JP2016531596A - 循環している癌のバイオマーカー及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明に係るキメラ核酸は、腫瘍をモニタリングするために、循環システムから得られる。核酸は、宿主ゲノムに由来する部分的な配列及び非−宿主ゲノムに由来する部分的な配列を含む。宿主ゲノムに由来する部分的な配列及び非−宿主ゲノムに由来する部分的な配列は、キメラ挿入部位を形成する。キメラ挿入部位は、無細胞核酸から得られ、疾患の状態を指す。

Description

本願は、２０１３年１０月１８日に出願された米国仮出願番号６１／８９２７９６号明細書の利益を主張し、かかる米国特許出願の記載内容を参照により本明細書に組み込む。

本発明は、一般的に、被験体の循環核酸をバイオマーカーとして、被験体の疾患の進行を識別し且つモニタリングすることに関するものである。

腫瘍及び癌の根本の原因は、遺伝又は環境因子によって引き起こされる遺伝子変異であると考えられる。この遺伝子変異が誤って修復されるか又は修復不可能の場合、これらの遺伝子変異は累積されて最終的には正常細胞を悪性細胞に変化させる。腫瘍／癌は、特有の遺伝子変異のスペクトルを発展させるので、これらの変異をモニタリングすることで、腫瘍／癌に対する情報を提供することができる。

正常細胞及び腫瘍／癌細胞は、何れも、死細胞の染色体が断片化され、体液、例えば血液循環に放出されるという代謝回転のサイクルを経る。これら断片の配列の決定は、癌患者の血液又は血清中の循環無細胞ＤＮＡが、元の腫瘍／癌からの遺伝子変異を持っていることを示す。この発見は循環無細胞ＤＮＡが利用できる可能があることを意味する。

特異的な遺伝子変異を含む宿主のゲノム配列を、全ての循環無細胞ＤＮＡから腫瘍／癌細胞−特異的核酸配列を捕捉するためのプローブとして使用する従来の技術は、腫瘍が十分に大きく、大量の（全ての循環無細胞ＤＮＡの５％より多い）腫瘍−特異的核酸配列が循環へと放出される、進行癌で有効である。循環無細胞ＤＮＡの含有量は限定されているので（血液の総量の０．０１％〜１％）、循環無細胞ＤＮＡは、たとえ進行癌でも検出するのは難しい。つまり、早期癌又は中間段階の癌において、循環している癌／腫瘍ＤＮＡの割合が低過ぎるため、確実に検出することができない。また、癌／腫瘍−特異的遺伝子変異は、通常、単一塩基変異、小さな遺伝子断片の挿入又は欠失であり、これらの変異は、非腫瘍の体細胞から放出され、このような変異を持たない核酸配列から分離されるのは難しい。言い換えれば、全ての循環ＤＮＡが、変異した遺伝情報を含有するわけではなく、大部分の循環ＤＮＡは、宿主ゲノムから変異しない。

本発明の多くの態様は、以下の図面を参照することでさらに詳細に理解できる。各図面の構成要素は、本来のサイズの比率に基づいて描かれたものではなく、本発明の内容を明確に説明するために描かれたものである。

図１は、ウイルス−感染細胞の一般的な進行を示す図である。 図２は、ターゲット循環無細胞ＤＮＡを獲得する例示的な方法を示す図である。 図３は、ウイルス−宿主挿入部位の特異性を示す図である。 図４は、腫瘍の切除前と切除後の特定のウイルス−宿主挿入部位の量の変化を示す図である。

１．イントロダクション
特定のヒトの腫瘍／癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の慢性感染に起因する。これらの癌は、ゲノムに遺伝子変異を累積する。該遺伝子変異の中で、特徴的な変異は、通常、感染の初期段階で発生する、ウイルスゲノムの宿主ゲノムに組み込まれることである。これらの変異は、他の体細胞の変異と重複して発生し続け、最終的には細胞を腫瘍／癌細胞に換える。

前述したように、ＨＣＣ細胞が代謝回転する時、遺伝子の情報を含む断片が体液に放出される。循環システム、例えば血液中に自由に遊離しているＤＮＡである循環ＤＮＡは、通常ＤＮＡ断片を含む。これらの断片は、宿主ゲノム、ウイルスゲノム及び／又はウイルス組み込み部位からの遺伝子断片を含み、例として、ウイルス−宿主挿入部位の遺伝子配列が挙げられる。

