CN104016952B - 一种倍半萜活性成分及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的倍半萜化合物及其制备方法和应用。该发明具体公开了从犬问荆中经提取、萃取、柱层析分离以及重结晶纯化得到一种新的倍半萜化合物的制备方法，并采用光谱技术确定其分子式为C15H24O6，分子量为300，称为犬问荆内酯。通过琼脂扩散法检测该化学成分的抗菌活性，结果表明该活性成分对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性。本发明中犬问荆内酯的制备方法简单、易行，短周期内即可获得高纯度、高收率和高附加值的产品，适用于产业化生产和应用，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物。

Description

一种倍半萜活性成分及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取、分离纯化具有生物活性的化合物，具体是从犬问荆[EquisetumpalustreL.]全草中提取、分离纯化一种新的具有生物活性的内酯化合物及其提取方法，属于植物次生代谢产物分离纯化领域。该化合物为犬问荆内酯，化学名为：1S,2R,7S,8R-四羟基-丁香烷-[4,7]-4,5-内酯。
背景技术
犬问荆[EquisetumpalustreL.]，为木贼科（Equisetaceae）、问荆（Equisetum）属药用植物。广泛分布于全国各地海拔200-4000米地区。在国内外民间被广泛用于治疗溃疡、痔疮、肾结石等症，并具有镇静、保肝解毒、降血压、降血脂作用（于荣敏等,1986;YesiladaE.etal,1995;HondaG.etal,1996;李德坤等,2000;JiY.B.etal,2003）。兼具问荆的功效，在我国也经常将其作为问荆使用。犬问荆全草入药。《闽东本草》记载，犬问荆具有治疗“肠风痔漏”之功效。国内外民间验方中将其广泛应用于消化道溃疡疾病的治疗。现代药理研究表明，犬问荆具有抗泌尿系统、心血管系统、胃肠功能紊乱疾病、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物学活性，资源丰富具有很高的应用价值。
犬问荆中已知的次生代谢产物包括犬问荆碱，犬问荆定碱，烟碱，山柰酚-3-双葡萄糖-7-葡萄糖甙，山柰酚-3-鼠李糖葡萄糖甙，山柰酚-3-氧-芦丁甙-7-氧-槐糖甙，山柰酚-3-氧(6-氧-丙二酰基葡萄糖甙)-7-氧-葡萄糖甙，山柰酚-3,7-双葡萄糖甙，山柰酚-3-鼠李糖葡萄糖-7-葡萄糖甙，山柰酚-3-芸香糖-7-葡萄糖甙，槲皮素-3-芸香糖-7-葡萄糖甙，乌头酸等（杨纯瑜等,1997;GurbuzI.etal,2009;周荣汉等,1985）。总体上，涉及生物碱、黄酮类和有机酸类。
本发明中的倍半萜化合物为首次从犬问荆中提取、分离纯化得到的萜类，并且为一种新化合物，在已有文献中未有报道。实验证明该化合物具有明显的抗菌活性，可在制备抗菌药物中应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供从犬问荆全草中提取分离得到的一种新的倍半萜化合物犬问荆内酯。
本发明的另一个目的是提供上述倍半萜化合物犬问荆内酯的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述倍半萜化合物犬问荆内酯在抗菌药物中的应用。
本发明提供的倍半萜活性成分——犬问荆内酯是通过以下方案获得的：
(1)提取：将犬问荆全草原料粉碎后，按质量体积比加入5～20倍原料质量的丙酮、甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行热回流、负压空化或超声波辅助提取，共提取2～5次，每次20min～60min，合并提取液，浓缩至干，得到犬问荆全草提取物；
(2)负压空化混悬液液萃取：将犬问荆全草提取物分散于按质量体积比3～5倍的40～50°C水中，然后装入负压空化萃取柱，分别用和水等体积的石油醚或正己烷负压空化混悬液液萃取2～4次，萃取后的水相再分别用与水等体积的乙酸乙酯负压空化混悬液液萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)柱层析分离：将乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解，加入与乙酸乙酯萃取物等质量的目数为300～400的层析硅胶拌匀、40°C减压蒸干，预先称取乙酸乙酯萃取物质量4～5倍的500～800目层析硅胶，采用体积比为4:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入层析柱内，以体积比为4:1～1:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层层析检测，合并含化合物犬问荆内酯的流份，浓缩至干，得到犬问荆内酯粗品；
(4)重结晶：上述犬问荆内酯粗品用乙酸乙酯重结晶得犬问荆内酯纯品。
本发明产品经质谱、红外光谱、核磁共振波谱和X射线单晶衍射等多种手段检测，确定了犬问荆内酯的分子式为C15H24O6，化学结构式为：
本发明中的犬问荆内酯进行抗菌活性检测，结果显示该化合物具有良好的抗菌活性，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物。
本发明的优点是：
1.提供一种具有生物活性的新化合物。
2.该方法简单易行，周期短，可实现大规模的产业化生产。
3.产品得率高、纯度高。
附图说明
图1：犬问荆内酯的质谱图
其中，A为正离子扫描模式下犬问荆内酯的低分辨质谱图；B为正离子扫描模式下犬问荆内酯的高分辨质谱图
图2：犬问荆内酯的红外光谱图
图3：犬问荆内酯的1H-NMR谱图
图4：犬问荆内酯的13C-NMR谱图
图5：犬问荆内酯的DEPT谱图
图6：犬问荆内酯的HMBC谱图
图7：犬问荆内酯的HMQC谱图
图8：X射线单晶衍射确定犬问荆内酯构型
图9：犬问荆内酯的1H–1HCOSY和选择性HMBC相关
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用来说明本发明而不是对本发明的限制。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照制造商所建议的条件，或按照常规条件。
实施例1：犬问荆中倍半萜化合物犬问荆内酯的提取和分离
称取犬问荆全草3.0kg，粉碎后，加入20升80%乙醇进行热回流提取，共提取2次，每次60min。合并提取液，减压浓缩，得乙醇提取物560g。提取物分散于2升40°C温水中，用正己烷负压空化混悬液液萃取4次，每次2升。萃取后的水相再用乙酸乙酯负压空化混悬液液萃取3次，每次2升，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物46g。将乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解，加入46g目数为300～400的层析硅胶拌匀、40°C减压蒸干，预先称取200克500～800目层析硅胶，采用体积比为4:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入层析柱内，以体积比为4:1和1:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，薄层层析检测，合并含化合物犬问荆内酯的流份，浓缩至干，得到犬问荆内酯粗品。犬问荆内酯粗品用乙酸乙酯重结晶得犬问荆内酯156.6mg，纯度为98%。
实施例2：倍半萜化合物犬问荆内酯结构鉴定
实施例1化合物犬问荆内酯为白色粒状结晶，易溶于丙酮、甲醇等有机试剂；电喷雾质谱给出离子峰m/z323，经高分辨电喷雾质谱确定其精确m/z323.1469(calcd.forC15H24O6+Na,323.1471)及分子式C15H24O6；IR(KBr)Vmax3435cm–1(–OH)，1637cm–1(–C=O)。1H和13C-NMR数据见表1，结合DEPT谱，H–H相关谱（H–HCOSY）、H–C相关谱（HMQC）、H–C远程相关谱（HMBC）以及X射线单晶衍射，确定了该化合物的化学结构。化学结构式如下：
表1实施例1化合物犬问荆内酯的1H和13C-NMR数据
实施例3：倍半萜化合物犬问荆内酯的平板抑菌实验
采用琼脂扩散法测定犬问荆内酯的抑菌直径，取直径6mm已灭菌（160℃干热灭菌2h）的滤纸片，平放于无菌平皿内，用微量进样器滴加浓度为0.5mg/mL的犬问荆内酯5μL（溶于DMSO中，DMSO在体系中的最终浓度为0.4%），充分吸收后晾干，备用。阳性对照滤纸片中加0.5mg/mL的青霉素5μL，阴性对照滤纸片中加DMSO（0.4%）5μL。用无菌棉签蘸取108cfu/mL的枯草芽孢杆菌悬液，在营养琼脂平板表面均匀涂抹3次，然后绕平板边缘涂抹一周，盖好平皿，在4℃放置5min使菌液充分吸收。用无菌镊子取滤纸片轻轻贴放于平板表面，每个平板贴3片试验样片，1片阴性对照片。将平皿置于37℃恒温箱，培养24h，观察并测量抑菌圈。实验结果显示该化合物对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性。

