CN104017228B - 一种几丁质胶体的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种几丁质胶体的制备工艺，工艺为将几丁质固体烘干、打碎、过筛，制备成几丁质粉末；溶于有机酸中，制成几丁质酸溶液；用碱液调节pH不超过7，制得几丁质胶体。跟现有技术相比，本发明的主要优点在于:通过在超声波清洗器中超声波振荡环境下制出来的几丁胶体，胶粒小而疏松，酶切效果好，更适合酶促反应；不必过滤，不冲洗，几丁质胶体浓度可确保精准；不需要另外配置缓冲溶液，降低了生产成本；不必担心强酸对几丁质的意外破坏，和对操作人员的损伤；不离心，不反复冲洗，节约了大量的电能源和水资源；没有产生副产物，不造成环境污染，符合环境友好型。
Description
技术领域
本发明涉及合成领域，具体涉及一种几丁质胶体的制备工艺。
背景技术
几丁质(chitin)又称壳多糖，甲克素。为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻中。物理性状：外观为类白色无定形物质，无臭、无味。溶解性：能溶于含8％氯化锂的二甲基乙酰胺或浓盐酸；不溶于水、稀酸、碱、乙醇或其它有机溶剂。水解性：用酸完全水解成甲壳胺(2-氨基葡萄糖)。产品用途：甲壳素是制取壳聚糖、氨基葡萄糖系列产品的重要原料。几丁质及其衍生物在医药、化工、保健食品等方面具有重要的用途，有广阔的应用前景。用于制可溶性几丁质和氨基葡萄糖，可作化妆品和功能性食品的添加剂，可制备照相感光乳剂等。市售的几丁质固体不溶于一般水溶液内，它的物理性质(结构)也不是几丁质酶(系)的良好底物。因而，人们先把把几丁质固体制备成几丁质胶体，然后用水解酶(包括几丁质酶)将几丁质胶体水解为N-乙酰葡萄糖胺或几丁寡糖，再加以利用。因此，合成几丁质胶体就成为一个非常重要的步骤。
我国是的几丁质胶体需求大国，同时国际上也是明显的供不应求。目前制备几丁质胶体的方法是，用高浓度的无机强酸溶解粉末几丁质，再中和强酸或大量水稀释，析出沉淀，离心出沉淀，将沉淀再次溶解成胶体。这种方法有以下缺点：一是无法确定胶体的浓度，有未知量的几丁质胶体被离心出去了；二是高浓度的强无机酸对几丁质产生了不利于酶促反应的影响；三是当酶促反应时还需要另外配置缓冲溶液，步骤繁琐并浪费原料；四是生产过程中浪费大量的水资源，并产生大量的无机强酸废液，造成严重的环境污染；五是需要高动力的离心机，浪费了动力，增加了器械成本和时间成本。因此，几丁质胶体至今没能够工业化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种几丁质胶体的制备工艺。
本发明提供的一种几丁质胶体的制备工艺，包括以下步骤：
(1)、将几丁质固体烘干、打碎、过筛，制备成几丁质粉末；
(2)、将几丁质粉末溶于有机酸中，加热20-60℃，搅拌10-20h,溶解混匀，在相同温度下功率250W超声20-60min，再在相同温度下搅拌10-30h，制成几丁质酸溶液；
(3)、用碱液调节pH不超过7，继续功率250W超声30-60min,再搅拌5-20h，制得几丁质胶体。
步骤(1)中所述过筛，过筛目数为60目—120目。
步骤(2)中所述有机酸为过饱和柠檬酸或冰醋酸中任意一种；
几丁质与柠檬酸的用量比为：每1g几丁质用10-30ml过饱和柠檬酸；优选的每1g几丁质用20ml过饱和柠檬酸；
所述冰醋酸为质量浓度大于99.5％的醋酸；
几丁质与冰醋酸的用量比为：每1g几丁质用10-50ml冰醋酸，优选的，每1g几丁质用30ml冰醋酸；
步骤(3)中所述碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为0.5-4.5mol/L。
步骤(3)用碱液调节pH的过程在温度为0℃～20℃，功率250W超声波条件下进行；
跟现有技术相比，本发明的主要优点在于:①通过在超声波清洗器中超声波振荡环境下制出来的几丁胶体，胶粒小而疏松，酶切效果好，更适合酶促反应；②不必过滤，不冲洗，几丁质胶体浓度可确保精准；③不需要另外配置缓冲溶液，降低了生产成本，使几丁胶的大规模工业生产成为可能；④不必担心强酸对几丁质的意外破坏，和对操作人员的损伤；⑤不离心，不反复冲洗，节约了大量的电能源和水资源；⑥没有产生副产物，不造成环境污染，符合环境友好型。