感染した細胞、例えばＨＢＶに感染した患者の肝細胞は癌化すると増殖を始める。これに伴い感染した細胞によってもたらされるウイルス組み込みの量も増加する。従って、ウイルス組み込みの量は、通常、腫瘍／癌細胞のサイズに比例する。また、ウイルスＤＮＡは異なる位置で宿主ゲノムに組み込まれるので、各腫瘍／癌細胞は、ウイルス組み込み部位の特有のスペクトルを有する。この発見は、ウイルスの組み込み部位及び／又はウイルス−宿主挿入部位が、腫瘍／癌細胞特有のものであり、腫瘍／癌の進行具合の診断のためのバイオマーカーとして使用できることを指摘している。

図１は、細胞中における癌の進行プロセスを示している。図１を参照すると、被験体の肝細胞１０は、同じ宿主ゲノムを含む。再度図１を参照すると、肝細胞１０は、複数の肝細胞Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２及びＥ２を含む。ＨＢＶ１１に感染する過程において、ＨＢＶ１１は、そのウイルスゲノム１３を感染した肝細胞の宿主ゲノムに組み込むことができる。ＨＢＶのゲノム１３の一部は、宿主ゲノムに組み込まれて、ウイルス組み込み部位が異なり、組み込まれたウイルス遺伝子配列も異なる、感染した肝細胞が生じる。図１に示したように、ウイルス配列Ａ１は、細胞Ａ２に組み込まれ、ウイルス配列Ｂ１は、細胞Ｂ２に組み込まれ、ウイルス配列Ｃ１は、細胞Ｃ２に組み込まれ、ウイルス配列Ｄ１は、細胞Ｄ２に組み込まれ、ウイルス配列Ｅ１は、細胞Ｅ２に組み込まれる。ＨＢＶのＤＮＡ配列の組み込みは、宿主細胞ゲノムにおいてウイルス−宿主挿入部位を形成する。感染した細胞Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２及びＥ２は、時間と共に増殖し、発展し、さらに多くの遺伝子変異を累積する。変異した又は変異していないにかかわらず宿主及びウイルスの配列は、細胞の増殖、安定状態又は死滅へと導く。再度図１を参照すると、細胞Ａ２は、悪性への転換を引き起こし、増殖及びクローン拡大に対する誘発をもたらす変異を有する。注意すべきは、ウイルス−宿主挿入部位は、悪性への転換を引き起こすかもしれず、又は増殖をもたらさない重要でない組み込みであるかもしれない。

図１を更に参照すると、感染した細胞Ａ２は増殖し、細胞の数が増加し、悪性の細胞に転換する。その後、癌細胞又は腫瘍細胞クラスターを形成する。細胞Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２及びＥ２は、悪性化せずに、少数の集団でい続けるか又は死滅する。感染した全ての細胞Ａ２は、宿主ゲノム、少なくとも一部のウイルスゲノム及びウイルス−宿主挿入部位を含む同じ遺伝情報をもつ。感染した細胞Ａ２が増殖した場合、細胞Ａ２の特異的なウイルス−宿主挿入部位は通常比例して増加する。同じウイルス−宿主挿入部位は、同じ癌細胞系統に存在し、癌を誘発する場合があるし、誘発しない場合もある。図１に示したように、癌性クローンは、素早い増殖及び代謝回転を経て、感染した細胞Ａ２のうちの一部は破裂し、死滅する。これら破裂し死滅した細胞Ａ２のＤＮＡ鎖１２は、循環システム又は体液、例えば血液中に放出される。これらＤＮＡ鎖１２は、断片化され、循環システムを介して自由に遊離し、血流中において循環無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の一部になる。本出願を参照すれば、本明細書に使用されている用語「循環している無細胞ＤＮＡ」、「循環無細胞ＤＮＡ」及び「ｃｔＤＮＡ」は、被験体又は患者の血流又は循環システムから得られるＤＮＡを指し、被験体又は患者の血流又は循環システムから得られた前記ＤＮＡは、実質的には他の細胞成分を含まないか又は他の細胞成分を本質的に全く含まないことは明確に理解されるであろう。ｃｔＤＮＡの一部は、後にマクロファージなどの機能細胞によって消化される又は除去される。一方で、特にｃｔＤＮＡが大量に存在する場合、ｃｔＤＮＡの一部は血液中に残る。循環システム又は体液におけるｃｔＤＮＡを検査する及び／又は検出することで、癌／腫瘍の進行情報を得ることができる。

