中で3-オキソ-ブタン酸エチルエステル(16.27g、125mmol)、アセトアルデヒド(5.51g、125mmol)、尿素(7.51g、125mmol)および氷酢酸(20滴)のエタノール(35ml)中混合物を90℃に終夜加熱した。混合物を水で希釈した。析出物を濾取し、水で洗浄し、風乾させて所望の生成物(17.68g、収率71%)を得た。MS m/e 198.8 (M+H+)。
4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
Figure 0006182542
50%硝酸の氷冷溶液(120ml)に4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(34.63g、174.7mmol)を数回に分けて5分かけて加えた。溶液を0℃で10分間攪拌し、氷水(500ml)に注ぎ、固体K2CO3で中和し、クロロホルムで抽出した。一緒にした有機層を水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物(21.9g、収率71%)を得た。MS m/e 197.1 (M+H+)。
2-クロロ-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
Figure 0006182542
POCl3(106ml)およびDIEA(65ml)の溶液に4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(21.9mg、111.6mmol)を加えた。混合物を110℃に2時間加熱した。過剰のPOCl3およびDIEAを減圧蒸発により除去した。残渣をEtOAc(1.2l)に溶解させ、脱色炭で処理した。濾過後、溶液を1N NaOH、水およびブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をヘキサン中0〜30% EtOAc勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(9.33g、収率39%)を得た。
2-[3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
Figure 0006182542
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミン(2.31g、13.98mmol)、2-クロロ-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2g、9.32mmol)のEtOH(12ml)中混合物を160℃で1.5時間マイクロ波処理した。反応混合物を室温に冷却し、10% K2CO3で反応停止させ、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をヘキサン中30% EtOACを用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(2.42g、収率76%)を得た。MS m/e 344.1 (M+H+)。
2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ)-4,-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
Figure 0006182542
2-[3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2.42g、7.05mmol)のDCM(50ml)溶液を氷水浴中で冷却し、BBr3/DCM(1M、14.1ml、14.1mmol)を滴下した。得られた溶液を室温に昇温させ、室温で2時間攪拌した。溶液を氷水で反応停止させ、DCMで抽出した。有機層を一緒にし、水およびブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して所望の生成物(2g、収率86%)を得た。MS m/e 330.1 (M+H+)。
(S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,5-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2.0g、6.0mmol)のジオキサン(30ml)溶液を水酸化リチウム一水和物(6.3g、150mmol)の水(30ml)溶液で処理した。混合物を90℃で12時間攪拌した後、室温に冷却し、硫酸水素カリウム水溶液で反応停止させてpHを約2〜4に調整した。得られた溶液をEtOAcで抽出した。有機抽出物を一緒にし、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して酸(1.76g)を得て、これを精製せずに次の工程に直接供した。2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸(1.76g、5.84mmol)の無水DMF(60ml)溶液にEt3N(2.5ml、7.0mmol)、HBTU(2.66g、7.01mmol)、HOBT(0.95g、7.01mmol)およびH-DAP(Boc)OMe塩酸塩(1.79g、7.01mmol)を加えた。混合物を室温で3時間攪拌し、ブライン(200ml)で希釈し、酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層を1:1飽和炭酸水素ナトリウム/ブラインおよびブラインで洗浄した後、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。粗残渣をヘキサン中40〜100% EtOAc勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物(2.66g、収率91%)を得た。MS m/e 501.9 (M+H+)。
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
Figure 0006182542
(S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(2.66g, 5.30mmol)のMeOH(10ml)溶液にジオキサン中4.0M HCl(20mL)を加えた。1時間後、混合物を濃縮し、MeOHと共沸した。生成物をエーテルでトリチュレートし、濾過し、エーテルで洗浄して標記化合物(2.16g、収率93%)を得た。MS m/e 401.9 (M+H+)。
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩; LFA-1リガンド1の調製
Figure 0006182542
LiOH水溶液(水2mL中13mg、0.57mmol)にS)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(50mg、0.114mmol)を加え、得られた懸濁液を室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N塩酸で中和し、凍結乾燥させた。この材料をさらに精製せず次の工程に使用した。
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
アセトン(10mL)とDMF(10mL)との混合物中で安息香酸3-ヒドロキシメチル(500mg、3.29mmol)、(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(861mg、1.1当量)および炭酸カリウム(2.3g、5当量)を一緒にした。反応混合物を75℃で終夜攪拌した。不溶性材料を濾過し、廃棄し、濾液を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物900mgを得た。HRMS m/e 332.1466 (M+Na)+
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸の調製
Figure 0006182542
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸メチルエステル(900mg)のメタノール(3mL)溶液にLiOH(334mg、5当量)の水(3mL)溶液を加え、得られた反応混合物を45℃で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N HClでpH 3に酸性化し、直ちに酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次にそれを減圧濃縮し、酢酸エチルから結晶化させて標記化合物600mgを得た。