Claims (3)

1.一种倍半萜生物活性成分，其为犬问荆内酯：1S,2R,7S,8R-四羟基-丁香烷-[4,7]-4,5-内酯，其化学结构式如下：
2.按照权利要求1所述的一种倍半萜活性成分的制备方法，其特征在于具体制备步骤如下：
(1)提取：以犬问荆全草为原料，经粉碎后，按质量体积比加入5～20倍原料质量的丙酮、甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行热回流、负压空化或超声波辅助提取，共提取2～5次，每次20min～60min，合并提取液，浓缩至干，得到犬问荆全草提取物；
(2)负压空化混悬液液萃取：将犬问荆全草提取物分散于按质量体积比3～5倍的40～50℃水中，然后装入负压空化萃取柱，分别用和水等体积的石油醚或正己烷负压空化混悬液液萃取2～4次，萃取后的水相再分别用与水等体积的乙酸乙酯负压空化混悬液液萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)柱层析分离：将乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解，加入与乙酸乙酯萃取物等质量的目数为300～400的层析硅胶拌匀、40℃减压蒸干，预先称取乙酸乙酯萃取物质量4～5倍的500～800目层析硅胶，采用体积比为4:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入层析柱内，以体积比为4:1～1:1的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层层析检测，合并含化合物犬问荆内酯的流份，浓缩至干，得到犬问荆内酯粗品；
(4)重结晶：犬问荆内酯粗品用乙酸乙酯重结晶得犬问荆内酯纯品。
3.权利要求1中所述的倍半萜生物活性成分在制备抗菌药物中的应用。
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