２．方法
以下、本発明の実施方法について説明する。以下に説明する方法、材料及びプロセスは実施形態の一例に過ぎず、決して本発明の範囲を限定するものではないことに注意すべきである。

図２は、ターゲットｃｔＤＮＡを単離する図を示す。死滅した腫瘍／癌細胞に由来する循環ＤＮＡは、断片で血液中に放出される。前記ｃｔＤＮＡは、集められ、アダプター（ａｄａｐｔｏｒｓ）２１とライゲーションさせて、ｃｔＤＮＡ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを形成する。適当な手段を利用してｃｔＤＮＡを増幅させる。例として、アダプター２１の配列に相補的な、適量のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を利用する。好ましい増幅方法は、類似した又は同じ割合で全てのｃｔＤＮＡを増幅し、これにより、増幅されたｃｔＤＮＡは、血液中に存在するｃｔＤＮＡ量についての情報を提供することに注意すべきである。図２において、ウイルスゲノム由来の配列は、斜線により表示し、宿主ゲノム由来の配列は、黒色により表示している。増幅されたｃｔＤＮＡは、宿主ゲノム配列しか含まないｃｔＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ Ｄ）、ウイルスゲノムの配列しか含まないｃｔＤＮＡ（図示せず）及びウイルスゲノム配列と宿主ゲノム配列を同時に含む、即ちウイルス−宿主挿入部位２２を含むｃｔＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ Ａ、Ｂ、Ｃ）に分類される。好ましい方法に基づき、全てのｃｔＤＮＡをポリヌクレオチドプローブ２３（ウイルスゲノム配列に由来）と一緒にインキュベートして、ハイブリダイゼーションを行う。図２に示したプローブ２３は、類似しているように見えるが、配列が異なっていてもよい。再度図２を参照すると、ウイルスゲノム配列しか含まないｃｔＤＮＡ及び少なくとも一つのウイルス−宿主挿入部位を含むｃｔＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ Ａ、Ｂ、Ｃ）のみが、プローブ−ｃｔＤＮＡ複合体２４を形成する。これら複合体は、プローブとハイブリダイズしていないｃｔＤＮＡから単離される。ターゲットｃｔＤＮＡ、即ち、ウイルスゲノム配列しか含まないｃｔＤＮＡ及び少なくとも一つのウイルス−宿主挿入部位を備えるｃｔＤＮＡは、複合体から得られ分離され、ターゲットｃｔＤＮＡの配列が得られる。ウイルス感染の組織親和性及び特異性に基づいて、ターゲットｃｔＤＮＡの組織の由来が識別される。

２．１被験体
本発明を説明するために、ヒト被験体を試験に供する。コンピュータ断層撮影法から、被験体１に１２×１０×９（ｃｍ）の腫瘍があることがわかり、組織学的なレポートにより、被験体１が試験に供される時に、被験体１はレベルＩＩＩの肝細胞癌患者に認定された。コンピュータ断層撮影法から、被験体２に１８×１３．５×９（ｃｍ）の腫瘍があることがわかり、組織学的なレポートにより、被験体２はレベルＩＩＩの肝細胞癌患者に認定された。コンピュータ断層撮影法から、被験体３に８×７．５×７（ｃｍ）の腫瘍があることがわかり、組織学的なレポートによって、被験体３はレベルＩＩＩの肝細胞癌患者に認定された。被験体４は、２×２×２（ｃｍ）の腫瘍を持ち、レベルＩＩの肝細胞癌に認定された。被験体５は、２×２×２（ｃｍ）より小さい腫瘍を持つことがわかったが、実験に登録した際に、癌の進行の段階が特定されなかった及び／又は得られなかった。

２．２被験体のｃｔＤＮＡの獲得
各患者から複数の血液サンプルをそれぞれ採取する。毎回、血液を採血し、臨床的に適切な容器に集められる。必要があれば、後の分析のために適切な条件下で保存する。各血液サンプルは、遠心分離などの手段により処理されて血清を得る。市販のキットにより、例えば、Ｒｏｃｈｅ社のＭａｇＮａ Ｐｕｒｅ ＬＣ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標)によりｃｔＤＮＡが抽出される。腫瘍組織が得られ、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡも抽出される。