HRMS m/e 318.1311 (M+Na)+
(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸(57mg、0.193mmol)のDMF(1mL)溶液にHBTU(78mg、1.05当量)、DIEA(172μL、5当量)および(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(100mg、0.194mmol)を加えた。得られた反応混合物を室温で4時間攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。メタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物97mgを得た。
HRMS m/e 679.3447 (M+H)+
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
Figure 0006182542
塩化トリメチルシリル(177μL)をメタノール(2mL)に加え、得られた混合物を室温で5分間攪拌した。次にそれを(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(94.6mg、0.139mmol)に加え、得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。次にそれを減圧濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物84.8mgを得た。HRMS m/e 579.2925 (M+H)+
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸LAF-1リガンド2の調製
Figure 0006182542
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(82.6mg、0.134mmol)をメタノール(1mL)および2M NaOH(336μL、5当量)に溶解させ、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 565.5 (M+H)+
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
アセトン(50mL)とDMF(50mL)との混合物中で安息香酸3,5-ジヒドロキシメチル(1.8g、10.7mmol)、(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(1.3g、5.46mmol)および炭酸カリウム(1.5g、10.8mmol)を一緒にした。反応混合物を75℃で終夜攪拌した。粗反応混合物を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物462mgを得た。HRMS m/e 348.1417 (M+Na)+
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸の調製
Figure 0006182542
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸メチルエステル(1.2g、3.69mmol)の2M NaOH(9.2mL、5当量)溶液に水(20mL)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N HClで中和し、直ちに酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次にそれを減圧濃縮して標記化合物1.0gを得た。MS m/e 211.8 (M+H-Boc)+
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルの調製
Figure 0006182542
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸(500mg、1.606mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(185mg、1当量)のTHF(20mL)中冷却溶液にDCC(332mg、1当量)を加えた。1時間後、冷却浴を取り外した。不溶性材料を濾過し、廃棄した。濾液を減圧濃縮し、粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物602mgを得た。HRMS m/e 431.1426 (M+Na)+
(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(476.4mg、0.924mmol)のDMF(5mL)溶液にDIEA(321μL、3当量)および3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(377mg、1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物301mgを得た。
HRMS m/e 695.3395 (M+H)+
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
Figure 0006182542
塩化トリメチルシリル(548μL)をメタノール(5mL)に加え、得られた溶液を室温で1分間攪拌した。次に(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(299.6mg、0.431mmol)を加え、室温での攪拌を終夜続けた。メタノールを減圧除去し、残渣をジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物272mgを得た。HRMS m/e 595.2875 (M+H)+
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; LFA-1リガンド3の調製
Figure 0006182542
水(1mL)とメタノール(1mL)との混合物に(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(100mg、0.158mmol)を溶解させた後、2N NaOHを加えた(400μL、5当量)。反応混合物を室温で3時間攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 581.1 (M+H)+
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸(50mg、0.138mmol)のトルエン(2mL)溶液に塩化チオニル(50μL、0.69mmol)を加えた。得られた溶液を2時間還流させた。次に塩化チオニルおよびトルエンを減圧除去した。油状残渣を塩化メチレン(3mL)に再溶解させ、0℃に冷却した。次にDIEA(72μL、0.414mmol)および(S)-3-(4-アミノ-フェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(43mg、0.145mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物87mgを得た。HRMS m/e 661.2237 (M+Na)+
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(84.7mg、0.132mmol)のTHF(1mL)溶液にTBAF(THF中1M溶液199μL)を加え、得られた混合物を室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチルに再溶解後に残渣を水およびブラインで洗浄し、次に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物50.3mgを得た。HRMS m/e 505.0903 (M+Na)+
(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
Figure 0006182542