具体实施方式
几丁质，中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号F20020108，符合Q/CYDZ-1554-2000，生化试剂BR.)；
酶活力通过以下方法测定：
以红曲霉为菌种，采用液体培养方法得到几丁质酶粗酶液，培养基为：基础培养基为察氏培养基、碳源葡萄糖4.0％、氮源硝酸钠2.0％、诱导剂几丁质添加量0.1332％，培养初始pH为5.5，培养温度为32℃，培养时间为48h，发酵液4000r/min离心10分钟，以清液作为粗酶液。
实验组，先用移液枪准确吸取pH6.0柠檬酸缓冲溶液配制的1％几丁质胶体1ml于比色管中,再用移液枪准确吸取粗酶液1ml与其混合，在45℃恒温水浴锅反应30min，最后用移液枪准确加入1.5mlDNS液(农业部标准)，沸水浴8min。
对照组，先用移液枪准确吸取粗酶液1ml于比色管中，沸水浴10min，再用移液枪准确吸取pH6.0柠檬酸缓冲溶液配制的1％几丁质胶体1ml与其混合，在45℃恒温水浴锅反应30min，最后用移液枪准确加入1.5mlDNS液(农业部标准)，沸水浴8min。
将实验组和对照组比色管溶液冷却至室温，定容到25ml，在450nm下用紫外分光光度计检测其吸光值，并根据N-乙酰葡萄糖胺标准曲线通过计算得出几丁质酶的酶活力。酶活力的定义是：酶在最适的酶促反应条件下，产生1微摩尔的N-乙酰葡萄糖胺为1个酶活力单位。
N-乙酰葡萄糖胺标准溶液的制备及标准曲线的测定方法如下：
准确称取1.0000gN-乙酰葡萄糖胺(预先在70℃下烘干至于衡重)，用去离子水定容至1L，即得到N-乙酰葡萄糖胺母液，其浓度1mg/ml。
按下表加入：
N-乙酰葡萄糖胺标准曲线测定配方
标准曲线的测定方法
分别取0、1、2、3、4、5号N-乙酰葡萄糖胺标准溶液1mL，DNS液(农业部标准)1.5mL与比色管，沸水浴8min，比色管定容到25mL，摇匀，用紫外分光光度计在540nm下检测吸光度。根据N-乙酰葡萄糖胺的量和吸光值做出标准曲线。
实施例1
(1)、称取几丁质固体过100目筛，烘干得几丁质粉末；
(2)、将1.0000g几丁质粉末溶于20mL过饱和柠檬酸内，加热至40℃，经磁力搅拌器12h的搅拌、溶解，在40℃，功率250W超声波30分钟，再在40℃下磁力搅拌24小时；
(3)、在10℃超声波下，将2mol/L氢氧化钠溶液在功率250W超声波条件下缓慢滴加到几丁质酸溶液中，调节PH值到5.5，成为胶状液，继续超声波震荡30分钟，再磁力搅拌器常温搅拌12小时。
加蒸馏水或去离子水，用100ml容量瓶配置浓度为1.0000％的几丁质胶体。用微量强酸或强碱微调pH至6.0。最后用红外线激光笔检测是否有明显的红光直线通路，若有此现象则说明有丁达尔现象，符合胶体性质。同时用几丁质酶活力确定此几丁质胶体是否适合酶促反应。本实验酶活力检测方法：利用DNS液与酶促反应产物N-乙酰葡萄糖胺反应，出现显色，通过分光光度计检测出显色体系的吸光度，确定酶促反应产物N-乙酰葡萄糖胺的量，计算出红曲霉几丁质酶的酶活力。酶活力的定义是：酶在最适的酶促反应条件下，产生1微摩尔的N-乙酰葡萄糖胺为1个酶活力单位。若有酶活力则说明此胶体适合酶促反应，此胶可作为几丁酶(系)的底物。最终应将胶体处于4℃湿态下保存。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例2
(1)、称取几丁质固体过100目筛，烘干得几丁质粉末；
(2)、将1.0000g几丁质粉末溶于30mL过饱和柠檬酸内，加热至40℃，经磁力搅拌器12h的搅拌、溶解，在40℃，功率250W超声波30分钟，再在40℃下磁力搅拌24小时；
(3)、在10℃超声波下，将2mol/L氢氧化钠溶液在功率250W超声波条件下缓慢滴加到几丁质酸溶液中，调节PH值到5.5，成为胶状液，继续超声波震荡30分钟，再磁力搅拌器常温搅拌12小时。