２．３プローブの提供
本実施形態において、ＨＢＶゲノム配列を持つポリヌクレオチドをプローブとして使用する。プローブは、合成されるか又はウイルスゲノムの断片から得てもよい。プローブの合成を以下に説明する。全ＨＢＶゲノム配列の情報は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から得られる。ポリヌクレオチドは、ＨＢＶゲノム配列に基づいて合成され、全てのＨＢＶゲノム配列をカバーする。ポリヌクレオチドは、市販のキット、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎ ＴａｒｇｅｔＳｅｑ Ｃｕｓｔｏｍ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（登録商標)により合成される。全てのポリヌクレオチドの長さは、約５０〜２００残基又は５０〜１２０残基である。プローブの合成後、各プローブは、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの末端で、標識化（例えば、ビオチン化）される。プローブのビオチン化は、市販のキット、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎ ＴａｒｇｅｔＳｅｑ Ｃｕｓｔｏｍ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（登録商標)などを利用して実施してよい。プローブは、その後、例えばビオチンを介して、ビーズに結合又は連結させる。

２．４アダプターとのライゲーション
被験体から得られるｃｔＤＮＡを比例的に増幅させるために、既知の配列を有するＤＮＡをｃｔＤＮＡの少なくとも１つの末端又は両方の末端に結合又はライゲーションさせる。ｃｔＤＮＡの少なくとも１つの末端又は両方の末端へのアダプターのライゲーションは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標)、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標)、又は他の同等の試薬を使用してよい。

２．５ターゲットｃｔＤＮＡの増幅
ｃｔＤＮＡをアダプターにライゲーションさせた後、被験体からのサンプル中の各ｃｔＤＮＡを増幅させる。例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標)又はＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標)を使用してよい。

２．６ターゲットｃｔＤＮＡの捕捉及び分離
被験体のｃｔＤＮＡサンプルは、ビオチン化プローブにより被覆されたビーズと混合してインキュベートし、ｃｔＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを行う。少なくとも一部のウイルス配列を持つｃｔＤＮＡは、プローブにおける相補的な配列にアニールして、ビーズ−プローブ−ｃｔＤＮＡ複合体を形成する。プローブに結合しないｃｔＤＮＡは、自由に遊離し、如何なる複合体も形成しない。ビーズ−プローブ−ｃｔＤＮＡ複合体は、遠心分離などの方法により非結合のｃｔＤＮＡから分離される。複合体が得られた後、ターゲットｃｔＤＮＡは、複合体から取り除かれて集められる。プローブとハイブリダイズした循環ＤＮＡの捕捉は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｒｇｅｔＳｅｑ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＆ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ又は同等の試薬を使用して実施してもよい。

２．７ターゲットｃｔＤＮＡ配列決定及び識別
アダプター配列に相補的な配列を持つプライマーを使用してターゲットｃｔＤＮＡの配列を決定する。ターゲットｃｔＤＮＡの配列を分析するのは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ ｐｌａｔｆｏｒｍ，ＨｉＳｅｑ ２５００又は他の配列決定手段を使用してよい。

３．結果
３．１ターゲットｃｔＤＮＡの配列
被験体１
表１は、被験体１の腫瘍組織から得られた、ＤＮＡサンプルから識別された上位十個のターゲット配列を示す。表１に示したように、挿入部位配列は、計数（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ Ｒｅａｄｓ）で特定の組み込み位置（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で宿主染色体（Ｈｏｓｔ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＃）に挿入される。計数は、配列決定の結果によって得られる。同じ挿入部位を有する配列をカウントして、サンプル中に存在する挿入部位の量を提供する。各配列は、少なくとも部分的なウイルス配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表２は、被験体１の血液から得られるｃｔＤＮＡサンプルから識別されたターゲット配列を示す。ｃｔＤＮＡサンプルは、腫瘍を切除する十三日前に被験体１から採取される。表２に示したように、各配列は、それぞれ少なくとも部分的なウイルスゲノム配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表１及び表２に示したように、少なくとも＃３（腫瘍サンプル）と＃１２（血清サンプル）、＃１と＃１５、＃２と＃１１の各対は、同じウイルス−宿主挿入部位配列を持つ。腫瘍ＤＮＡ及びｃｔＤＮＡの両方に識別されるウイルス−宿主挿入部位配列の類似したパターン（計数の相対量を含む）は、血清中のキメラｃｔＤＮＡが腫瘍ＤＮＡに由来することを示す。血清における少なくとも一部のウイルスゲノムを有するｃｔＤＮＡを選択的に濃縮することによって、ウイルス−宿主挿入部位を識別して、被験体に関する腫瘍−特異的な情報を提供する。