TMSCl(1.4mL、11.3mmol)のMeOH(15mL)溶液に(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(548mg、1.13mmol)を加え、得られた混合物を室温で終夜攪拌した。粗混合物を減圧濃縮し、残渣をジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物379mgを得た。HRMS m/e 383.0561 (M+H)+
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
2-クロロ-N-(3-ヒドロキシ-ベンジル)-テレフタルアミド酸メチルエステルの調製は特許WO 01/58853号に記載されている。2-クロロ-N-(3-ヒドロキシ-ベンジル)-テレフタルアミド酸メチルエステル(4.0g、12.54mmol)、TBDMSCl(2.3g、15.0mmol)およびイミダゾール(1.9g、27.6mmol)をDMF(80mL)に溶解させ、室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物5.0gを得た。MS m/e 433.9 (M+H)+
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸の調製
Figure 0006182542
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸メチルエステル(4.9g、11.29mmol)の1,2-ジクロロエタン(80mL)溶液に水酸化トリメチルスズ(20.4g、112.9mmol)を加え、得られた反応混合物を80℃で8時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させた。次にそれをKHSO4水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、シリカパッドを通じて濾過した。濾液を減圧濃縮して標記化合物4.0gを得た。HRMS m/e 420.1393 (M+H)+
(S)-2-{4-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジルカルバモイル]-2-クロロ-ベンゾイルアミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸(103mg、0.246mmol)のDMF(2mL)溶液にHBTU(103mg、0.271mmol)、DIEA(128μL、0.738mmol)および(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(103mg、0.246mmol)を加えた。得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物100mgを得た。HRMS m/e 784.1776 (M+H)+
(S)-3-{4-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステルの調製
Figure 0006182542
(S)-2-{4-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジルカルバモイル]-2-クロロ-ベンゾイルアミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(91.5mg、0.116mmol)のアセトン(1mL)とDMF(1mL)との混合物中溶液に炭酸カリウム(48mg、3当量)および(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(33mg、1.2当量)を加えた。得られた反応混合物を75℃で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物76.5mgを得た。HRMS m/e 827.2016 (M+H)+
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}--[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
Figure 0006182542
塩化トリメチルシリル(100μL、10当量)をメタノール(2mL)に加えた。5分後、得られた溶液を(S)-3-{4-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル(65.6mg、0.079mmol)に加え、温度で終夜攪拌した。粗反応混合物を濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物60.4mgを得た。HRMS m/e 727.1492 (M+H)+
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸; LFA-1リガンド4の調製
Figure 0006182542
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}--[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(55mg、0.072mmol)のメタノール(1mL)溶液に2M NaOH水溶液(178μL、5当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 713.0 (M+H)+
実施例1
LFA-1リガンド試薬1の調製
Figure 0006182542
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩(0.114mmol)のアセトニトリル(1mL)溶液、ならびにスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステル(58mg、0.114mmol)のDMSO 1mLおよびジイソプロピルエチルアミン(40μL、0.228mmol)溶液。両溶液を一緒にし、室温で30分間攪拌した。粗反応混合物を減圧濃縮し、SFCで精製して標記生成物51mgを得た。HRMS m/e 786.3665 (M+H)+
実施例2
LFA-1リガンド試薬2の調製
Figure 0006182542
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 984.4530 (M+Na)+
実施例3
LFA-1リガンド試薬3の調製
Figure 0006182542
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1138.5761 (M+H)+
実施例4
LFA-1リガンド試薬4の調製
Figure 0006182542
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸(0.196mmol)のDMSO(2mL)溶液にDIEA(102μL、3当量)およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステル(135mg、1当量)を加えた。得られた混合物を室温で1時間攪拌した。粗材料をHPLCで精製して標記化合物105mgを得た。
HRMS m/e 1287.4077 (M+H)+
実施例5
LFA-1リガンド試薬5の調製
Figure 0006182542
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステルを用いて、実施例4に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1111.3021 (M+H)+
実施例6
LFA-1リガンド試薬6の調製
Figure 0006182542
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを用いて、実施例4に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 732.2595 (M+2H)2+
実施例7
LFA-1リガンド試薬7の調製
Figure 0006182542
