CN104017893B - 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法 - Google Patents

一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法 Download PDF

Info

Publication number
CN104017893B
CN104017893B CN201410281898.4A CN201410281898A CN104017893B CN 104017893 B CN104017893 B CN 104017893B CN 201410281898 A CN201410281898 A CN 201410281898A CN 104017893 B CN104017893 B CN 104017893B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
hiv
oral carcinoma
infect
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410281898.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104017893A (zh
Inventor
王伟
王子剑
马丽红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou University
Original Assignee
Fuzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou University filed Critical Fuzhou University
Priority to CN201410281898.4A priority Critical patent/CN104017893B/zh
Publication of CN104017893A publication Critical patent/CN104017893A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104017893B publication Critical patent/CN104017893B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法，所述探针序列为5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’和5’-GGAGAAGTTTTTGAAGACGGC？TGA-3’。目前对HIV和口腔癌感染疾病的检测方法只能做到一种方法检测一种疾病，因而有较大的局限性，而且基于蛋白质检测的方法对样本的要求很高，要求样品新鲜，且要对身体不同部位进行采样。很多疾病是共生，而且有不少疾病是由于人体内的DNA产生改变而致病的，所以开发一种基于DNA检测技术的对这两种疾病同时检测的方法是有重大意义的。

Description

一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病，它是目前为止难以治愈的对人类健康威胁最大的传染性疾病。口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤之总称，大部分属于鳞状上皮细胞癌，即所谓的黏膜发生变异。在临床实践中口腔癌包括牙龈癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症等。口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。这两种疾病的产生都很人体内的基因变化有关，所以只要通过检测人体内这两种相关疾病的基因存在就可以对疾病作出诊断。
目前对HIV感染的检测方法主要是建立在对蛋白质的检测上，常见的方法有，抗体检测、免疫荧光-试验（IFA）、ELISA试剂检测和颗粒凝集实验法。所有的这些方法都是基于蛋白质为溶质的检测方法，它们有一个共同的缺点就是必须使用新鲜的样品，时间长的，变异的样品将无法检出，这就限制了这些方法在更大范围内的使用。此外抗体检测法周期很长；免疫荧光-试验（IFA）需要昂贵的荧光检测仪和有经验的专业人员来观察评判结果；ELISA试剂检测要求样本要新鲜；颗粒凝集实验特异性较差。
口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤之总称，是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。目前对该疾病的诊断主要是通过目视法进行诊断，这对早期的口腔癌诊断是不利的。
目前对这些疾病的检测方法只能做到一种方法检测一种疾病，因而有较大的局限性，而且基于蛋白质检测的方法对样本的要求很高，要求样品新鲜，且要对身体不同部位进行采样。很多疾病是共生，而且有不少疾病是由于人体内的DNA产生改变而致病的，所以开发一种基于DNA检测技术的对这两种疾病同时检测的方法是有重大意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法，本发明是基于DNA检测技术与分离的同时诊断方法，解决了以下几个技术问题：1、DNA具有很强的稳定性，所以对样品的要求不高，可以使用采样时间很长的，乃至变质的样品进行检测；2、对于共生的这两种疾病，只要采集人体口腔粘膜的细胞就可以进行同时检测，不必抽血，不必从人体不同部位同时采集样本进行检测，采样简单。3、可以同时对两种疾病进行同时检测，检测时间可以缩短到两小时之内。4、检测的灵敏度极高，就算只有少量的样品也能够很灵敏地检测出致病DNA。5、经过PCR扩增和探针双重筛选，具有极强的特异性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针，所述的DNA探针序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’和5’-GGAGAAGTTTTTGAAGACGGCTGA-3’。