被験体２
表３は、被験体２の腫瘍組織から得られるＤＮＡサンプルから識別されたターゲット配列を示している。表３に示したように、各配列は、少なくとも部分的なウイルスゲノム配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表４は、被験体２の血液から得られたｃｔＤＮＡサンプルから識別されたターゲット配列を示している。血清サンプルは、腫瘍を切除する際に被験体２から採取される。表４に示したように、各配列は、少なくとも部分的なウイルスゲノム配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表３及び表４に示したように、少なくとも＃１（腫瘍サンプル）と＃１１（血清サンプル）、＃７と＃１２、＃５と＃３は、同じウイルス−宿主挿入部位配列を持つ。腫瘍ＤＮＡ及びｃｔＤＮＡの両方に識別されたウイルス−宿主挿入部位配列の類似したパターンは、血清におけるキメラｃｔＤＮＡが腫瘍ＤＮＡに由来することを示す。血清におけるターゲットｃｔＤＮＡを選択的に濃縮することによって、ウイルス−宿主挿入部位を識別して被験体に関する腫瘍−特異的な情報を提供する。

被験体３
表５は、被験体３の腫瘍組織から得られるＤＮＡサンプルから識別されたターゲット配列を示している。表５に示したように、各配列は、少なくとも部分的なウイルスゲノム配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表６は、被験体３の血液から得られたｃｔＤＮＡサンプルから識別されたターゲット配列を示している。血清サンプルは、腫瘍を切除する際に被験体３から採取される。表６に示したように、各配列は、少なくとも部分的なウイルスゲノム配列（下線により表示）及び部分的な宿主ゲノム配列を含み、ウイルス−宿主挿入部位を形成する。

表５及び表６に示したように、腫瘍ＤＮＡ及びｃｔＤＮＡの両方に識別されたウイルス−宿主挿入部位配列の類似のパターンは、血清におけるｃｔＤＮＡが腫瘍ＤＮＡから由来することを示す。血清におけるターゲットｃｔＤＮＡを選択的に濃縮するによって、ウイルス−宿主挿入部位を識別して被験体に関する腫瘍−特異的な情報を提供する。

３．２腫瘍特異的なウイルス−宿主挿入部位
図３においては、被験体１、被験体４及び被験体５のゲノムＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び定量ＰＣＲによって処理して分析し、腫瘍組織及び非腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を得ている。各被験体において、腫瘍ｇＤＮＡの１つのキメラＤＮＡ配列が識別され、選択されて、マーカーとしてテストを行う。具体的には、分析に使用された被験体１のキメラＤＮＡ配列は、ＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴ（下線はウイルスゲノム配列を示す）であり、被験体４のキメラＤＮＡ配列は、ＡＣＴＴＣＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＴであり、被験体５のキメラＤＮＡ配列は、ＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣである。腫瘍ｇＤＮＡ（Ｔ）及び非−腫瘍ｇＤＮＡ（Ｎ）において、この３つの特異的なウイルス−宿主挿入部位の存在が検出された。ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）及びｍｉＲ−１２２をインターナルコントロールとして使用する。ＮＴＣ（Ｎｏ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）も含む。図３に示したように、被験体１の特異的なウイルス−宿主挿入部位は、腫瘍ｇＤＮＡ（Ｔ）にしか存在せず、非腫瘍ｇＤＮＡ（Ｎ）には存在しない。被験体４及び被験体５にもこれに類似する結果が観察された。つまり、識別されたウイルス−宿主挿入部位は、腫瘍特異性を持つため、腫瘍特異的なバイオマーカーとして利用することができることを表す。

３．３腫瘍進行及びウイルス−宿主挿入部位の量
図４は、腫瘍サイズと特異的なウイルス−宿主挿入部位配列の量との関係を示している。図４に使用される各被験体の挿入部位配列は、それぞれ図３に使用される挿入部位配列と同じである。各被験体の一連の血液サンプルを、手術前及び手術後に得る。図４では、ｇＤＮＡはゲノムＤＮＡを意味し、ＮＴＣはテンプレート無しコントロールを意味し、ＮＴは非腫瘍組織からのｇＤＮＡを意味し、Ｔは腫瘍組織からのｇＤＮＡを意味し、血清ＤＮＡは血清から得られたＤＮＡを意味し、Ｐｒｅ−ＯＰは手術前に得られた血清ＤＮＡを意味し、Ｐｏｓｔ−ＯＰは手術後で得られた血清ＤＮＡを意味し、Ｓｕｂｊｅｃｔ１＊は、被験体１から得られた血清ＤＮＡであり且つ被験体５の実験に使用され、Ｓｕｂｊｅｃｔ４＊は、被験体４から得られた血清ＤＮＡであり且つ被験体１の実験に使用され、Ｓｕｂｊｅｃｔ５＊は、被験体５から得られた血清ＤＮＡであり且つ被験体４の実験に使用され、Ｎｏｒｍａｌは、非患者被験体から得られた血清ＤＮＡを意味する。被験体１の血清サンプルは、２つの時点、即ち腫瘍切除（手術）前１３日及び手術後１９日に採取する。被験体４の血清サンプルは、手術前３３日と手術後３０日に採取する。被験体５の血清サンプルは、手術前２４日と手術後２６日に採取する。非患者被験体の血清サンプル（Ｎｏｒｍａｌ）も、コントロールとして図４に表示している。図４の左側に示したように、各被験体の特異的なウイルス−宿主挿入部位は、腫瘍ｇＤＮＡ及びＰｒｅ−ＯＰにしか現れない。また、被験体１の特異的なウイルス−宿主挿入部位が被験体１のＤＮＡサンプルしか現れず、被験体４のＤＮＡサンプルには現れないということは、識別されたウイルス−宿主挿入部位は、特異性を有することを示唆する。図４の右側を参照すると、被験体１の血清のウイルス−宿主挿入部位は、Ｐｒｅ−ＯＰ血清中において比較的大量に検出されたが、Ｐｏｓｔ−ＯＰ血清中における量は、急激に減少している。図４の右側に示すように、Ｐｒｅ−ＯＰ血清及びＰｏｓｔ−ＯＰ血清における特異的なウイルス−宿主挿入部位の量を、ｑＰＣＲを介して測定する。被験体１のＰｏｓｔ−ＯＰ血清の特異的ウイルス−宿主挿入部位の量は、Ｐｒｅ−ＯＰ血清における量と比較して約３２倍減少している。被験体４及び被験体５においても、類似する状況が見られる。つまり、ウイルス−宿主挿入部位又はウイルス−宿主挿入部位の量は、腫瘍特異性及び被験体特異性を有し、血清中において検出可能であり、腫瘍の状況を反映しており、腫瘍のサイズの変化、例えば手術後のサイズの減少に対応することを示す。

注意すべきは、本発明に記述された方法を利用して、腫瘍組織において、変異は識別されるが、ｃｔＤＮＡにおいて変異したｐ５３又はβ−カテニンの遺伝子は検出できない（データ表示せず）。つまり、この結果は、本発明の方法を利用して、従来の体細胞変異ではない、腫瘍特異的なウイルス−宿主挿入部位（ウイルスゲノム配列が宿主ゲノムに挿入すること）のみを選択的に濃縮し、獲得して癌／腫瘍の情報を提供することができることを指す。

以上示した実施形態は例示であり、本発明における複数の特長及び長所は、本発明の構造及び機能の詳細な内容と共に、前記に説明されたが、上記の記載は、ただの説明に過ぎず、部品の形状、サイズ及び配置事項を含んで、本発明の原理の範囲内で、詳細に変化することができ、特許請求の範囲中で使用される用語の広く一般的な意味によって捉えられる完全な範囲を含む。

Claims (20)

1. 宿主ゲノムに由来する少なくとも１つの配列と、
   Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列と、
   を含む、被験体の循環システムから単離された実質的に無細胞な核酸であって、
   前記宿主ゲノムに由来する少なくとも１つの配列と、前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列とがキメラ挿入部位を形成し、
   前記キメラ挿入部位は実質的に無細胞な核酸から得られるものであり、
   前記キメラ挿入部位は疾患状態を指すものである、核酸。
2. 前記キメラ挿入部位は、少なくとも１つのプローブによって非キメラ挿入部位核酸から分離されるものであり、前記プローブは、前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列に相補的な非−宿主配列に由来する、請求項１に記載の核酸。
3. 前記疾患状態が腫瘍状態であり、前記キメラ挿入部位が腫瘍に由来する、請求項２に記載の核酸。
4. 前記非−宿主配列が、前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムである、請求項３に記載の核酸。
5. 前記腫瘍が、前記Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝細胞癌である、請求項３に記載の核酸。
6. 循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つのウイルス−宿主挿入部位の有無又は量を測定することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した被験体に由来する前記循環無細胞ＤＮＡを識別する方法であって、
   前記循環無細胞ＤＮＡを、前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列に相補的な少なくとも１つのプローブと接触させ、前記少なくとも１つのプローブとハイブリダイズした前記循環無細胞ＤＮＡを捕捉することによって、少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位が選択的に濃縮され、
   少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位が、前記Ｂ型肝炎ウイルスに関する腫瘍状態を指すバイオーマーカーである、方法。
7. 前記少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位が、少なくとも１つの前記Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム配列及び少なくとも１つの非−ウイルス宿主ゲノム配列を含む、請求項６に記載の方法。
8. 被験体に由来する循環無細胞ＤＮＡを、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列に相補的な少なくとも１つのプローブに接触させること；
   少なくとも１つの前記プローブとハイブリダイズした前記循環無細胞ＤＮＡを捕捉すること；
   前記循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つのウイルス−宿主挿入部位の有無又は量を測定すること、
   を含む、被験体の腫瘍をモニタリングする方法。
9. 前記被験体の異なる時点で得られた異なるサンプルにおいて識別された少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位が、腫瘍状態を指す、請求項８に記載の方法。
10. 前記腫瘍が、Ｂ型肝炎ウイルスによる前記被験体の感染に関するものである、請求項９に記載の方法。
11. 前記腫瘍が、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝細胞癌である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記異なる時点が、前記被験体の癌化状態、治療前の状態、治療後の状態、再発状態及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記異なる時点における少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位の量の変化が、前記被験体の前記腫瘍が１つの状態から別の状態まで進行していることを指す、請求項１２に記載の方法。
14. 前記被験体の前記循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位の量の増加は、腫瘍が治療後の状態から再発状態に進行することを指し、前記被験体の前記循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位の量の減少は、腫瘍が被験体の治療前の状態から治療後の状態に進行していることを指す、請求項１３に記載の方法。
15. 癌状態の被験体の前記循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位の量の増加は、腫瘍の成長を指し、癌状態の被験体の前記循環無細胞ＤＮＡにおける少なくとも１つの前記ウイルス−宿主挿入部位の量の減少は、腫瘍の縮小を指す、請求項１３に記載の方法。
16. 宿主ゲノムに由来する宿主配列の少なくとも一部及びウイルスゲノムに由来するウイルス配列の少なくとも一部を含む核酸と、
    前記宿主ゲノムに由来する前記宿主配列の少なくとも一部及び前記ウイルスゲノムに由来する前記ウイルス配列の少なくとも一部の結合によって形成されたウイルス−宿主挿入部位と
    を含む、被験体におけるバイオマーカーであって、
    前記核酸は、循環無細胞ＤＮＡを、前記ウイルス配列の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドと接触させ、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズした前記核酸を捕捉することによって、前記循環無細胞ＤＮＡから得られるものである、バイオマーカー。
17. 前記宿主ゲノムはヒトゲノムであり、前記ウイルスゲノムはＢ型肝炎ウイルスゲノムである、請求項１６に記載のバイオマーカー。
18. 腫瘍−特異的バイオマーカーである、請求項１７に記載のバイオマーカー。
19. 被験体から１つ又は複数の循環無細胞ＤＮＡを検出することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した被験体の疾患を診断する方法であって、前記１つ又は複数の循環無細胞ＤＮＡが、非−宿主Ｂ型肝炎ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つの配列及び宿主ゲノムに由来する少なくとも１つの配列を含む、方法。
20. 前記疾患が、Ｂ型肝炎ウイルスの慢性的な感染によって引き起こされる癌である、請求項１９に記載の方法。