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸(0.131mmol)のDMSO(2mL)溶液にDIEA(46μL、2当量)および3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(78mg、1当量)を加えた。得られた混合物を室温で1時間攪拌した。粗材料をHPLCで精製して標記化合物114mgを得た。
HRMS m/e 1195.3511 (M+H)+
実施例8
LFA-1リガンド試薬8の調製
Figure 0006182542
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1139.5511 (M+H)+
実施例9
LFA-1リガンド試薬9の調製
Figure 0006182542
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1155.5448 (M+H)+
実施例10
LFA-1リガンド試薬10の調製
Figure 0006182542
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 979.4403 (M+H)+
フルオレセイン(FITC)標識標的化試薬の調製
標的化試薬は、標的化小分子に対する受容体を発現する細胞へのそれらの結合の追跡を試験するために有用であり得るフルオロフォアで誘導体化することができる。そのような分子は2つの方法の一方または両方で作製することができる。第一に、標的化マレイミドと2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタンとの反応を行うことが可能である。あるいは、インテグリンアンタゴニスト小分子標的化リガンドのワンポット反応を行うことが可能であり、2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン、ならびにスキーム17および18に示す二官能性PEG試薬を用いる。
方法a)の例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITCの調製
Figure 0006182542
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(37.5mg、0.03mmol)および2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン(FITC試薬)(15.6mg、0.036mml)のメタノール(5mL)中黄色懸濁液に過剰のDIPEA(38.7mg、52uL、0.3mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色懸濁液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLCを使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITC誘導体25mg(収率50%)を褐色固体として得た。
Figure 0006182542
方法b)の例
Figure 0006182542
工程1. シスタミン二塩酸塩(68mg、0.301mmol)およびDIEA(110μL、2.1当量)をDMF(10mL)に溶解させた後、5-および6-カルボキシフルオレセインの混合物であるNHS-フルオレセイン(300mg、0.634mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水で3回、ブラインで1回洗浄した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、少量のメタノールおよび酢酸エチルに再溶解させた後、ジエチルエーテルでトリチュレートしてフルオレセイン-シスタミン付加体140mgを明橙色固体として得た。
工程2. フルオレセイン-シスタミン付加体(80mg、0.092mmol)をメタノールおよび水の3:1混合物(4mL)に溶解させ、TCEP塩酸塩(80mg、3当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。生成物をHPLCで精製して生成物78mgを得た。LRMS (ESI) 435.0
フルオレセイン標識小分子-PEG結合体の調製
Figure 0006182542
一般的手順
リガンド(1当量)のDMSO溶液にDIEA(2当量)およびSM(PEG)4n(1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間攪拌した。次に、チオールハンドルを有するフルオレセイン(1当量)を加え、反応混合物をさらに10分間攪拌した。生成物をHPLCで精製した。
5'-チオール-siRNAオリゴヌクレオチドへの小分子インテグリン標的化リガンドの共有結合の手順
siRNAの調製
オリゴリボヌクレオチド合成
ABI 394合成機(Applied Biosystems)を10μmolスケールで使用する固相上でのホスホラミダイト技術に従ってオリゴリボヌクレオチドを合成した。配列：
センス鎖
Figure 0006182542
アンチセンス鎖
Figure 0006182542
対応するsiRNAはハウスキーピング遺伝子AHA1に対するものである。細孔制御ガラスでできた固体支持体(CPG、520Å、負荷75μmol/g、米国ペンシルベニア州アストンのPrime Synthesisから得た)上で合成を行った。定型的RNAホスホラミダイトである2'-O-メチルホスホラミダイト、および補助試薬をProligo(ドイツ・ハンブルク)から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した: (5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-N4-(アセチル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト。2'-O-メチルホスホラミダイトは定型的RNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル(100mM)に溶解させ、モレキュラーシーブ(3Å)を加えた。オリゴマーの5'-末端においてスルフヒドリルリンカーを生成させるために、Glen Research(米国バージニア州スターリング)からの1'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトリンカーである1-O-ジメトキシトリチル-ヘキシル-ジスルフィドを使用した。小分子の結合体化の前に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、以下参照)を使用してジスルフィドリンカーを還元した。Nu547フルオロフォアによる5'-末端標識のために、Thermo Fisher(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から得た対応するホスホラミダイトを使用した。5-エチルチオテトラゾール(ETT、アセトニトリル中500mM)をアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3-エトキシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オン(EDITH、スコットランド・ラナークシャーのLink Technologiesから得た)の無水アセトニトリル中100mM溶液を使用した。
支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護
固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、メタノール中メチルアミン(2M、Aldrich)によって45℃で180分間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな15mL管に移し、CPGをN-メチルピロリジン-2-オン(NMP、スイス・ブックス、Fluka)1200μLで洗浄した。洗浄液をメチルアミンのメタノール溶液と一緒にし、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF、ドイツ・カールスルーエ、Alfa Aesar)450μLを加えた。この混合物を65℃に150分間到達させた。室温に冷却後、NMP 0.75mLおよびエトキシトリメチルシラン(スイス・ブックス、Fluka)1.5mLを加えた。10分後、析出したオリゴリボヌクレオチドを遠心分離により収集し、上澄み液を廃棄し、固体を緩衝液A(以下参照)1mL中で再構成した。
オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴリボヌクレオチドを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上で分取22x250mm DNA Pac 100カラム(ドイツ・イトシュタイン、Dionex)を使用する強アニオン交換(SAX)HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM NaClO4、1mM EDTA、10mMトリス(pH 7.4)、6M尿素および20%アセトニトリルからなっていた。緩衝液Bは緩衝液A中に500mM NaClO4を有していた。流量4.5mL/分を使用した。260および280nmでのUVトレースを記録した。55分以内の20%B〜45%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
粗Nu547標識オリゴマーを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上でXTerra Prep MS C8 10x50mmカラム(ドイツ・エシュボルン、Waters)を使用するRP HPLCにより精製した。緩衝液Aは100mM酢酸トリエチルアンモニウム(オランダ・ファルケンスワールト、Biosolve)であり、緩衝液Bは緩衝液A中に50%アセトニトリルを含有していた。流量5mL/分を使用した。260、280および547nm(Nu547標識オリゴリボヌクレオチドの場合)でのUVトレースを記録した。58個のカラム体積(CV)以内の5%B〜60%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
最後に、精製オリゴマーを、Sephadex G-25(GE Healthcare)を含むカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。溶液の濃度を、UV光度計(ドイツ・クレーフェルト、Beckman Coulter)中、260nmでの吸光度測定により決定した。アニーリングまで、個々の鎖を-20℃で凍結溶液として貯蔵した。
小分子RNA結合体の調製
マレイミド官能基を備えた小分子を、チオエーテル結合を通じた共有結合により、RNAと結合体化させた。この化学反応を可能にするために、5'-ジスルフィドリンカーを含有するRNA約60mgを、TCEP(水中0.5M、Sigma Aldrichから得た)1mLを使用して水(5mL)中で対応するチオールに還元した。分析用アニオン交換HPLCが反応の完了を示した時点で(室温で約2時間)、RNAをエタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)30mLによって-20℃で終夜析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、引き続く小分子の結合体化に使用した。
典型的な結合体化反応において、RNA 10mgをリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH 7.0)2mLに溶解させた。この溶液にACN/NMP 1:1(v/v)中小分子(0.12mM)を5分かけて加えた。RP LC-ESI MSが入力RNAの消費を示した時点で、混合物を水(約10mL)で希釈し、エタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)約40mLを-20℃で終夜加えて、結合体化されたRNAを析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、水に溶解させ、必要であれば上記に示す手順に従ってアニオン交換HPLCで精製した。結合体が十分に純粋である場合、反応混合物をサイズ排除カラム(Sephadex G-25、GE Healthcare)を通じて濾過した。
siRNAを生成させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルのRNA溶液を組み合わせることで相補鎖をアニールした。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8)で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。表3: siRNA配列情報；小文字: 2'-OMeヌクレオチド；s: ホスホロチオエート結合；dT: デオキシチミジン；(C6SSC6): C-6ジスルフィドリンカー；(Cy5): シアニン5色素。
sLFA-1/ICAM-1 ELISA相互作用およびMac-1/ICAM-1相互作用に対する標的化分子の効果を評価するために以下のアッセイを行った。
二価カチオン緩衝液(1mM MnCI2、0.14M NaCl、20mM HEPES pH 7.2)中2.0ug/mlのsLFA-1またはMac-1受容体溶液50μl/ウェルによって、プレートを4℃で終夜コーティングした。各ウェルにブロッキング緩衝液(二価カチオン緩衝液中1% BSA)250μlを加え、37℃で1時間置いた。プレートを洗浄緩衝液(TBS/0.05% Tween-20/1mM MnCl2)で3回洗浄した。試験化合物をDMSOに可溶化した。一連の1:3希釈を行って濃度範囲0.45nM〜3uMとした。結合緩衝液(二価カチオン緩衝液中0.5% BSA)/1% DMSO 50μlおよび試験溶液50μlを適切なウェルに加え、1時間インキュベートした。5dICAM-Fc(27ng/ml)50μlを適切なウェルに加え、結合緩衝液50μlを非特異的結合ウェルに加え、2時間インキュベートし、洗浄した。1:4000 HRP-ヤギ抗huIgG 100μlを各ウェルに加え、1時間インキュベートし、洗浄した。1:1 TMB溶液100μlを各ウェルに加え、室温で20分間発色させた。H3PO4 100μlを各ウェルに加えることで発色を停止させた。吸光度を450nmで測定した。これらの結果を以下の表4および表5に示す。
対照化合物(142および143)のIC50はそれぞれ約37nMおよび11nMであると決定された。おそらく、細胞のLFA-1受容体は対照化合物に結合または会合した。
Figure 0006182542
標的化送達のための、FITCフルオロフォアおよびsiRNAに共有結合により連結されたインテグリンアンタゴニストの小分子誘導体の細胞透過性および局在の証拠
手順
成長培地(10% FBSを有するRPMI 1640)中で、AML MV4-11細胞を二本鎖-27(500nM)と共に37℃で1時間インキュベートした。VLA-4非依存性結合を決定するために、VLA-4依存性結合をブロッキングする1つの条件に140(10μM)を含めた。インキュベーション後、細胞をD-PBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。ImageStreamx(シアトル、Aminis Corporation)を使用するイメージングフローサイトメトリーによってsiRNAの取り込みを分析した。結果を表Aおよび図1〜4に示す。
（表Ａ）
Figure 0006182542
細胞系におけるAHA1 mRNAをノックダウンするための、5'-センス鎖を修飾したsiRNAのアッセイ
材料および方法
Figure 0006182542
リバーストランスフェクション: DharmaFect-1トランスフェクション試薬を0.15μl/ウェルで使用して、明記されたsiRNAを最終濃度50nMでH1299細胞にトランスフェクションした。次に、細胞を96ウェルプレートに5000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。
siRNAによるノックダウンの有効性を、ベンダーが報告した通りに分岐DNAアッセイによって測定した。そのようなノックダウンの結果を図5に示す。相対的な細胞生存率を、同一ウェルにおけるGAPDHの絶対発現量によって評価した(図6)。
反対の記述がない限り、実施例中のすべての化合物は上記のように調製し、特徴づけた。本明細書において引用されるすべての特許および刊行物は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (21)