加蒸馏水或去离子水，用100ml容量瓶配置浓度为1.0000％的几丁质胶体。用微量强酸或强碱微调pH至6.0最后用红外线激光笔检测是否用明显的红光光线通路，若有此现象则说明有丁达尔现象，符合胶体性质。同时用几丁质酶与此胶体发生酶促反应，用DNS显色法检测是否含有N-乙酰葡萄糖胺，若有N-乙酰葡萄糖胺则说明此胶体适合酶促反应，此胶可作为几丁酶(系)的底物。最终应将胶体处于4℃湿态下保存。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例3
过饱和柠檬酸溶液的量为10mL，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例4
几丁质过60目筛，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过60目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例5
几丁质过120目筛，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过120目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例6
初始调节pH至2.5，定容后微调至最终pH3.0，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
实施例7
调节pH6.5，定容后微调最终pH7.0，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例8
将柠檬酸改为冰醋酸，冰醋酸体积的为10mL，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
实施例9
柠檬酸改为冰醋酸，冰醋酸的量为50mL，其余步骤同实施例1。
经检测：1，红外线激光笔检测本实施例制备的几丁质胶体出现明显的红光直线通路，即几丁质胶体制备成功。
2，红曲霉几丁质酶分别与几丁质粉末(过100目)、传统几丁质胶体(用目前方法浓盐酸制备的几丁质胶体)、本实施例制备的几丁质胶体，发生酶促反应(酶促反应条件相同)。得到酶活力结果：
Claims (7)
1.一种几丁质胶体的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将几丁质固体烘干、打碎、过筛，制备成几丁质粉末；
（2）、将几丁质粉末溶于有机酸中，加热20-60℃，搅拌10-20h,溶解混匀，在相同温度下功率250W超声20-60min，再在相同温度下搅拌10-30h，制成几丁质酸溶液；
（3）、用碱液调节pH不超过7，继续功率250W超声30-60min,再搅拌5-20h，制得几丁质胶体；
步骤（2）中所述有机酸为过饱和柠檬酸或冰醋酸中任意一种。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤（1）中所述过筛，过筛目数为60目—120目。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，几丁质与柠檬酸的用量比为：每1g几丁质用10-30ml过饱和柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述冰醋酸为质量浓度大于99.5%的醋酸。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，几丁质与冰醋酸的用量比为：每1g几丁质用10-50ml冰醋酸。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤（3）中所述碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为0.5-4.5mol/L。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤（3）用碱液调节pH的过程在温度为0℃~20℃，功率250W超声波条件下进行。
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