在所述探针上面标记上羧基荧光素，使之具有荧光信号。
一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）样品处理：用棉签从人体口腔内无痛刮取粘膜细胞，置于试管，加入水，反复挤压棉团让细胞脱落，离心，去除上清液加TE溶液，煮沸，冰浴后，震荡离心，取上清液进行PCR扩增特定的DNA片段；
（2）设计两段分别与步骤（1）中已知的HIV和口腔癌DNA片段互补的DNA，在这两段DNA上面标记上羧基荧光素使之具有荧光信号，这两段DNA为HIV和口腔癌的DNA探针；
（3）采用毛细管胶束电动色谱法，首先对所述DNA探针进行分离，经过条件优化以后，两条HIV和口腔癌的探针峰得到分离，分别标记为1和2；若同时感染这两种疾病，当把探针加入经过以上处理过的样品中以后，HIV及口腔癌的DNA探针就会特异性地和PCR扩增后HIV及口腔癌的DNA互补片段产生杂化并生成双链DNA，这样溶液中就多了两个会发光的样品，通过色谱图，根据后面出现的双链杂化峰判定是否有感染。
步骤（1）中扩增的片段序列必须要包含HIV和口腔癌的DNA片段各一种；且所述的包含HIV和口腔癌的DNA片段的序列分别为：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3’和5’-TCAGCCGTCTTCAAAAACTTCTCC-3’。
一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针用于同时诊断HIV和口腔癌感染上的应用。
本发明的优点在于：
1、本方法可以用于HIV和口腔癌早期感染的快速同时诊断，诊断时间迅速，如果不包括PCR扩增时间，可以在10分钟内完成两种疾病的同时诊断。如果包括PCR扩增时间，诊断时间也不会超过两个小时。
2、检测的灵敏度高，对HIV和口腔癌的检测限可以达到5和7nmol/L。
3、相比于蛋白质检测法，本方法对样品的要求不高，过期的样品，同样可以通过PCR扩增后进行检测，具有极高的灵活性。
4、特异性强，经过PCR扩增和探针结合，经历了双重筛选，所以出现假阳性的概率极低。
5、取样简单，使用人体口腔粘膜的细胞就可进行检测诊断，整个过程，快速无痛苦。
附图说明
图1DNA特异性杂交电泳图，其中1为HIV的DNA探针峰；2为口腔癌的DNA探针峰；3为HIV的DNA探针与目标DNA杂化双链峰；4为口腔癌的DNA探针与目标DNA杂化双链峰。
具体实施方式
实施例1
1、样品的取得和处理
用棉签从人体口腔内无痛刮取粘膜细胞，置于试管，加入水，反复挤压棉团让细胞脱落。离心，去除上清液加TE溶液，煮沸，冰浴后，震荡离心，取上清液进行PCR扩增特定的DNA片段，其中包含HIV和口腔癌的DNA片段各一种，所以这两种DNA片段的序列是已知的。且所述的包含HIV和口腔癌的DNA片段的序列分别为：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3’和5’-TCAGCCGTCTTCAAAAACTTCTCC-3’。
2、DNA荧光探针：设计两段分别与已知的HIV和口腔癌DNA片段互补的DNA，在这两段DNA上面标记上FAM使之具有荧光信号，称这两段DNA为HIV和口腔癌的DNA荧光探针。所述的DNA探针序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’和5’-GGAGAAGTTTTTGAAGACGGCTGA-3’。
采用毛细管胶束电动色谱法，首先对这一对DNA荧光探针进行分离，见图1a,经过条件优化以后，这两条HIV和口腔癌的探针峰可以得到分离，分别标记为1和2。
患者的样品中有口腔癌细胞，当把这一对探针加入经过以上处理过的样品中以后，口腔癌DNA探针就会特异性地和PCR扩增后口腔癌DNA互补片段产生杂化并生成双链DNA，这样溶液中就多了一个会发光的样品。在分离走样时会发现第2号口腔癌DNA探针的样品峰因为与目标DNA结合，峰变矮，同时在后面出现了一个4号峰，这个4号峰就是探针与目标杂化后产生的双链DNA，见图1b。出现了这种情况就说明患者样本中含有口腔癌细胞。
同理，患者的样品中有HIV感染的细胞，当把这一对探针加入经过以上处理过的样品中以后，HIV的DNA探针就会特异性地和PCR扩增后HIV的DNA互补片段产生杂化并生成双链DNA，这样溶液中就多了一个会发光的样品。在分离走样时会发现第1号HIV的DNA探针样品峰因为与目标DNA结合，峰变矮，同时在后面出现了一个3号峰，这个3号峰就是探针与目标杂化后产生的双链DNA，见图1c。出现了这种情况就说明患者样本中含有HIV感染的细胞。
患者同时患有这两种疾病，那么这两个探针会同时与样品中的目标DNA结合导致两个探针峰都降低，同时在分离过程中，后面会出现3、4两个探针与目标结合的双链DNA样品峰，见图1d。据此就可以判定，患者感染了两种疾病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福州大学
<120>一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针法
<130>4
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
actgctagagattttccacat21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggagaagtttttgaagacggctga24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgtggaaaatctctagcagt21
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcagccgtcttcaaaaacttctcc24

Claims (3)

1.一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针，其特征在于：所述的DNA探针序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’和5’-GGAGAAGTTTTTGAAGACGGCTGA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针，其特征在于：所述探针上面标记上羧基荧光素，使之具有荧光信号。
3.一种如权利要求1所述的一种同时诊断HIV和口腔癌感染的毛细管电泳分离DNA探针用于制备同时诊断HIV和口腔癌感染试剂盒上的应用。
CN201410281898.4A 2014-06-23 2014-06-23 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法 Expired - Fee Related CN104017893B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410281898.4A CN104017893B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410281898.4A CN104017893B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104017893A CN104017893A (zh) 2014-09-03
CN104017893B true CN104017893B (zh) 2015-11-18

Family

ID=51434887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410281898.4A Expired - Fee Related CN104017893B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017893B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101993917A (zh) * 2009-08-10 2011-03-30 芮屈生物技术（上海）有限公司 一种cdc2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101993917A (zh) * 2009-08-10 2011-03-30 芮屈生物技术（上海）有限公司 一种cdc2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA detection assay based on fluorescence quenching of rhodamine B by gold nanoparticles: The optical mechanisms;Pylaev et al.;《Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer》;20130501;第131卷;权利要求1、2 *
Quadratic recycling amplification for label-free and sensitive visual detection of HIV DNA;Zhou et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20131216;第55卷;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017893A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6609055B2 (ja) 腫瘍分子の検出／診断試薬
CN101899534B (zh) 用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒及其检测方法
JP2010046042A (ja) 特定遺伝子の検出方法
CN103789451A (zh) 一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒
CN103695532B (zh) 广州管圆线虫病早期检测的分子标记物及引物
CN107475389B (zh) 用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法
CN104630353A (zh) 一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒
CN110106285A (zh) 一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法
CN108330215A (zh) 一种应用rpa技术检测hpv高危16型的引物及探针组合物
Bala et al. Identification of strain diversity and phylogenetic analysis based on two major essential proteins of Orf viruses isolated from several clinical cases reported in Malaysia
WO2019024341A1 (zh) 一种体液游离dna的文库构建方法及其应用
JP2016531596A (ja) 循環している癌のバイオマーカー及びその使用
CN104017893B (zh) 一种同时诊断hiv和口腔癌感染的毛细管电泳分离dna探针法
WO2017092483A1 (zh) 通过检测游离核酸诊断结核病的试剂盒及其应用
CN104561375A (zh) 一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN103667425A (zh) 检测结核菌的方法及试剂盒
CN104278024B (zh) 用于鉴定人类腺病毒55型的引物组合物以及它们的应用
Van Enschot et al. Sarcoidosis following Mycobacterium tuberculosis infection: coincidence or consequence
CN105132557B (zh) 一种用于诊断肝癌的唾液检测试剂及试剂盒
CN105087794B (zh) 一种检测结核病的试剂盒
CN105821160A (zh) 一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106222304A (zh) 一种同时检测五种呼吸道病毒的rt‑pcr方法所用的五对上下游引物
CN115747333B (zh) 一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统及其应用
CN111440872A (zh) 一种用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒及其应用
KR102306941B1 (ko) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 기반 코로나바이러스 감염증－１９ 진단

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20151118

Termination date: 20180623