  1. 式I：
    Figure 0006182542
    の化合物または薬学的に許容されるその塩：
    式中、nは1〜24であり、かつ
    R1は、
    (1) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物；
    (2) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物；および
    (3) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、化合物
    からなる群より選択され、
    R2は、
    (1) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物；
    (2) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物；
    (3) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物；および
    (4) 式：
    Figure 0006182542
    の化合物であって、式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつXは硫黄または式：
    Figure 0006182542
    の化合物のいずれかを表す、化合物
    からなる群より選択される。
  2. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項1に記載の化合物。
  3. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項1に記載の化合物。
  4. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、請求項1に記載の化合物。
  5. QがHである、請求項4に記載の化合物。
  6. QがOHである、請求項4に記載の化合物。
  7. R2が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
  8. R2が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
  9. R2が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
  10. Xが硫黄を表す、請求項1に記載の化合物。
  11. R3がsiRNA分子である、請求項1または10のいずれか一項に記載の化合物。
  12. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項7〜11のいずれか一項に記載の化合物。
  13. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物である、請求項7〜11のいずれか一項に記載の化合物。
  14. R1が式：
    Figure 0006182542
    の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、請求項7〜11のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
    (S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
    (S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸。
  16. 以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
    (S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
    (S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8。
  17. 以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
    S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
    S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸。
  18. 以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
    S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
    (S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
  19. 以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
    (S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; および
    (S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
  20. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  21. 炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の化合物の使用。
JP2014553706A 2012-01-27 2013-01-24 Ｌｆａ−１を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体 Expired - Fee Related JP6182542B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261591297P 2012-01-27 2012-01-27
US61/591,297 2012-01-27
US201261678673P 2012-08-02 2012-08-02
US61/678,673 2012-08-02
PCT/EP2013/051273 WO2013110679A1 (en) 2012-01-27 2013-01-24 Integrin antagonist conjugates for targeted delivery to cells expressing lfa-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2015508055A JP2015508055A (ja) 2015-03-16
JP6182542B2 true JP6182542B2 (ja) 2017-08-16

Family

ID=47605526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014553706A Expired - Fee Related JP6182542B2 (ja) 2012-01-27 2013-01-24 Ｌｆａ−１を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20130197059A1 (ja)
EP (1) EP2806897B1 (ja)
JP (1) JP6182542B2 (ja)
KR (1) KR20140121453A (ja)
CN (1) CN104185478B (ja)
BR (1) BR112014017517A2 (ja)
CA (1) CA2857127A1 (ja)
DK (1) DK2806897T3 (ja)
HK (1) HK1202425A1 (ja)
MX (1) MX2014008590A (ja)
RU (1) RU2624732C2 (ja)
WO (1) WO2013110679A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140121453A (ko) * 2012-01-27 2014-10-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｌｆａ-1 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트
US9447035B2 (en) * 2012-01-27 2016-09-20 Hoffmann-La Roche Inc. Integrin antagonist conjugates for targeted delivery to cells expressing VLA-4
CN111825622A (zh) * 2020-07-10 2020-10-27 西华大学 一种氧化脱氢芳构化制备2-嘧啶酮衍生物的方法
CN115028828B (zh) * 2022-07-19 2023-09-15 西安超磁纳米生物科技有限公司 一种可靶向肝细胞的聚乙二醇衍生物及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1403247A1 (en) * 1997-08-22 2004-03-31 F.Hoffmann-La Roche Ag N-Alkanoylphenylalanine derivatives
NZ502813A (en) * 1997-08-22 2002-10-25 F N-aroylphenylalanine derivatives as inhibitors of the interaction between a4 containing integrins and VCAM-1
US6229011B1 (en) * 1997-08-22 2001-05-08 Hoffman-La Roche Inc. N-aroylphenylalanine derivative VCAM-1 inhibitors
US6331640B1 (en) * 1998-10-13 2001-12-18 Hoffmann-La Roche Inc. Diaminopropionic acid derivatives
US6515124B2 (en) 2000-02-09 2003-02-04 Hoffman-La Roche Inc. Dehydroamino acids
US6774116B2 (en) * 2001-04-17 2004-08-10 Cryolife, Inc. Prodrugs via acylation with cinnamate
ES2614080T3 (es) * 2005-05-17 2017-05-29 Sarcode Bioscience Inc. Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos oculares
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
WO2012112563A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Magic Technologies, Inc. Methods and compositions for the target-localized anchoring of detectable label
US20120270875A1 (en) * 2011-03-16 2012-10-25 Paul Gillespie Pyrimidine amide compounds
KR20140121453A (ko) * 2012-01-27 2014-10-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｌｆａ-1 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트
KR20150009952A (ko) * 2012-01-27 2015-01-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체

Also Published As

Publication number Publication date
CA2857127A1 (en) 2013-08-01
DK2806897T3 (en) 2017-10-16
CN104185478A (zh) 2014-12-03
BR112014017517A2 (pt) 2017-06-13
WO2013110679A1 (en) 2013-08-01
CN104185478B (zh) 2016-10-12
US20150065534A1 (en) 2015-03-05
EP2806897A1 (en) 2014-12-03
EP2806897B1 (en) 2017-08-02
US9650363B2 (en) 2017-05-16
MX2014008590A (es) 2015-03-03
HK1202425A1 (en) 2015-10-02
US20130197059A1 (en) 2013-08-01
RU2624732C2 (ru) 2017-07-06
RU2014132837A (ru) 2016-03-20
KR20140121453A (ko) 2014-10-15
JP2015508055A (ja) 2015-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6316209B2 (ja) αＶβ３を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体
JP6259448B2 (ja) Ｔｅｔｒａｇａｌｎａｃおよびペプチドを含む新規なコンジュゲートと、オリゴヌクレオチドの送達方法
US9968686B2 (en) Antisense oligonucleotides with improved pharmacokinetic properties
TW201808342A (zh) 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
JP6182542B2 (ja) Ｌｆａ−１を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体
JP6159740B2 (ja) Ｖｌａ−４を発現する細胞への標的化送達のためのインテグリンアンタゴニスト結合体
KR20140120316A (ko) 표적화된 전달을 위한 소분자 인테그린 안타고니스트와 공유 결합된 키토산
WO2019089765A1 (en) Integrin ligands and uses thereof
US20130079383A1 (en) Lipid Compounds Targeting VLA-4
US9447035B2 (en) Integrin antagonist conjugates for targeted delivery to cells expressing VLA-4

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20150318

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20151130

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20160728

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160804

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20161024

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170322

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170620

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170705

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170724

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6182542

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees