CN104010641A - 用于治疗淀粉样蛋白病和共核蛋白病的含咖啡因的化合物和组合物 - Google Patents

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Abstract

用于治疗如在阿尔茨海默病和共核蛋白病如帕金森病中观察到的β-淀粉样蛋白病的化合物及其药学上可接受的盐。

Description

用于治疗淀粉样蛋白病和共核蛋白病的含咖啡因的化合物和组合物
技术领域
本发明涉及本发明所述的化合物和药学上可接受的盐，它们的合成，包含它们的药物组合物，以及它们在治疗β-淀粉样蛋白病（如在阿尔茨海默病中观察到的）和共核蛋白病（如帕金森病）中的用途、以及在制造用于这类治疗的药物中的用途。
发明背景
阿尔茨海默病的特征是被称为β-淀粉样蛋白或Aβ的39-43个氨基酸的肽以纤丝的的形式积聚，表现为细胞外的淀粉样蛋白斑和脑血管壁内的淀粉样蛋白。阿尔茨海默病中的纤丝的Aβ淀粉样蛋白沉积被认为对患者有害并最终导致毒性和神经细胞死亡（阿尔茨海默病特有的标志）。大量的证据表明淀粉样蛋白，更确切地说，Aβ纤丝的形成、沉积、积聚和/或持续是阿尔茨海默病病理发生的主要致病因子。此外，除阿尔茨海默病以外，许多其他淀粉样蛋白病涉及Aβ纤丝的形成、沉积、积聚和持续，这些疾病包括唐氏综合征、涉及嗜刚果红血管病的失调，例如但不局限于荷兰型遗传性脑出血，以及脑β-淀粉样蛋白血管病。
帕金森病是特征为表现出许多淀粉样蛋白特征的异常纤丝蛋白沉积的形成、沉积、积聚和/或持续的另一种人类失调。在帕金森病中，由α-共核蛋白的单纤维构成的细胞质路易小体的积聚被认为在病理发生中很重要并且作为治疗靶标。能够抑制α-共核蛋白形成、沉积、积聚和/或持续，或破坏预先形成的α-共核蛋白纤丝（或其部分）的新试剂或化合物被认为是治疗帕金森病和相关的共核蛋白病的潜在疗法。在体外或在患有帕金森病的患者的大脑中观察到α-共核蛋白的一个35个氨基酸的片段，所述片段具有形成淀粉样蛋白纤丝的能力。α-共核蛋白的所述片段是一个相对重要的治疗靶标，因为α-共核蛋白的这部分被认为对于路易小体的形成是决定性的，如在患有帕金森病、共核蛋白病和相关失调的所有患者中观察到的。此外，形成纤丝的并是刚果红和硫磺素S阳性的（用于检测淀粉样蛋白纤丝沉积的特定染色）的α-共核蛋白被发现作为患有以下疾病的患者的大脑中的路易小体的部分：帕金森疾病、路易小体疾病（神经病学手册（Handbuch der Neurologie）中的路易，M.莱万多夫斯基（Lewandowski）编辑，斯普林格（Springer），柏林，第920-933页，1912；泊兰恩（Pollanen）等人，神经病理学和实验神经学杂志（J.Neuropath.Exp.Neurol.）52:183-191，1993；斯皮兰提尼（Spillantini）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）95:6469-6473，1998；新井（Arai）等人，神经科学通讯（Neurosci.Lett.）259:83-86，1999），多系统萎缩（若林（Wakabayashi）等人，神经病理学报（Acta Neuropath.）96:445-452，1998），路易小体痴呆以及阿尔茨海默病的路易小体变异。在帕金森病中，纤丝在患有这种疾病的患者的大脑中发育，这些纤丝是刚果红和硫磺素S阳性的，并包含主要的β折叠片二级结构。
淀粉样蛋白作为阿尔茨海默病的治疗靶标
阿尔茨海默病同样给社会带来沉重的经济负担。一项最近的研究估计在家或在疗养院照料一位有严重认知损害的阿尔茨海默病患者的成本每年超过47,000美元（了解阿尔茨海默病及相关疾病的指南（A Guide to UnderstandingAlzheimer's Disease and Related Disorders））。对于一种跨度可以从2至20年的病，对家庭和社会而言阿尔茨海默病的总花费都越来越大。在美国，在医疗保健费用和患者及他们的照料者的工资损失方面，阿尔茨海默病的年经济代价估计是800到1000亿美元（阿尔茨海默病2003年进展报告（2003Progress Reporton Alzheimer's Disease））。
盐酸他克林（“Cognex（益智胶囊）”），第一种FDA批准的用于阿尔茨海默病的药物，是一种乙酰胆碱酯酶抑制剂（卡特勒（Cutler）和斯让麦克（Sramek），新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.）328:808810，1993）。然而，这种药物已经示出在阿尔茨海默病患者中产生认知改善，并且最初具有主要的副作用，如肝脏毒性。第二种FDA批准的药物，多奈哌齐（“安理申”），也是一种乙酰胆碱酯酶抑制药，它比他克林更有效，在于在阿尔茨海默病患者中显示轻微的认知改善（巴尔纳（Barner）和格雷（Gray），药物治疗纪事（Ann.Pharmacotherapy）32:70-77，1998；罗杰斯（Rogers）和氟瑞德哈夫（Friedhoff），欧洲神经心理学（Eur.Neuropsych.）8:67-75，1998），但不被认为是治愈。因此，清楚的是，对于用于阿尔茨海默病患者的更有效的治疗存在需要。
阿尔茨海默病的特征是被称为β-淀粉样蛋白，Aβ或β/A4的39-43个氨基酸的肽的沉积或积聚（格伦（Glenner）和王（Wong），生物化学与生物物理学研究通讯（Biochem.Biophys.Res.Comm.）120:885-890，1984；马斯特斯（Masters）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）82:4245-4249，1985；赫斯比（Husby）等人，WHO公告（Bull.WHO）71:105-108，1993）。Aβ是从被称为β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的更大的前体蛋白的蛋白酶裂解中衍生的，其中存在若干可替代地剪接的变体。APP的最丰富的形式包括由695个、751和770个氨基酸构成的蛋白（坦齐（Tanzi）等人，自然（Nature）31:528-530，1988）。
小Aβ肽是构成阿尔茨海默病患者的脑中的淀粉样蛋白沉积“斑”的主要组分。此外，阿尔茨海默病的特征是存在许多神经纤丝的“缠结”，这些缠结由在神经元细胞质中不正常地聚集的成对的螺旋纤丝构成（格伦德克-伊克巴尔（Grundke-Iqbal）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）83:4913-4917，1986；科希克（Kosik）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）83:4044-4048，1986；李（Lee）等人，科学（Science）251:675-678，1991）。因此阿尔茨海默病的病理标志是存在“斑”和“缠结”，其中β-淀粉样蛋白在斑的中央核心沉积。在阿尔茨海默病脑中发现的其他主要损伤类型是β-淀粉样蛋白在脑实质内的血管壁和位于大脑外的脑膜血管壁中聚集。定位在血管壁上的β-淀粉样蛋白沉积物称为脑血管淀粉样蛋白或嗜刚果红血管病（曼迪波（Mandybur），神经病理学和实验神经学杂志（J Neuropath.Exp.Neurol.）45:79-90，1986；帕德瑞吉（Pardridge）等人，神经化学杂志（J.Neurochem.）49:1394-1401，1987）。
多年以来，关于“β-淀粉样蛋白”在阿尔茨海默病中的重要性和这种疾病的“斑”和“缠结”特征是这种疾病的起因还是仅为疾病的后果一直都在进行科学辩论。在过去的几年内，现在研究表明β-淀粉样蛋白确实是阿尔茨海默病的一种致病因子，而不应认为仅是无牵连的局外者。细胞培养物中的阿尔茨海默Aβ蛋白已经示出在短期内引起了神经细胞退化（派克（Pike）等人，大脑研究（Br.Res.）563:311-314，1991；神经化学杂志（J.Neurochem.）64:253-265，1995）。研究表明，正是所述纤丝结构（主要由β-折叠片的二级结构构成）是造成神经毒性效应的原因。还发现Aβ在海马的切片培养物中是毒害神经的（哈里根（Harrigan）等人，衰老神经生物学（Neurobiol.Aging）16:779-789，1995），并且诱导转基因小鼠的神经细胞死亡（盖姆斯（Games）等人，自然（Nature）373:523-527，1995；萧（Hsiao）等人，科学（Science）274:99-102，1996）。将阿尔茨海默的Aβ蛋白注射入大鼠的脑中也会引起记忆损伤和神经功能紊乱（弗洛德（Flood）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）88:3363-3366，1991；大脑研究（Br.Res.）663:271-276，1994）。
很可能地，最有说服力的关于Aβ淀粉样蛋白直接参与阿尔茨海默病的发病机理的证据来自遗传研究。发现Aβ的产生可以源于编码它的前体（即β-淀粉样蛋白前体蛋白）的基因的突变（万·布鲁克霍温（Van Broeckhoven）等人，科学（Science）248:1120-1122，1990；默雷尔（Murrell）等人，科学（Science）254:97-99，1991；哈斯（Haass）等人，自然医学（Nature Med.）1:1291-1296，1995）。对引起早发性家族性阿尔茨海默病的β淀粉样前体蛋白基因的突变的识别是淀粉样蛋白对潜藏于所述疾病之下的发病机理过程至关重要的这一主张的最强有力的论据。己经发现四个已报道的致病突变，这些致病突变证明了Aβ在引起家族性阿尔茨海默病中的重要性（综述于哈迪（Hardy），自然遗传学（Nature Genet.）1:233-234，1992）。所有的这些研究表明提供药物来降低、消除或阻止纤丝Aβ在人类患者大脑中的形成、沉积、积聚和/或持续将起到有效治疗的作用。
许多其他的人类疾病也表现出淀粉样蛋白的沉积，且通常涉及全身器官（即，位于中枢神经系统外的器官或组织），其中淀粉样蛋白的聚集导致器官的功能紊乱或衰竭。在许多不同的器官和组织中引起显著淀粉样蛋自聚集的这些淀粉样蛋白病（如下所讨论）被称为全身性的淀粉样变性。在其他淀粉样蛋白病中，单个器官可能会受到影响，例如90%的2型糖尿病患者的胰腺。在这种淀粉样蛋白病中，认为胰腺中的郎格罕氏岛中的β-细胞因为纤丝淀粉样蛋白沉积物的聚集而破坏，所述纤丝淀粉样蛋白沉积物主要由称为胰岛淀粉样多肽（IAPP）的蛋白组成。抑制或减少这样的IAPP淀粉样蛋白纤丝的形成、沉积、积聚和持续认为会对2型糖尿病产生新的有效治疗。对阿尔茨海默病、帕金森病和“全身性的”淀粉样蛋白病，当前无法治愈或没有有效的治疗，并且患者通常在疾病发作后的3到10年内死亡。
根据存在的淀粉样蛋白的类型连同潜在疾病来划分淀粉样蛋自病（淀粉样变性）。淀粉样蛋白病有很多共同的特征，包括由独特类型的淀粉样蛋白构成的每种淀粉样蛋白。淀粉样蛋白病包括但不局限于：与阿尔茨海默病、唐氏综合征、有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血、拳击性失智症、包涵体肌炎（爱斯坎纳斯（Askanas）等人，神经病学年鉴（Ann.Neurol.）43:521-560，1993）和轻度认知缺损（这里特定的淀粉样蛋白被称为β-淀粉样蛋白或Aβ）相关的淀粉样蛋白病，与慢性炎症、不同形式的恶性和家族性地中海热（这里特定的淀粉样蛋白被称为AA淀粉样蛋白或炎症相关的淀粉样变性（又名全身性的AA淀粉样变性）相关的淀粉样蛋白病，与多发性骨髓瘤和其他B-细胞液不调（这里特定的淀粉样蛋白被称为AL淀粉样蛋白）相关的淀粉样蛋白病，与2型糖尿病（这里特定的淀粉样蛋白被称为糊精或胰岛淀粉样多肽或IAPP）相关的淀粉样蛋白病，与阮病毒病包括克-雅氏病、格-史氏综合征、新几内亚震颤病和动物痒病（这里特定的淀粉样蛋白被称为PrP淀粉样蛋白）相关的淀粉样蛋白病，与长期血液透析和腕管综合征（这里特定的淀粉样蛋白被称为α2-微球蛋白淀粉样蛋白）相关的淀粉样蛋白病，与高龄心脏淀粉样变性和家族性淀粉样多发性神经病变（这里特定的淀粉样蛋白被称为甲状腺素运载蛋白或前清蛋白）相关的淀粉样蛋白病，以及与内分泌肿瘤例如甲状腺的乳腺髓样癌（这里特定的淀粉样蛋白被称为原降钙素的变体）相关的淀粉样蛋白病。此外，形成淀粉样蛋白样纤丝的并是刚果红和硫磺素S阳性（用于检测淀粉样蛋白纤丝沉积的特定染色）的α-共核蛋白被发现作为患有以下疾病的患者的大脑中的路易小体的部分：帕金森疾病、路易小体疾病（神经病学手册（Handbuch derNeurologie）中的路易，M.莱万多夫斯基（Lewandowski）编辑，斯普林格（Springer），柏林，第920-933页，1912；泊兰恩（Pollanen）等人，神经病理学和实验神经学杂志（J.Neuropath.Exp.Neurol.）52:183-191，1993；斯皮兰提尼（Spillantini）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）95:6469-6473，1998；新井（Arai）等人，神经科学通讯（Neurosci.Lett.）259:83-86，1999），多系统萎缩（若林（Wakabayashi）等人，神经病理学报（Acta Neuropath.）96:445-452，1998），路易小体痴呆以及阿尔茨海默病的路易小体变异。为了本披露的目的，由于纤丝在帕金森病（刚果红和硫磺素S阳性，并且主要包含β折叠片二级结构）的患者的脑中发展的事实，现在认为帕金森病是一种还展示淀粉样蛋白病特征的疾病。
已知全身性淀粉样变性，包括与慢性炎症、不同形式的恶性和家族性地中海热有关的淀粉样蛋白病（即AA淀粉样蛋白或者炎症有关的淀粉样变性）（本森（Benson）和科恩（Cohen），关节炎风湿病学（Arth.Rheum.）22:36-42，1979；龟井（Kamei）等人，日本病理学报（Acta Path.Jpn.）32:123-133，1982；麦克亚当（McAdam）等人，柳叶刀（Lancet）2:572-573，1975；梅塔克萨斯（Metaxas），国际肾脏（Kidney Int.）20:676-685，1981），和与多发性骨髓瘤和其他B细胞液不调有关的淀粉样蛋白病（即AL淀粉样蛋白）（哈拉达（Harada）等人，组织化学与细胞化学杂志（J.Histochem.Cytochem.）19:1-15，1971）为例的，涉及多个不同器官和组织（一般处于中枢神经系统之外）中的淀粉样蛋白沉积。在这些疾病中，淀粉样蛋白沉积可以发生在，例如肝、心脏、脾、胃肠道、肾、皮肤和/或肺中（约翰逊（Johnson）等人，新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.）321:513-518，1989）。对于大多数这样的淀粉样变性，没有明显的治愈或有效的治疗方法，并且淀粉样蛋白沉积的后果会是对患者有害的。例如，淀粉样蛋白在肾中的沉积会导致肾衰竭，而淀粉样蛋白在心脏中的沉积会导致心力衰竭。对于这些患者，淀粉样蛋白在全身性器官中的聚集通常在3-5年内导致最终死亡。其他的淀粉样变性可以影响单个器官或组织，例如，在阿尔茨海默病和唐氏综合征患者的脑中发现的Aβ淀粉样蛋白沉积所观察到的:在克-雅氏病、格史氏综合征和新几内亚震颤病患者的脑中发现的PrP蛋白淀粉样沉积；在90%的2型糖尿病患者的胰腺的郎格罕氏岛中发现的小岛淀粉样蛋白沉积（IAPP）（约翰逊（Johnson）等人，新英格兰医学杂志（N.Engl.J.Med.）321:513-518，1989；实验室调查（Lab.Invest.）66:522535，1992）；在经历长期血液透析的患者中观察到的引起腕管综合征的中央神经α2-微球蛋白淀粉样蛋白沉积（吉友（Geyjo）等人，生物化学与生物物理学研究通讯（Biochem.Biophys.Res.Comm.）129:701-706，1985；国际肾脏（Kidney Int.）30:385-390，1986）；在高龄心脏淀粉样蛋白病患者的心脏中观察到的前清蛋白/转甲状腺蛋白淀粉样蛋白；在有家族性淀粉样多发性神经病变患者的末梢神经中观察到的前清蛋白/转甲状腺蛋白的淀粉样蛋白（斯金纳（Skinner）和科恩（Cohen），生物化学与生物物理学研究通讯（Biochem.Biophys.Res.Comm.）99:1326-1332，1981；萨赖瓦（Saraiva），临床化学和医学实验室（J.Lab.Clin.Med.）102:590-603，1983；临床研究杂志（J.Clin.Invest.）74:104-119，1984；田原（Tawara）等人，临床化学和医学实验室（J.Lab.Clin.Med.）98:811-822，1989）。
帕金森病和共核蛋白病
帕金森病是一种神经退行性失调，其病理特征是细胞质内存在路易小体（神经病学手册（Handbuch der Neurologi）中的路易，M.莱万多夫斯基（Lewandowski）编辑，斯普林格（Springer），柏林，第920-933页，1912；泊兰恩（Pollanen）等人，神经病理学和实验神经学杂志（J.Neuropath.Exp.Neurol.）52:183-191，1993），路易小体的主要组分是由α-共核蛋白构成的纤丝（斯皮兰提尼（Spillantini）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）95:6469-6473，1998；新井（Arai）等人，神经科学通讯（Neurosci.Lett.）259:83-86，1999），所述共核蛋白是140个氨基酸的蛋白（上田（Ueda）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）90:11282-11286，1993）。引起家族性早发性帕金森病的α-共核蛋白的两个显性突变已有描述，表明路易小体在帕金森病和相关失调中机制地引起神经元退化（泊里姆罗普洛斯（Polymeropoulos）等人，科学（Science）276:2045-2047，1997；克鲁格（Kruger）等人，自然遗传学（Nature Genet.）18:106-108，1998）。最近，体外研究已经证明重组的α-共核蛋白确实可以形成路易小体样纤丝（康韦（Conway）等人，自然医学（NatureMed.）4:1318-1320，1998；桥本（Hashimoto）等人，大脑研究（Brain Res.）799:301-306，1998；纳赫里（Nahri）等人，生物化学杂志（J.Biol.Chem.）274:9843-9846，1999）。最重要地，两种帕金森病相关的α-共核蛋白突变都会加速这种聚集过程，这证明了这样的体外研究可能与帕金森病的病理发生有相关性。α-共核蛋白聚集和纤丝形成满足了成核依赖性聚合过程的标准（伍德（Wood）等人，生物化学杂志（J.Biol.Chem.）274:19509-19512，1999）。在这一点上，α-共核蛋白的纤丝形成类似于阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白（Aβ）纤丝形成。当在37℃下孵育α-共核蛋白重组蛋白、和非-Aβ组分（称为NAC）（是α-共核蛋白的一种35-氨基酸肽片段）时，两者都具有形成纤丝的能力，并对淀粉样蛋白染色剂例如刚果红（当在偏振光下观察显示红色/绿色双折射）和硫磺素S（显示阳性荧光）是阳性的（桥本（Hashimoto）等人，大脑研究（BrainRes.）799:301-306，1998；上田（Ueda）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）90:11282-11286，1993）。
共核蛋白是一种小的突触前神经蛋白家族，包括α-、β-、γ-共核蛋白，其中，仅有α-共核蛋白聚集物与若干神经疾病相关（伊恩（Ian）等人，临床神经科学研究（Clinical Neurosc.Res.）1:445-455，2001；Trojanowski（东山中夏日）和李（Lee），神经毒理学（Neurotoxicology）23:457-460，2002）。已从若干观察中发展了共核蛋白（并且特别是α-共核蛋白）在多种神经退行性疾病的病因学中的作用。从病理学上来讲，共核蛋白被鉴定作为路易小体的主要组分、帕金森病的标志性内涵物，并且其一个片断是从一种不同的神经性疾病即阿尔茨海默病的淀粉样蛋白斑中分离出来的。从生物化学上来说，重组的α-共核蛋白示出形成纤丝，这概括了从患有路易小体痴呆、帕金森病和多系统萎缩的患者中分离的α-共核蛋白的超微特征。另外，对共核蛋白基因中的突变（虽然只在家族性帕金森病的很少病例中）的鉴定证明了共核蛋白病理和神经退行性疾病之间的明确关系。在一系列疾病例如帕金森病、路易小体痴呆、多系统萎缩症以及阿尔茨海默病的路易小体变体中通常牵涉α-共核蛋白已经导致这些疾病归类于涵盖性术语“共核蛋白病”之下。
帕金森病α-共核蛋白纤丝和阿尔茨海默病的Aβ纤丝，两者都主要由β折叠片结构构成。发现抑制阿尔茨海默病Aβ淀粉样蛋自的纤丝形成的化合物还已示出对抑制α-共核蛋白的纤丝形成是有效的，如在本发明的实例中阐明的。因此这些化合物除了作为针对阿尔茨海默病的治疗剂具有效力之外，还可以用作帕金森病和其他共核蛋白病的治疗剂。
帕金森病和阿尔茨海默病特征是不溶性聚集物的不恰当的积累，所述不溶性聚集物主要由错误折叠的蛋白质构成，所述蛋白质在β-折叠片二级结构中富集（综述于科恩（Cohen）等人，自然（Nature）426:905-909，2003；契迪（Chiti）等人，生物化学年度评论（Annu.Rev.Biochem.），75:333-366，2006）。在帕金森病中，作为路易小体的部分的α-共核蛋白是这些聚集物的主要组分，并在家族性帕金森病中观察到增加它错误折叠和聚集倾向的α-共核蛋白突变（泊里姆罗普洛斯（Polymeropoulos）等人，科学（Science）276:1197-1199，1997；帕帕季米特里乌（Papadimitriou）等人，神经病学（Neurology）52:651-654，1999）。
线粒体的功能异常（确切地是作为在电子传递链的复合物I处损伤的结果）也是帕金森病的一个常见特征（沙皮拉（Schapira）等人，神经化学杂志（J.Neurochem.），54:823-827，1990；综述于格林纳米瑞（Greenamyre）等人，IUBMB生命，52:135-141，2001）。在帕金森病的病因学中，线粒体的亏缺的直接证据首先来自于以下观察：帕金森病毒素N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡症（MPTP）的活性代谢物MPP+（1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶盐）抑制复合物I（尼克拉斯（Nicklas）等人，生命科学（Life Sci.），36:2503-2508，1985）。随后，显示鱼藤酮即另一种复合物I抑制剂是针对α-共核蛋白聚集的改善模型，因为除了在MPTP模型中看到的行为改变和多巴胺能神经元损失之外它还再生了上述的α-共核蛋白-阳性细胞质内聚集物。这一类型的鱼藤酮毒性可见于包括大鼠（贝塔贝特（Betarbet）等人，自然神经科学（Nat.Neurosci.），3:1301-1306，2000；帕诺夫（Panov）等人，生物化学杂志（J.Biol.Chem.），280:42026-42035，2005）、老鼠大脑切片（谢勒（Sherer）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），23:10756-10764，2003；特斯塔（Testa）等人，分子水平脑研究（Mol.Brain Res.），134:109-118，2005），秀丽隐杆线虫（C.elegans）（韦德（Ved）等人，生物化学杂志（J.Biol.Chem.），280:42655-42668，2005）和培养的细胞（谢勒（Sherer）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），22:7006-7015，2002）的多元模型系统中，并已显示是复合物I抑制所导致的增加的氧化性损伤的一个结果。
为了更好地理解氧化性损伤对突变体α-共核蛋白发病机理的关系，在本领域中已建立了成神经细胞瘤细胞系（使用BE-M17细胞），其过量表达A53Tα-共核蛋白。在这些细胞中，A53Tα-共核蛋白响应于多种氧化应激-诱导试剂而聚集，并加强线粒体功能异常和细胞死亡（奥斯托罗洼-戈尔茨（Ostrerova-Golts）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），20:6048-6054，2000）。这些细胞可以经受作为氧化应激诱导物的鱼藤酮处理，并因此尤其对于测试可能抑制α-共核蛋白聚集/纤丝生成的试剂是有用的。
发现和识别作为潜在的治疗来阻止阿尔茨海默病和帕金森病中发生的淀粉样蛋白的形成、沉积、积聚和/或持续的新的化合物或试剂是被竭力寻找的。
发明概述
本发明涉及以下化合物以及这些化合物的其他修饰和衍生物，和它们在治疗淀粉样蛋白病和共核蛋白病中的用途。
本发明的化合物具有以下通式
其中：
R1-3独立地被氢、甲基和苄基基团取代，并且R4被氢或苯基基团取代，其中所述苯基或苄基基团独立地被高达2个选自以下的基团取代：H、OH、F、Cl、Br、葡糖苷酸、硫酸盐、氰基、甲基、NH2、SH、CH2OH、CN、CF3、NHSO2CH3、N（CH3）2、NHCH3、N（CN）2、NHCN、C（CN）3、NH（C=O）NH2、NH（C=O）CH3、（C=NH）NH2、（C=NOH）NH2、O（C=O）OCH3、和NH（C=O）H以及其药学上可接受的盐。
本发明的化合物具有以上通式，其中R1被苄基基团取代，R2或R3独立地被甲基或苄基基团取代，并且R4被氢取代，并且其中这些苄基基团各自被两个羟基基团取代。
本发明的化合物包括但是不局限于以下：
在另一个方面中，本发明是包括本发明的一种化合物和一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物；并且是包括一种药学上可接受的赋形剂和作为仅有的活性成分的本发明的一种化合物的药物组合物。
在另一个方面中，本发明是通过给予一个有效量的本发明的一种化合物（例如为一种药物组合物）治疗一种哺乳动物（尤其是人类）的淀粉样蛋白病或共核蛋白病的方法。
在另一个方面中，本发明是本发明的一种化合物在制造一种用于治疗淀粉样蛋白病或共核蛋白病的药剂中的用途。
在另一个方面中，本发明是本发明的化合物（即具有所述式的这些化合物或以上列出的化合物）的一种制备方法，和/或其药学上可接受的盐的形成方法。
在另一个方面中，本发明是在体外环境治疗Aβ、IAPP、其他淀粉样蛋白、和α-共核蛋白或NAC纤丝生成的方法。所述方法包括将一个有效量的本发明的一种化合物给予到所述体外环境中的步骤。优选地，所述化合物选自以下针对它们对抗Aβ、IAPP、和NAC的活性所述的组中。
还提供了这些化合物的任何药学上可接受的衍生物，包括盐、酯、烯醇醚或酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、溶剂化物、水合物、或前药。
提供了使用这样的化合物和组合物来扰乱、分散和引起β淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝或聚集物的去除、减少或清除的方法，由此提供了对共核蛋白病的新治疗。
还提供了治疗、预防或缓解淀粉样蛋白和共核蛋白疾病或共核蛋白病的一种或多种症状的方法。在一个实施例中，所述方法抑制或预防淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝形成，抑制或预防淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝生长，和/或引起预成形的淀粉样蛋白或α-共核蛋白聚集物以及淀粉样蛋白或α-共核蛋白关联的蛋白质沉积物的分解、破坏、和/或解聚作用。淀粉样蛋白病包括但不局限于阿尔茨海默病、II型糖尿病、全身性AA和朊病毒病。共核蛋白病包括但不局限于：帕金森病、家族性帕金森病、路易小体病、路易小体痴呆、多系统萎缩症和关岛型帕金森症-痴呆复合征。
发明的详细说明
定义
在本申请中，以下术语具有以下含义，无论这些术语在已知领域中的文献或其他地方中的别处是否被不同地使用。
如在此使用，“淀粉样蛋白病”或“淀粉样变性”是与Aβ淀粉样蛋白纤丝的形成、沉积、积聚或持续有关的疾病。这样的疾病包括但不局限于，阿尔茨海默病、唐氏综合征、带有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血、以及大脑β-淀粉样血管病。其他淀粉状蛋白病例如系统性AA淀粉样变性和II型糖尿病的IAPP淀粉样变性也是淀粉状蛋白病。
如在此使用，“共核蛋白疾病”或“共核蛋白病”是与α-共核蛋白纤丝的形成、沉积、积聚或持续有关的疾病。这类疾病包括但不局限于：帕金森病、家族性帕金森病、路易小体病、路易小体痴呆、多系统萎缩症和关岛型帕金森症-痴呆复合征。
“纤丝生成”是指β淀粉样蛋白纤丝、细丝、包含物、沉积物连同α-共核蛋白纤丝、细丝、包含物、沉积物或类似物的形成、沉积、积聚和/或持续。
“纤丝生成的抑制”是指对这样的β-淀粉样蛋白纤丝或α-共核蛋白纤丝样沉积物的形成、沉积、积聚和/或持续的抑制。
“纤丝或纤丝生成的破坏”是指预形成的β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝的破坏，所述β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝通常主要以β折叠片二级结构的形式存在。用在此提供的化合物进行的这种破坏可能与淀粉样蛋白或共核蛋自纤丝的显著减少或分解有关，这可以通过不同方法，如硫磺素T荧光测定、刚果红结合、圆二色光谱、硫磺素S和基于细胞的测定如α-共核蛋白聚集和XTT细胞毒性测定来进行评价，并如通过呈现在本申请中的实例证实的。
“神经保护作用”或“神经保护的”是指一种化合物保护、减少、减轻、缓解、和/或削弱对神经细胞的损害（神经退行性病变）的能力。
“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物两者，如伴侣动物（猫、狗、等）、实验室动物（例如小鼠、大鼠、豚鼠、等），以及农场动物（牛、马、绵羊、山羊、猪、等）。
“药学上可接受的赋形剂”意指常规地用来制备药物组合物的赋形剂，它们通常是安全的、无毒性的和满意的，并且包括兽医使用或人类药剂使用可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体（在气雾组合物的情况下）。
“治疗有效量”是指在给予受试者或动物以治疗疾病时足以影响希望程度的疾病治疗、预防或症状缓解的量。在某些实施例中，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”以一个可测量的量抑制、减少、破坏和分解β-淀粉样蛋白或α-共核蛋自纤丝的形成、沉积、积聚和/或持续，或治疗、预防或缓解与这些病症（例如淀粉样蛋白病或共核蛋白病）有关的疾病的一种或多种症状，在一个实施例中，所述可测量的的量是至少20%，在其他实施例中是至少40%，在其他实施例中是至少60%，并且仍在其他实施例中是至少80%。在此提供的用于治疗哺乳动物受试者的化合物或其组合物的有效量是约0.1到约1000mg/Kg的受试者体重/天，例如，从约1到约100mg/Kg/天，在其他实施例中，从约10到约500mg/Kg/天。广大范围的披露的组合物剂量被认为是既安全又有效的。
术语“持续释放组分”在此定义为有助于活性成分持续释放的一种化合物或多种化合物，包括但不局限于：聚合物、聚合物基质、凝胶、可渗透膜、脂质体、微球、或类似物或它们的组合。
如果所述复合物是水溶性的，那么可以将其配制在适当的缓冲液中，例如磷酸缓冲液、或其他生理学上相容的溶液。可替代地，如果生成的复合物在水性溶剂中的溶解性很差，那么它可以用非离子型表面活性剂，如吐温，或聚乙二醇来配制。因此，作为实例，这些化合物与它们生理学上的溶剂可以配制用于通过吸入和吹入法（通过口或鼻）给药或通过口服、口腔、肠胃外、或直肠给药。
如在此使用，化合物的药学上可接受的衍生物包括它的盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、溶剂化物、水合物或前药。本领域的普通技术人员可以使用针对此类衍生的已知方法很容易制备出这些衍生物。产生的化合物可以给予动物或人而没有明显的毒性作用，并且可以是药学上有活性的或前药。药学上可接受的盐包括但不局限于胺盐，例如但不局限于N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙基胺、1-对-氯苄基-2-吡咯烷-l'-基甲基-苯并咪唑、二乙基胺和其他烷基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不局限于锂、钾和钠盐；碱土金属盐，例如但不局限于钡、钙和镁盐；过渡金属盐，例如但不局限于锌盐；和其他金属盐，例如但不局限于磷酸氢二钠和磷酸二钠；并且还包括但不局限于：无机酸盐，例如但不局限于盐酸盐和硫酸盐；以及有机酸盐，例如但不局限于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和延胡索酸盐。药学上可接受的酯包括，但不局限于酸性基团的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基酯，所述酸性基团包括但不局限于羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亚磺酸、和硼酸。药学上可接受的烯醇醚包括但不局限于：具有式C=C(OR)的衍生物，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。药学上可接受的烯醇酯包括但不局限于：具有式C=C(OC(O)R)的衍生物，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。药学上可接受的溶剂化物和水合物是化合物分子与一个或多个溶剂分子或水分子，或1到约100，或1到约10个，或1到约2、3或4个溶剂分子或水分子的复合物。
如在此使用，治疗是指使疾病或失调的一种或多种症状得到缓解或以另外方式得到有益改变的任何方式。疾病的治疗还包括预防疾病在易患所述病但未患或未表现出所述疾病症状的受试者中发生（预防性冶疗），抑制所述疾病（减慢或阻止所述疾病的发展），提供所述疾病的症状或副作用的减轻（包括减缓治疗），和缓解疾病（使疾病减轻），例如通过破坏预形成的β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝。如在此使用，通过给予具体化合物或药物组合物来缓解具体失调的症状是指任何因为给予所述组合物或与其有关的减轻，无论是永久的还是暂时的，持久的还是短暂的。
如在此使用，认为抑制α-共核蛋白纤丝的形成、沉积、积聚、聚集和/或持续对治疗多种疾病有效，这些疾病涉及α-共核蛋白，如帕金森病、路易小体病和多系统萎缩症。
如在此使用，认为抑制淀粉样蛋白纤丝的形成、沉积、积聚、聚集和/或持续对治疗多种疾病有效，这些疾病涉及淀粉样蛋白，如阿尔茨海默病、II型糖尿病和全身性AA淀粉样变性。
如在此使用，前药是一种化合物，一旦体内给予即通过一个或多个步骤或过程或以其他方式转化成所述化合物的生物学上、药理学上或治疗学上活性的形式。为了产生前药，对药理学上有活性的化合物进行改性，这样使得所述活性化合物可以通过代谢过程再生。所述前药可以被设计为改变药物的代谢稳定性或转运特征，掩盖副作用或毒性，改进药物的味道或改变药物的其他特征或特性。利用体内药效动力学过程和药物代谢知识，一旦已知一种药学上有活性的化合物，本领域的普通技术人员就可以设计出所述化合物的前药（参见，例如，诺格瑞德（Nogrady）（1985）药物化学:生化方法（Medicinal Chemistry ABiochemical Approach），牛津大学出版社，纽约，第388-392页）。
示出了本发明的这些化合物中的一些的化学结构。这些化合物的名称是不同的IUPAC命名[根据已被由有机化学命名法委员会和物理有机化学委员会联盟建立的IUPAC（国际理论与应用化学联合会）系统接受的衍生的名称，如可以在http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac]找到的，通过添加或取代从IUPAC名称衍生的名称（例如通过使用从“苯基”衍生的“3,4-亚甲二氧基苯基”代替“苯并[1，3]二氧戊环-5-基”），衍生自IUPAC名称的名称，以及衍生自反应物的名称的名称。然而，使用的这些名称明确地等同于化学结构，并认为是容易被本领域的普通技术人员理解的。
一种“药学试剂”或“药理学试剂”或“药物组合物”是指用于治疗的一种化合物或化合物的组合，优选地处于纯的或接近纯的形式。在说明书中，药学或药理学试剂包括本发明的这些化合物。这些化合物令人希望地被纯化至80%均一，并且优选地至90%均一。被纯化至99.9%均一的化合物或组合物被认为是有利的。作为一个测试或确认，将产生在HPLC上适合的均一的化合物，被本领域的普通技术人员鉴定为一个单一的锐峰波段。
应理解，在此提供的化合物可以含有手性中心。此类手性中心可以具有（R）或（S）构型，或可以是其混合物。因此，在此提供的化合物可以是对映异构体纯的，或是立体异构体或非对映异构体的混合物。应理解，在此提供的化合物的手性中心在体内可以进行差向异构化。像这样，本领域的普通技术人员会认识到，对于在体内进行差向异构化的化合物来说，给予处于其（R）形式的化合物与给予处于其（S）形式的化合物是等效的。
如在此使用，基本上纯的是指足够均一，以致通过本领域的普通技术人员使用的标准分析方法，例如薄层色谱（TLC）、凝胶电泳、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）不能容易地检测出杂质，或足够纯以致于进一步的纯化不会可检测地改变所述物质的物理和化学特性，例如酶学和生物学活性。纯化化合物以产生化学基本上纯的化合物的方法是本领域的普通技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步的纯化可能会增加化合物的比活性。
如在此使用，除非另有说明，任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写与它们的通常用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会一致（参见（1972）生物化学（Biochem.）11:942-944）。
本发明的化合物
本发明的这些化合物具有以下通式
其中：
R1-3独立地被氢、甲基和苄基基团取代，并且R4被氢或苯基基团取代，其中所述苯基或苄基基团独立地被高达2个选自以下的基团取代：H、OH、F、Cl、Br、葡糖苷酸、硫酸盐、氰基、甲基、NH2、SH、CH2OH、CN、CF3、NHSO2CH3、N(CH3)2、NHCH3、N(CN)2、NHCN、C(CN)3、NH(C=O)NH2、NH(C=O)CH3、(C=NH)NH2、(C=NOH)NH2、O(C=O)OCH3、和NH(C=O)H及其药学上可接受的盐。
本发明的这些化合物选自下组，所述组由以下各项组成：
本发明的这些化合物具有以上所示的化学式，其中R1被一个苄基取代，R2或R3独立地被甲基或苄基基团取代，并且R4被氢取代，并且其中这些苄基各自被两个羟基基团取代。
本发明的这些化合物被并入包含在此披露的本发明的任意化合物和一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
本发明还提供了一种治疗淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝的形成、沉积、积聚、或持续的方法，包括用一个有效量的在此披露的本发明的任意化合物治疗所述纤丝。
本发明还提供了一种治疗患上一种淀粉样蛋白病或一种共核蛋白病的哺乳动物的方法，该方法包括给予治疗有效量的在此披露的本发明的任意化合物。
本发明提供：所述淀粉样蛋白病选自下组，所述组由以下各项组成：阿尔茨海默病、II型糖尿病、系统性AA淀粉样变性、唐氏综合征、带有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血、以及大脑β-淀粉样血管病。
本发明提供：所述淀粉样蛋白病是阿尔茨海默病。
本发明提供：所述共核蛋白病选自下组，所述组由以下各项组成：帕金森病、家族性帕金森病、以及路易小体病、阿尔茨海默病的路易小体变异、路易小体痴呆、多系统萎缩症、以及关岛型帕金森症-痴呆复合征。
本发明提供：所述共核蛋白病是帕金森病。
本发明提供：在治疗一种淀粉样蛋白病或一种共核蛋白病的方法中本发明的化合物是以在0.1mg/Kg/天和1000mg/Kg/天之间的一个量给予的。
本发明提供：在治疗一种淀粉样蛋白病或一种共核蛋白病的方法中本发明的化合物是以在1mg/Kg/天和100mg/Kg/天之间的一个量给予的。
本发明提供：在治疗一种淀粉样蛋白病或一种共核蛋白病的方法中本发明的化合物是以在10mg/Kg/天和100mg/Kg/天之间的一个量给予的。
本发明还提供了一种制造物品，包括包装材料、被包含在包装材料之中的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，其被用于治疗β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝和/或聚集物的形成、沉积、积聚、或持续，并且还包括一个标签，该标签指示所述化合物或其药学上可接受的盐是用于治疗β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝和/或聚集物的形成、沉积、积聚、或持续。
本发明的这些化合物选自但不局限于以下的化合物：
本发明的化合物的合成
本发明的化合物可以通过本领域的普通技术人员普遍已知的方法在考虑到这些知识和本申请的披露内容（包括实例1）的情况下进行制备。
在制备这些化合物中使用的起始材料和试剂是从以下商业供应方可获得的：如奥尔德里奇化学公司（密尔沃基，WI），巴赫姆（Bachem）（托伦斯，CA），西格玛（圣路易斯，MO），或兰卡斯特合成公司（温德汉姆，NH），或是通过本领域的普通技术人员熟知的方法遵循在如下参考文献中描述的程序制备的：如费塞尔（Fieser）和费塞尔氏（Fieser’s）有机合成试剂（Reagents forOrganic Synthesis），1-17卷，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY，1991；罗德氏碳化合物化学（Rodd’s Chemistry of Carbon化合物），1-5卷和增刊，塞维尔科学出版社，1989；有机反应（Organic Reactions），1-40卷，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY，1991；玛奇（March）J.:高等有机化学（Advanced OrganicChemistry），第四版，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY；和拉罗克（Larock）:有机官能团转换（Comprehensive Organic Transformations），VCH出版社，纽约，1989。
在大多数情况下，引进羟基的保护基团并最后将其除去。合适的保护基团是在格林（Greene）等人，有机合成中的保护基团（Protective Groups in OrganicSynthesis），第二版，约翰·威利父子出版公司，纽约，1991中描述的。其他起始材料或早期中间体可通过以上列出的材料的精制进行制备，例如通过本领域的普通技术人员熟知的方法。
本发明的这些起始材料、中间体和化合物可使用常规技术，包括沉淀、过滤、蒸馏、结晶、色谱法等进行分离和纯化。可以使用常规的方法，包括物理常数、光谱方法对化合物进行表征。
药理学和用途
在此提供的化合物能够用作，例如用于以衍生自无机酸或有机酸的药学上可接受的盐的形式给药，或与一种或多种药学上可接受的赋形剂联合使用。短语“药学上可接受的盐”是指在正确医学判断范围内适于与组织接触使用的而没有不当毒性、刺激性、过敏反应等，且具有合理效益/风险比率的那些盐。这些药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。这些盐可以在对在此提供的化合物进行最后分离和纯化期间来原位制备，也可以通过分别使酸性的或碱性的药品与合适的碱或酸反应来制备。衍生自有机酸或无机酸的典型盐包括但不局限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、葡萄糖酸盐、延胡索酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、草酸盐、软酯酸酯、果胶盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐和碳酸氢盐。衍生自有机碱或无机碱的典型盐包括但不局限于锂、钠、钾、钙、镁、铵、单烷基铵和葡甲胺、二烷基铵、三烷基铵、四烷基铵。
为了在特定患者处获得有效治疗的反应，此处所提供的药物组合物的活性成分的实际剂量水平和给药方式可以变化。短语“治疗有效量”的在此提供的化合物是指当以合理的效益/风险比率应用于任何医学治疗时足以治疗失调的化合物的量。然而，应理解的是，所提供的化合物以及组合物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断的范围内决定。在此提供的化合物的总的日剂量可以在约0.1到约1000mg/kg/天的范围。对于口服的目的，剂量可以在约1到约500mg/kg/天的范围内。如果需要的话，出于给予的目的，可以将有效日剂量分成多个剂量；因而，单剂量的组合物可以含有可构成日剂量的量、或其多个亚剂量。对于任意特定的患者而言，所述特定的治疗有效量水平将取决于很多因素，包括治疗的失调和失调的严重性，患者的病史，采用的具体化合物的活性，采用的具体组合物，患者的年龄、体重、总的健康状况、性别和饮食，给药的时间，给药的途径，治疗持续的时间，采用的具体化合物的排出率，与使用的具体化合物联合使用或同时使用的药物等。
所提供的化合物可以与一种或多种无毒性的药学上可接受的稀释剂、载体、佐剂、以及抗细菌和抗真菌试剂如羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等一起配制。例如可以通过使用一种包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所要求的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在某些情况下，为了延长药物的效果，降低皮下或肌肉注射的药物的吸收率是理想的。这可以通过将水晶的或无定形的药物物质悬浮于像油这样的水溶性较差的媒介物中来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体大小以及晶型。注射药物形式的延长吸收可以通过使用吸收延迟试剂如单硬脂酸铝或明胶来实现。
在此提供的化合物可以按固体或液体的形式通过肠道或肠胃外方式给药。适合于肠胃外注射的组合物可以包含生理学上可接受的、等渗无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳状液和用于在无菌的可注射溶液或分散液中重建的无菌干粉。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇（丙二醇、聚乙二醇、甘油等）、植物油（如橄榄油）、可注射有机酯（如油酸乙酯）、及其合适的混合物。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。除了含有活性化合物外，悬浮液还可以含有悬浮试剂，如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝（aluminum metahydroxide）、膨润土（bentonite）、琼脂和黄芪胶、或这些物质的混合物。
在此提供的化合物也可以通过皮下或静脉内、或肌肉内、或胸骨内、或鼻内注射或输注给药，或以无菌可注射的水或油的悬浮液的形式通过输注技术给药。所述化合物可以处于无菌可注射的水或油的悬浮液的形式。这些悬浮液可以根据本领域公知的方法使用上文所述的湿润剂和悬浮剂进行合适分散来配制。无菌可注射的制品还可以是在非毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的一种溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液、和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油惯例上用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可采用任何一种温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，发现脂肪酸（如油酸）可用于注射剂的制品中。可以对给药方案进行调节以提供最适宜的治疗反应。例如，每天可服用几个分开剂量，或可以按治疗状况的紧急程度按比例地减少剂量。
可注射的长效形式为通过在生物可降解的聚合物（例如聚丙交酯-聚乙交酯）中形成药物的微胶囊基质而实现。取决于药物对聚合物的比率以及所使用的特定聚合物的性质，可以对药物释放的速率进行控制。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。长效可注射制剂还通过将药物包陷入和人体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射的制剂可例如通过细菌阻挡滤膜过滤、或将灭菌剂以无菌的固体组合物（它们在使用前可溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中）的形式加入而进行杀菌。
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末、以及颗粒。在此类固体剂型中，所述活性化合物可以与以下混合：至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a）填充剂或者增充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇以及硅酸；b）粘合剂如羧甲纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、以及阿拉伯胶；c）保湿剂如甘油；d）崩解剂如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠；e）溶液阻滞剂如石蜡；f）吸收促进剂如季铵化合物；g）湿润剂如十六醇以及甘油单硬脂酸酯；h）吸收剂如高岭土以及膨润土以及i）润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，及其化合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包括缓冲剂。一种相似类型的固体组合物还可以在使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量的聚乙二醇等的软和硬填充胶囊中被用作填充剂。
片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂以及粒剂的固体剂型可以用包衣和包壳，如肠溶包衣以及其他的在药物配制领域中熟知的包衣来制备。它们可以可任选地包含遮光剂并且还可以是一种组合物，所述组合物在所述肠道的某一部分可任选地以一种延迟的方式仅或者优先释放一种或多种活性成分。
可利用的嵌入式组合物的实例包括聚合物质以及蜡。片剂含有化合物和与其混合的非毒性的、药学上可接受的、适于制备片剂的赋形剂。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释液，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和分解试剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，例如玉米淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁或硬脂酸或tale。片剂可以没有涂层，也可以用已知的技术对片剂进行涂层以延迟在胃肠道中的分解和吸收，从而提供延长时间内的持续作用。例如，可以采用延时材料，如硬脂酸单甘油脂或二硬脂酸甘油脂。口服使用的制剂也可以是硬的明胶胶囊，其中所述化合物与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，口服使用的制剂也可以是软的明胶胶囊，其中所述活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
用于口服给予的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除活性化合物之外，液体剂型可包括本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂以及乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类（具体地，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、以及芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性的稀释剂之外，口服组合物还可包括辅助剂，例如湿润剂、乳化以及助悬剂、甜味剂、调料、以及芳香剂。
可配制其他口服递送系统，如处于液体或球剂形式的自微乳化药物递送系统（SMEDDS）（如对于姜黄素开发的那些），所述药物递送系统导致水溶性差的化合物的溶解度、溶解以及体内口服吸收的改善。（欧洲药剂和生物药剂学杂志（European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics）76（2010）475-485）
水性悬浮液含有化合物并混有适于制备水性悬浮液的赋形剂。这种赋形剂是悬浮试剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散和湿润试剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物例如硬脂酸聚氧乙烯酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七烷乙烯氧基十六烷醇，或环氧乙烷与脂肪酸（如己糖醇）的偏酯的缩合产物例如油酸聚氧乙烯山梨糖醇酯，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐的偏醋的缩合产物例如单油酸聚氧乙烯山梨聚糖酯。所述水性悬浮液还可以含有一种或多种保护剂，例如对-苯甲酸乙酯或正丙酯，或一种或多种着色剂，一种或多种调味剂、或一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
可以通过将化合物悬浮于植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油、或椰子油；或矿物油，如液体石蜡中来配制油悬浮液。所述油悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以添加如下文所述的甜味剂，和调味剂来提供美味的口服制品。这些组合物可以通过加入抗氧化剂，如抗坏血酸维生素C来保存。适于通过加入水来制备水悬浮液的可分散粉剂和粒剂提供活性成分和混合的分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂。上文己描述的那些对合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂进行了示例。也可以存在其他的赋形剂，例如甜味剂、调味剂。
在此提供的化合物也可以是水包油的乳剂形式。所述油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油；或矿物油，例如液态石蜡或这些物质的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和或衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯，例如单油酸山梨聚糖，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯单油酸山梨聚糖。所述乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。可以用甜味剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖来配制糖浆和酏剂。这种制剂还可以含有润药剂、防腐剂和调味剂和着色剂。
在一个实施例中，为方便给药和统一剂量，将所述化合物配制成剂量单位形式。如在此使用，剂量单位形式是指适于待治疗的受试者使用的单一剂量的物理学上分开的单元；每一个单位含有一个治疗有效量的所述化合物和至少一种药用赋形剂。一种药物产品将包括在一个容器内的一个剂量单位形式，其标注或伴随了一个标签，所述标签指示预期的治疗方法，如治疗与α-共核蛋白纤丝形成相关的一种疾病如帕金森病。直肠或阴道给予的组合物优选是栓剂，其可通过将本发明的化合物与适当的非刺激性赋形剂或载体（例如，可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在室温下为固体但在体温下为液体并且因此可在直肠或阴道空腔中融化并释放出活性化合物）相混合来制备。
在此提供的化合物还可以按脂质体的形式给药。形成脂质体的方法是本领域内已知的（普莱斯考特（Prescott）编辑，细胞生物学方法（Methods in CellBiology）l976，卷XIV，学术出版社，纽约，N.Y.）。如本领域已知的，脂质体通常源于磷脂或其他脂质物质。脂质体由单层或多层分散于水介质中的含水液晶形成。任何能够形成脂质体的非毒性的、生理学上可接受的且可代谢的脂质均可以使用。除了在此提供的化合物外，本发明的脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱（卵磷脂）。
在此提供的化合物或其药学上可接受的衍生物可以配制来靶向某一特定的组织、受体、或受治疗的患者的身体的其他区域。许多这样的靶向方法是本领域技术人员熟知的。所有这样的靶向方法在此都预期用于本发明的组合物中。对于靶向方法的非限制实例，见例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一个实施例中，包含组织靶向脂质体，如肿瘤靶向脂质体的脂质体悬浮液也适合于作为药学上可接受的载体。这可以按本领域的普通技术人员所已知的方法来制备。例如，可以按美国专利号4,522,811中描述的来制备脂质体制剂。简单地说，脂质体如多层囊泡（MLV's）（multilamellar vesicle）可以通过将鸡蛋卵磷脂和脑磷脂酰丝氨酸（7:3的摩尔比）滴在烧瓶的内面上干燥来形成。加入溶于没有二价阳离子的磷酸缓冲液（PBS）的在此提供的化合物的溶液，并且摇动烧瓶直至脂质薄膜分散。清洗产生的囊泡以除去未形成胶囊的化合物，离心沉淀，并且然后重悬于PBS中。
持续释放制剂
还披露了，本发明也包括持续释放制剂以高循环水平（在10-9和10-4M之间）将本发明的化合物递送至希望的靶标（即大脑或全身器官）的用途。在针对帕金森病的治疗的一个优选实施例中，化合物的循环水平被维持在高达10-7M。所述水平在患者全身循环以或在一个优选实施例中，呈现在大脑组织中，并且在一个最优选实施例中，被定位至大脑或其他组织中的α-共核蛋白纤丝沉积物。
应理解，化合物水平被如所希望维持某一个时间段，并可以容易地被本领域普通技术人员使用所述披露和本发明的化合物所确定。在一个优选实施例中，本发明包括给药的一个独特的特征，包括一种持续释放制剂，这样使得在血清中在48至96小时之间维持了10-8和10-6M之间的恒定水平的治疗化合物。
这种持续释放和/或定时释放制剂可以通过递送装置的持续释放手段来制造，所述递送装置是本领域普通技术人员熟知的，如美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；4,710,384；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556和5,733,566中所描述的那些,它们的披露内容通过引用各自结合在此。通过使用例如羟丙甲基纤维素、其他聚合基质、凝胶、渗透膜、渗透性系统、多层涂料、微颗粒、脂质体、微球等，这些药学组合物可以用来提供一种或多种活性化合物的缓慢或持续释放。本领域的普通技术人员所熟知的合适的持续释放制剂，包括此处所述的那些，可以很容易地选择来与本发明的药物组合物一起使用。因此，适于口服的单一单位剂型，例如但不局限于片剂、胶囊、软胶囊、囊片、粉剂等适于持续释放的被本发明所囊括。
在一个优选实施例中，所述持续释放制剂含有活性化合物，例如但不局限于微晶纤维素、麦芽糖糊精、乙基纤维素和硬脂酸镁。如以上所述的，与所披露的化合物的性质兼容的用于胶囊化的所有已知的方法都被本发明所囊括。所述持续释放制剂被本发明的药物组合物的涂层颗粒或颗粒（具有不同厚度的缓慢可溶性聚合物）胶囊化，或通过微胶囊化被胶囊化。在一个优选实施例中，用允许所述药物组合物在给予哺乳动物后约48到约72小时分解的不同厚度的（例如，约1微米到约200微米）的涂层材料对所述持续释放制剂进行胶囊化。在一个具体实施例中，该涂层材料是可食用添加剂。
在另一个实施例中，所述持续释放制剂是基质分解装置，其通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体压成片剂而制备。在一个优选实施例中，所述涂层颗粒的尺寸范围为约0.1到约300微米之间，如在美国专利号4,710,384和5,354,556中披露的，将其通过引用以其全文结合在此。这些颗粒的每一个都是微基质的形式，且所述活性成分均一地分布于整个聚合物中。
为了产生足够的弹性以阻止在压缩过程中大量渗漏，公开了在涂层中含有相对高百分含量的可塑剂的持续释放制剂，如美国专利4,710,384所述的制剂，将其通过引用以其全文结合在此。可塑剂的具体量依据所使用的涂层的特性和具体可塑剂而变化。通过测试所形成的片剂的释放特性可以很容易地经验性地确定所述含量。如果药剂释放的太快，那么就要使用更多的可塑剂。释放特性也是所述涂层的厚度的一个功能。当使用大量的可塑剂时，所述涂层的持续释放量减少。因此，可以稍微增加涂层的厚度来补偿可塑剂含量的增加。通常，在这样一个实施例中的可塑剂将以涂层中持续释放材料的约15%至30%的量呈现，优选地以20%至25%，并且所述涂层的量将是所述活性材料的按重量计的从10%至25%，优选地15%至20%。任何常规的药学上可接受的可塑剂均可以掺入到所述涂料中。
本发明的化合物可被配制为一种持续释放和/或定时释放制剂。所有持续释放的药物产物都具有一个共同的目标，即改进药物疗法而超过它们的非持续的对应物所达到的疗效。理想地，最优设计的持续释放制剂在医学治疗中的应用的特征为采用的最少量的药物物质来治愈或控制病症。持续释放的制剂的优点可以包括1）延长组合物的活性，2）降低给药频率，以及3）提高患者的依从性。此外，持续释放剂可以用来影响开始作用的时间或其他特征，如组合物的血液水平，并因此可以影响副作用的发生。
本发明的持续释放制剂被设计来在最初时释放立即产生所需治疗效果量的治疗组合物，然后逐渐的病继续释放另外量的组合物以在延长的一段时间内维持的这种治疗效果水平。为了维持体内的这种恒定的水平，所述治疗组合物必须以一定的速率从剂型中释放，以替代被代谢的和从体内排泄的组合物。
活性成分的持续释放可以用各种诱导剂刺激，例如pH、温度、酶、水、或其他生理状况或化合物。在本发明的背景下术语“持续释放组分”在此定义为有利于活性成分持续释放的一种化合物或多种化合物，包括但不局限于：聚合物、聚合基质、凝胶、渗透膜、脂质体、微球等或它们的组合。
如果所述复合物是水溶性的，那么可以将其配制在任何合适的缓冲液中，例如磷酸缓冲盐水、或其他生理学上相容的溶液。可选择地，如果产生的复合物在水性溶剂中的溶解性很差，那么它可以用非离子型表面活性剂如吐温（Tween）或聚乙二醇来配制。这样，所述化合物与它们生理学上相容的溶剂可以配制为通过吸入和吹入法（通过口或鼻）给药或通过口服、口腔、肠胃外、或直肠给药。
可以适当地配制口服制剂以使活性化合物能够可控制地释放。在一个优选实施例中，本发明的化合物被配制为离散的微粒的控制释放粉剂，其可以被更容易地以液体形式配制。所述持续释放的粉剂包括含有活性成分的颗粒和（任选地）至少一种非毒性聚合物赋形剂。
所述粉剂能够分散或悬浮在液体媒介物中，且会在有用的一段时间内维持其持续释放特征。这些分散剂或悬浮液既有化学稳定性，又有分解速率稳定性。所述粉剂可以含有赋形剂，所述赋形剂包含聚合物，可以是可溶的、不溶的、渗透性的、不渗透性的、或生物可降解的。所述聚合物可以是多聚物或共聚物。所述聚合物可以是天然的或合成的聚合物。天然的聚合物包括多肽（例如，玉米蛋白）、多糖（例如，纤维素）、和褐藻酸。代表性的合成聚合物包括但不局限于美国专利号5,354,556的第3栏第33-45行所描述的那些聚合物，将其通过引用以其全文结合在此。特别合适的聚合物包括但不局限于美国专利号5,354,556第3栏第46行到第4栏第8行所描述的那些聚合物，将其通过引用以其全文结合。
本发明的持续释放化合物可以配制成供肠胃外给药，例如通过肌肉内注射或通过皮下组织和各种体腔和透皮装置移植。在一个具体实施例中，将肌肉内注射液配制成水或油悬浮液。在水性悬浮液中，持续释放效果部分地是由于所述活性化合物在复合时溶解性降低或分解速率降低。使用油悬浮液和溶液也可以进行相似的方法，其中所述活性化合物的释放速率由油外的所述活性化合物向周围的水性介质的分散来测定。只有仅具有油可溶性且具有理想的分散特征的活性化合物才是合适的。可以用于肌肉内注射油包括但不局限于：芝麻油、橄榄油、花生油、玉米油、杏仁油、大豆油、棉籽油和蓖麻油。
已发展成熟、能赋予几天到几年的持续释放的药物递送形式是将承载药物的聚合装置植入到皮下或各种体腔内。在一种植入物中使用的聚合物材料，其必须是生物相容的和无毒性的，包括但不局限于水凝胶、有机硅、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、或可生物降解的聚合物。
实例
实例1：本发明的这些化合物的合成
本发明的这些化合物可以通过本领域的普通技术人员普遍已知的方法在考虑到这些知识和本申请的披露（包括以下呈现的实例）的情况下进行制备。
在制备这些化合物中使用的起始材料和试剂是可从以下商业供应方获得的：如奥尔德里奇化学公司（密尔沃基，WI），巴赫姆（Bachem）（托伦斯，CA），西格玛（圣路易斯，MO），或兰卡斯特合成公司（温德汉姆，NH），或是通过本领域的普通技术人员熟知的方法遵循在如下参考文献中描述的程序制备的：如费塞尔（Fieser）和费塞尔氏（Fieser’s）有机合成试剂（Reagents forOrganic Synthesis），1-17卷，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY，1991；罗德氏碳化合物化学（Rodd’s Chemistry of Carbon化合物），1-5卷和增刊，塞维尔科学出版社，1989；有机反应（Organic Reactions），1-40卷，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY，1991；玛奇（March）J.:高等有机化学（Advanced OrganicChemistry），第四版，约翰·威利父子出版公司，纽约，NY；和拉罗克（Larock）:有机官能团转换（Comprehensive Organic Transformations），VCH出版社，纽约，1989。
3,4-(双苄氧基)苯甲酸苄酯：
将无水碳酸钾（10.9g，79.5mmol）添加至3,4-二羟基苯甲酸（3.5g，22.7mmol）于无水DMF（100ml）中的溶液中，接着添加苄基氯（8.8g，69.2mmol）。将所得悬浮液在60℃在氩气下搅拌过夜。将所述反应混合物倾倒入水（150ml）中，并且用乙酸乙酯（3x50ml）进行萃取。将合并的有机萃取物用水、盐水溶液（各50ml）洗涤，并且用无水硫酸镁干燥。在减压下将溶剂除去。产量=9.4g，98%产率。PRO-04-35。
3,4-(双苄氧基)苯甲醇：
将3,4-(双苄氧基)苯甲酸苄酯（lot#PRO-04-35，9.0g，21.2mmol）于60ml无水醚中的溶液滴加至氢化铝锂（0.89g，23.31mmol）于醚（30ml）中的悬浮液中。在三小时之后通过缓慢添加水合的硫酸钠将所述反应混合物淬灭。在搅拌三十分钟之后将所述反应混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以产生为一种呈白色固体的醇。PRO-04-36A，6.3g，93%产率。
3,4-(双苄氧基)苄基氯：
在室温下将3,4-(双苄氧基)苯甲醇（Lot#PRO-04-36A，6.0g，18.7mmol）添加至亚硫酰氯（12ml）和DMF（0.2ml）中并将所述反应混合物加热至60℃持续2小时。在减压下去除过量的亚硫酰氯。将黄色残余物溶解于在己烷中的20%乙酸乙酯里并使其通过硅胶短床。将所述硅胶用在己烷（200ml）中的20%乙酸乙酯冲洗。将合并的洗液在减压下浓缩以产生所希望的呈黄色固体的氯化物，PRO-04-36B，5.1g，81%产率。
3-甲基-1,7-双(3',4'-二羟基苄基)黄嘌呤：
将3-甲基黄嘌呤（200mg，1.2mmol）于N,N-二甲基甲酰胺（5ml）中的溶液用3,4-双-苄氧基-苄基氯（Lot#PRO-04-36B，1.02g，3mmol）和NaH（96mg，4mmol）以及0.5当量碘化四丁基铵进行处理并加热至60℃持续12小时。将所述反应混合物倾倒入水中，并且用乙酸乙酯（3x30ml）进行萃取。将合并的有机萃取物用水、盐水溶液（各30ml）洗涤，并且用无水硫酸镁干燥。将所述溶剂在减压下去除并将所述产物通过快速柱色谱法在硅胶上使用40%乙酸乙酯/己烷进行纯化，以产生希望的产物，600mg，78%产率。将这一产物溶解在乙酸乙酯（25ml）和甲醇（10ml）以及乙酸（1ml）中并在10%Pd-C存在下在55PSI氢化2小时。将催化剂滤出并且将溶剂在减压下去除。所述残余物在硅胶柱上用在己烷中50%乙酸乙酯至100%乙酸乙酯洗脱来进行纯化。将希望的呈灰白色固体的产物分离，产量=400mg PD151。
7-甲基-1,3-双(3',4'-二羟基)苄基黄嘌呤：
7-甲基-1,3-双(3',4'-二羟基)苄基黄嘌呤是遵循在先前实验中所述的一般程序从7-甲基黄嘌呤（200mg，1.2mmol）合成的。产量150mg PD150。
1-甲基-1,3-双(3',4'-二羟基)苄基黄嘌呤：
1-甲基-1,3-双(3',4'-二羟基)苄基黄嘌呤是遵循在先前实验中所述的一般程序从1-甲基黄嘌呤（200mg，1.2mmol）合成的。产量200mg PD152。
8-溴-3-甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基黄嘌呤：
将3-甲基-8-溴黄嘌呤（294mg，1.2mmol）在N,N-二甲基甲酰胺（5ml）中的溶液添加至NaH（96mg，4mmol）、3,4-双-苄氧基-苄基氯（Lot#PRO-04-36B，1.02g，3mmol）和碘化四丁铵（0.5当量）中。将所述溶液加热至60℃持续12小时。将所述反应混合物倾倒入水中，并且用乙酸乙酯（3x30ml）进行萃取。将合并的有机萃取物用水、盐水溶液（各30ml）洗涤，并且用无水硫酸镁干燥。将所述溶剂在减压下去除并将所述产物通过快速柱色谱法在硅胶上使用40%乙酸乙酯/己烷进行纯化，以产生希望的产物，511mg，78%产率。
8-溴-1,3-二甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基黄嘌呤
将8-溴-3-甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基黄嘌呤（511mg；0.94mmol）和甲基碘（426mg；3mmol）于N,N-二甲基甲酰胺（5ml）中的溶液添加至碳酸钾（138mg；1.0mmol）中，并加热至60℃持续6小时。将所述反应混合物倾倒入水（25ml）中，并且用乙酸乙酯（3x25ml）进行萃取。将合并的萃取物用无水硫酸镁进行干燥并在减压下浓缩。将所述产物通过快速色谱法在硅胶上用30%乙酸乙酯/己烷洗脱来进行纯化，以产生希望的产物。535mg，95%PRO-04-42
1，3-二甲基-7-(3’,4’-二苄氧基)苄基-8-(3',4'-二甲氧基苯基)黄嘌呤
将8-溴-1，3-二甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基黄嘌呤（535mg，0.95mmol）和3,4-二甲氧基苯基硼酸（182mg；1mmol）于1,4-二噁烷（5ml）中的溶液用四(三苯基膦)合钯（0）（77mg，0.1mmol）和碳酸钾（277mg，2mmol）处理。在氩气氛下将所述混合物加热至70℃持续12小时。将所述反应混合物在减压下进行浓缩。所述残余物在硅胶柱上用在己烷中40%乙酸乙酯至70%乙酸乙酯洗脱来进行纯化。将希望的呈灰白色固体的产物分离，产量500mg，81%PRO-04-43。
1,3-二甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基-8-(3',4'-二羟基苯基)黄嘌呤
在-70℃下将三溴化硼（1.62g；6.48mmol）添加至1,3-二甲基-7-(3',4'-二苄氧基)苄基-8-(3',4'-二甲氧基苯基)黄嘌呤（500mg，0.81mmol）于无水二氯甲烷（12ml）中的溶液中。在1小时之后，将所述反应混合物升温至室温并搅拌6小时。添加甲醇（3ml）并将所述反应混合物搅拌过夜。将所述反应混合物在减压下进行浓缩。所述残余物在硅胶柱上用70%乙酸乙酯/己烷至100%乙酸乙酯洗脱来进行纯化。将希望的呈灰白色固体的产物分离，产量110mg；26%PD154。
8-溴-1,3,7-三甲基-黄嘌呤
将8-溴-3-甲基黄嘌呤（300mg；1.2mmol）和甲基碘（1.42g；10.0mmol）于N,N-二甲基甲酰胺（5ml）中的溶液添加至碳酸钾（662mg；4.8mmol）中，并加热至60℃持续6小时。将所述反应混合物倾倒入水（25ml）中，并且用乙酸乙酯（3x25ml）进行萃取。将合并的萃取物用无水硫酸镁进行干燥并在减压下浓缩。将所述产物通过快速色谱法在硅胶上用乙酸乙酯洗脱来进行纯化，以产生希望的产物。315mg；92%PRO-04-45
1,3,7-三甲基-8-(3’,4’-二甲氧基苯基)黄嘌呤：
将8-溴-1,3,7-三甲基黄嘌呤（315mg，1.15mmol）和3,4-二甲氧基苯基硼酸（230mg；1.26mmol）于1,4-二噁烷（5ml）中的溶液用四(三苯基膦)合钯（0）（88mg，0.14mmol）和碳酸钾（277mg，2.0mmol）处理。在氩气氛中将所述混合物加热至70℃持续12小时。将所述反应混合物在减压下进行浓缩。所述残余物在硅胶柱上用在己烷中70%乙酸乙酯至100%乙酸乙酯洗脱来进行纯化。将希望的呈灰白色固体的产物分离，产量297mg，78%PRO-04-46。
1,3,7-三甲基-8-(3',4'-二羟基苯基)黄嘌呤：
在-70℃下将三溴化硼（1.62g；6.48mmol）添加至1,3,7-三甲基-8-(3',4'-二甲氧基苯基)黄嘌呤（297mg，0.90mmol）于无水二氯甲烷（12ml）中的溶液中。在1小时之后，将所述反应混合物升温至室温并搅拌6小时。添加甲醇（3ml）并将所述反应混合物搅拌过夜。将所述反应混合物在减压下进行浓缩。所述残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯洗脱来进行纯化。将希望的呈灰白色固体的产物分离，产量210mg；82%PD153。
实例2：化合物破坏/抑制预聚集的帕金森病α-共核蛋白纤丝
发现这些化合物是α-共核蛋白纤丝的破坏者/解聚者。在这一系列的研究中，分析了此处提供的某些化合物引起帕金森病的预形成的纤丝（即由α-共核蛋白纤丝构成）分解/破坏/解聚的效力。对于在以下的部分A和B中所述的研究，首先将在pH4的20mM乙酸钠缓冲液中的69μM的α-共核蛋白（r肽，Bogart公司，加利福尼亚州）在37℃下在圆周振荡下（1,300rpm）孵育4天以引起α-共核蛋白聚集和纤丝形成。
部分A：硫磺素T荧光测定
在一项研究中，使用硫磺素T荧光测定来确定这些化合物对α-共核蛋白纤丝的影响。除了测试化合物，本实验还包括用于参照的三种对照化合物（化合物1、2和3）。在这个测定中，硫磺素T特异性地结合纤丝蛋白，并且这种结合产生在485nm处的荧光增强，这种增强与形成的纤丝的量成正比。荧光越强，形成的纤丝的量就越大（纳基（Naki）等人，实验室研究（Lab.Invest.）65:104-110，1991；莱文（Levine）III，蛋白质科学（Protein Sci.）2:404-410，1993；淀粉样蛋白：国际实验和临床研究杂志（Amyloid:J.Exp.Clin.Invest.）2:1-6，1995）。
如以上所述，在最初的α-共核蛋白纤丝化之后，然后在单独或存在这些化合物中的一种的情况下（在测试化合物:α-共核蛋白摩尔比率为10:1、1:1、0.1:1、和0.01:1下），将在磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）中+0.02%叠氮化钠中的所述α-共核蛋白（6.9μM）混合物在37℃在振荡（200rpm）下孵育2天。在共孵育2天之后，将50μl（5μg）的每份孵育混合物转移到包含150μl蒸馏水和50μl硫磺素T溶液（即在250mM磷酸缓冲液中500μM硫磺素T，pH6.8）的96-孔微量滴定板中。硫磺素T试剂的终浓度是在50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）中100μM。使用ELISA平板荧光计读取485nm（444nm的激发波长）处的荧光值。减去从稀释的反应（空白）中获得的信号（所述稀释的反应包含单独的缓冲液或单独的化合物，单独的缓冲液或单独的化合物的浓度等价于它相应的包含α-共核蛋白的反应中的浓度）来定量在每个包含α-共核蛋白的反应中硫磺素T荧光的量，这与在那个反应中的蛋白质纤丝含量是成比例的。
2-天孵育的结果在以下呈现。对于每种化合物，硫磺素T荧光的%抑制示于表1中。这一研究指示在此提供的化合物破坏/解聚预形成的帕金森病α-共核蛋白纤丝。
表1：化合物破坏/解聚α-共核蛋白聚集物，如通过硫磺素T荧光测定来测量的。
部分B：刚果红结合数据
在刚果红结合测定中，量化了给定的测试化合物改变α-共核蛋白聚集物结合至刚果红的能力。在这个测定中，刚果红特异性结合纤丝蛋白，并且这种结合与形成的纤丝的量成正比。如以上所述，在最初的α-共核蛋白纤丝化之后，将α-共核蛋白聚集物和测试化合物孵育2天，并且然后通过0.2μm滤器进行真空过滤。在用刚果红对滤器进行染色后，对留在滤器上的α-共核蛋白的量进行定量。在适当的洗涤所述滤器之后，在所述测试化合物的存在下滤器上的刚果红颜色的任何降低（与不存在所述测试化合物时所述蛋白的刚果红染色相比-即仅存在α-共核蛋白）都指示所述测试化合物的以下能力：减少/改变聚集的和嗜刚果红的α-共核蛋白的量，并因此引起α-共核蛋白纤丝的分解/破坏/解聚。
在一个研究中，在2-天α-共核蛋白孵育之后，在不存在或存在增加量的在此提供的化合物（包括阳性参考（对照）化合物（以化合物:α-共核蛋白摩尔比为10:1、1:1、0.1:1、0.01:1））的情况下，确定了α-共核蛋白纤丝结合刚果红的能力。2-天孵育的结果呈现在下表2中。这一研究的结果表明：本发明的化合物破坏/解聚/分解预形成的α-共核蛋白聚集物，如通过它们抑制帕金森病型α-共核蛋白纤丝结合至刚果红的能力所指示的。
表2化合物破坏/解聚α-共核蛋白纤丝/聚集物，如通过刚果红结合测定所测量的。
实例3：化合物破坏/抑制新溶解的帕金森病α-共核蛋白蛋白形成纤丝（即β- 片二级结构）
硫磺素T荧光测定
为测试这些化合物是否能抑制α-共核蛋白β-片的形成，利用如在实例2中所述的相同的测定，但所述α-共核蛋白是新鲜的并且不是预纤丝化的。将新鲜的野生型α-共核蛋白溶解于包含9.5mM磷酸盐、137mM氯化钠和2.7mM氯化钾的缓冲液（磷酸盐缓冲盐水；PBS）中，并且将pH调节至pH7.4。然后将所述溶液冻干并溶解于1.0ml去离子水中，为0.5mg/ml（35μM）。如以上指示的，然后将所述测试化合物（典型地以测试化合物:α-共核蛋白摩尔比为10:1、1:1、0.1:1、和0.01:1）添加至所述α-共核蛋白。在共孵育24-38小时之后，将所述孵育混合物1:10稀释并将50μl的每份稀释的孵育混合物转移到包含150μl蒸馏水和50μl硫磺素T溶液（即在250mM磷酸缓冲液中500μM硫磺素T，pH6.8）的96-孔微量滴定板中。α-共核蛋白的终浓度是0.7μM，并且硫磺素T试剂的浓度是在50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）中100μM。在一些实验中，在100μM硫磺素T试剂的存在下，在96-孔微量滴定板中将200μl的每份稀释的孵育混合物与50μl的所述500μM硫磺素T溶液合并以给出2.8μMα-共核蛋白。使用ELISA平板荧光计读取485nm（444nm的激发波长）处的荧光值，并减去作为空白的单独的缓冲液或单独的化合物的值。阳性对照化合物1在抑制α-共核蛋白聚集物中表现几乎相同，无论随后在硫磺素T试剂中使用0.7μM还是2.8μMα-共核蛋白。
呈现在表3中的这一研究的完整结果表明：本发明的化合物干扰α-共核蛋白聚集，如由它们阻止形成α-共核蛋白β-片二级折叠的能力（如通过硫磺素T荧光测定评估的）所指示的。
表3化合物抑制富含α-共核蛋白β-片的结构的形成，如通过硫磺素T荧光测定所测量的。
实例4-本发明的化合物是与帕金森病有关的α-共核蛋白纤丝和/或聚集物的有 效的破坏者/抑制者
帕金森病的特征是不溶性神经元内部聚集物（称为路易小体）的聚集，其中一个主要的组分是α-共核蛋白（综述于多尔（Dauer）等人，神经元（Neuron），39:889-909，2003）。由于α-共核蛋白中的常染色体显性突变引起一个亚类的家族性帕金森病，并且由于这些突变增加了α-共核蛋白聚集和形成路易小体的可能性，所以提出聚集的α-共核蛋白直接涉及病因学和疾病进展（泊里姆罗普洛斯（Polymeropoulos）等人，科学（Science）276:1197-1199，1997；帕帕季米特里乌（Papadimitriou）等人，神经病学（Neurology）52:651-654，1999）。结构研究已揭示：细胞内的路易小体包含一很大比例的具有高度β-折叠片二级结构的错误折叠蛋白。因此，由于在上述的体外测定（硫磺素T荧光测定和刚果红结合测定）中，在此所述的许多化合物引起α-共核蛋白聚集物的分解/破坏/解聚，也在活细胞中进行了研究以确定这些化合物对抑制或阻止与帕金森病有关的α-共核蛋白聚集的效力。
为了测试这些化合物的治疗潜力，利用了基于细胞的测定。在这一测定中，使用了鱼藤酮来诱导线粒体的氧化应激并引起α-共核蛋白聚集。所述测定利用了荧光染料硫磺素S与具有高β-片含量（包括α-共核蛋白纤丝）的结构的结合。因此，使用了固定细胞的硫磺素S-阳性染色的程度的定量评定以测试这些测试化合物抑制/阻止或降低α-共核蛋白聚集物的量的能力（相对于仅用鱼藤酮处理的细胞）。这一研究呈现在以下实例中。
为了进行这些研究，使用了一种细胞培养模型，其中人类α-共核蛋白聚集是试验地诱导的。获得了用A53T-突变体人类α-共核蛋白稳定地转染的BE-M17人神经母细胞瘤细胞。细胞培养试剂是从Gibco/Invitrogen（英杰公司）获得的，并且细胞生长在OPTIMEM中，补充有10%FBS，青霉素（100单位/ml），链霉素（100μg/ml）和500μg/ml G418，如先前所述（奥斯托罗洼-戈尔茨（Ostrerova-Golts）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），20:6048-6054，2000）。
硫磺素S常用来原位检测聚集的蛋白质结构（包括大脑组织）（瓦莱（Vallet）等人，神经病理学报（Acta Neuropathol.），83:170-178，1992），和培养的细胞（奥斯托罗洼-戈尔茨（Ostrerova-Golts）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），20:6048-6054，2000），而硫磺素T常常用作分析可溶性蛋白质向β-折叠片结构富集的纤丝中的聚集（莱文（LeVine）III，蛋白质科学（Prot.Sci.），2:404-410，1993）。因此，硫磺素S组织化学是用在培养的细胞上以检测包含高度β-折叠结构的聚集物，这些聚集物如前所述响应于氧化应激诱导试剂（在这一情况下是鱼藤酮）而形成，具有很少的修饰（奥斯托罗洼-戈尔茨（Ostrerova-Golts）等人，神经科学杂志（J.Neurosci.），20:6048-6054，2000）。简言之，对于这些研究，细胞是以约4.5-5.5x104个细胞/cm2生长在聚-D-赖氨酸涂覆的载玻片室上。在16-18小时之后，如指示的，将细胞用500nM或2μM鱼藤酮（西格玛公司）或媒介物（0.05%DMSO）进行处理。在添加鱼藤酮（或媒介物）15分钟之内，以指定的浓度添加化合物，或进行模拟-处理，其中仅添加细胞培养基（无化合物）。在48小时之后重复进行相同的处理。在额外的24小时之后，在3%多聚甲醛中将细胞固定25分钟。在PBS洗涤和去离子水洗涤之后，将细胞用在50%乙醇中的0.015%硫磺素S孵育25分钟，在乙醇中洗涤两次持续四分钟并在去离子水中洗涤两次持续五分钟，并且然后使用基于水的浸片剂浸片，所述浸片剂是被设计成以免受光漂白。除非另外指明，将结合至硫磺素S的聚集物用荧光显微镜进行检测，使用高Q FITC滤光镜套件（480至535nm带宽）以及20X物镜。每种条件下选择8和20（通常16-18）张具有代表性的图像，并由一个实验人员使用Q捕获软件成像，所述实验人员对处理条件不知情。为了评估硫磺素S-阳性聚集物的量，通过图象分析和量化确定被硫磺素S-阳性包含物覆盖的每个视野的总面积。为此目的，使用专业图像分析软件（Image Pro Plus software）消除没有超过预设尺寸或像素强度阈值参数的背景荧光。人工地去除乱真的非细胞相关荧光。除非另外指明，对于给定的处理条件，通过比较硫磺素S-阳性包含物的平均相对量进行各组之间的对比（即仅用鱼藤酮处理的细胞对比用鱼藤酮和给定浓度的测试化合物处理的细胞）。用GraphPad Prism（GraphPad公司）进行统计分析。通过学生t检验评估平均值（两个样品）间的差异。通过单因子ANOVA接着邓尼特事后比较检验对多个平均值间的差异（与仅用鱼藤酮处理的细胞相比）进行评估。以下呈现的数据统计学上表示：在用测试化合物和鱼藤酮处理的细胞中相对于仅用鱼藤酮处理的细胞在硫磺素S荧光上显著（p<0.05）减小（报告为百分比抑制）。
为了验证所述测定定量地检测结合硫磺素S的聚集物的能力，对过表达A53Tα-共核蛋白的BE-M17细胞进行染色，并且结果揭示相对于媒介物处理的对照细胞（未示出）的在硫磺素S-阳性聚集物上的一个鱼藤酮剂量依赖性的增加。用40X目镜获得的更高放大倍数的图像表明所述硫磺素S-阳性聚集物是细胞内的和细胞质的，类似于胞浆内的路易小体的聚集，这是与帕金森病相关的病理学标志（未示出）。硫磺素-S-阳性聚集物覆盖的面积的定量确立了：500nM和2μM鱼藤酮足够诱导鲁棒的聚集（未示出），并因此是测试化合物减弱这些聚集物形成的能力的有效剂量。
使用上述的方案，对选择的化合物针对它们在鱼藤酮处理的BE-M17细胞中减少、抑制、阻止或消除硫磺素S-阳性聚集物的能力进行测试，所述BE-M17细胞过表达A53Tα-共核蛋白。测试的这些化合物中的一些在鱼藤酮存在下显著地破坏、阻止或抑制α-共核蛋白聚集和纤丝形成，如通过相对于仅用鱼藤酮处理的细胞，硫磺素S-阳性包含物上的减少所表明的。例如，仅用500nM鱼藤酮处理的细胞展现了硫磺素S-阳性聚集物的鲁棒的存在，而相对于仅用鱼藤酮处理的细胞，添加500nM或2μM PD-151分别以52%和84%明显地降低了这些鱼藤酮诱导的聚集物的丰度。类似地，在仅用2μM鱼藤酮处理的细胞中具有鲁棒存在的硫磺素S-阳性聚集物，而相对于仅用鱼藤酮处理的细胞，添加2μM或5μM PD-151分别以58%和60%明显地降低了这些鱼藤酮诱导的聚集物的丰度。因此，PD-151减少、抑制、阻止和/或消除了表达人类A53Tα-共核蛋白的细胞中的硫磺素S-阳性聚集。
此外，当以相似的方式进行测试时，给定浓度的PD-152示出对鱼藤酮诱导的硫磺素S-阳性包含物的显著破坏/阻止/抑制。例如，仅用500nM鱼藤酮处理的细胞展现了硫磺素S-阳性聚集物的鲁棒的存在，而相对于仅用鱼藤酮处理的细胞，添加2μM或5μM PD-152分别以54%和55%明显地降低了这些鱼藤酮诱导的聚集物的丰度。类似地，在仅用2μM鱼藤酮处理的细胞中具有鲁棒存在的硫磺素S-阳性聚集物，而相对于仅用鱼藤酮处理的细胞，添加500nM或2μM PD-152分别以78%和79%明显地降低了这些鱼藤酮诱导的聚集物的丰度。因此，PD-152也减少、抑制、阻止和/或消除了表达人类A53Tα-共核蛋白的细胞中的硫磺素S-阳性聚集。
一并考虑，我们总结测试化合物PD-151和PD-152有效地和强有力的减少、阻止和/或抑制了在BE-M17细胞中的α-共核蛋白聚集物的形成、沉积和/或聚集，所述BE-M17细胞表达A53Tα-共核蛋白。
实例5：本发明的化合物是阿尔茨海默Aβ1-42纤丝或聚集物的强有力的破坏者 /抑制者
发现在前述的实例中制备的化合物是帕金森病α-共核蛋白蛋白纤丝或聚集物的强有力的破坏者/抑制者。在一系列的研究中，分析了这些化合物导致阿尔茨海默病的预形成淀粉样蛋白纤丝（即由Aβ1-42纤丝组成）的分解/破坏/解聚的效力。
部分A-硫磺素T荧光测定
在一项研究中，使用硫磺素T荧光测定来测定所述化合物和咖啡因（作为阴性对照）的效果。在这个测定中，硫磺素T特异性结合纤丝淀粉样蛋白，这种结合产生485nm处的荧光增强，这种增强直接与形成的淀粉样蛋白纤丝的量成正比。荧光越强，形成的淀粉样蛋白纤丝的量就越大（纳基（Naki）等人，实验室研究（Lab.Invest.）65:104-110，1991；莱文（Levine）III，蛋白质科学（Protein Sci.）2:404-410，1993；淀粉样蛋白：国际实验和临床研究杂志（Amyloid:J.Exp.Clin.Invest.）2:1-6，1995）。
在这一研究中，将30μL的预纤丝化的人类Aβ1-42（r肽）的1mg/mL溶液（在蒸馏水中）在37℃下孵育2天，单独或存在这些化合物中的一种或咖啡因的情况下（在测试化合物:Aβ摩尔比为10:1、5:1、1:1、0.1:1或0.05:1）。Aβ在所述反应中的终浓度是0.1mg/mL（22μM）（在磷酸盐缓冲盐水，pH7.4+0.02%叠氮化钠中，300μL终体积）。在共孵育2天之后，将50μL的每份孵育混合物转移到包含150μl的蒸馏水和50μl的硫磺素T溶液（即在250mM磷酸缓冲液中的500μM硫磺素T，pH6.8）的96-孔微量滴定板中。使用ELISA平板荧光计读取485nm（444nm的激发波长）处的发射荧光，并减去作为空白的单独的缓冲液或单独的化合物的值。
2-天孵育的结果呈现在表4中。例如，鉴于在所有测试浓度的咖啡因不会引起对Aβ1-42纤丝的显著抑制，这些化合物都引起了预形成的Aβ1-42纤丝的剂量依赖性的破坏/分解/解聚。所有测试化合物对破坏预形成的Aβ1-42纤丝都是有效的。这些结果与从阳性对照化合物（未示出）中获得的结果类似，从阳性对照化合物中获得的结果表明硫磺素T荧光的鲁棒抑制。例如，当以测试化合物:Aβ摩尔比为10:1使用时，本发明的所有化合物都引起对硫磺素T荧光至少63%的抑制。在测试化合物:Aβ摩尔比为5:1时，抑制水平在从17至87%的范围中并且所有化合物除了PD-153在5:1（测试化合物:Aβ）浓度下都示出至少74%抑制。甚至在等摩尔的浓度（测试化合物:Aβ摩尔比为1:1），对于所有化合物除了PD-153，都存在对硫磺素T荧光至少54%的抑制。有趣地是，在本测定中，在亚化学计量的浓度（即测试化合物:Aβ摩尔比为0.1:1和0.05:1）的PD-150和PD-154对抗Aβ纤丝/聚集物都是有效的。本研究表明，本发明的化合物是阿尔茨海默病型Aβ纤丝的强有力的破坏者/抑制者，并通常以一种剂量依赖的方式发挥它们的作用。
表4化合物破坏/解聚Aβ纤丝/聚集物，如通过硫磺素T荧光测定来测量的。
部分B：刚果红
在刚果红结合测定中，量化了一种测试化合物改变β-淀粉样蛋白结合至刚果红的能力。在本测定中，将Aβ1-42（如针对硫磺素T测定制备的）和测试化合物孵育2天，并且然后通过0.2μm滤器进行真空过滤。当用刚果红对滤器进行染色后，对留在滤器上的Aβ1-42的量进行定量。在适当的洗涤所述滤器之后，在所述测试化合物的存在下滤器上的刚果红颜色的任何降低（与不存在所述测试化合物时所述淀粉样蛋白的刚果红染色相比）都指示所述测试化合物的以下能力：减少/改变聚集的和嗜刚果红的Aβ的量。
在一个研究中，在不存在或存在增加量所述的化合物或咖啡因（在测试化合物:Aβ摩尔比为10:1、5:1、1:1、或0.1:1））的情况下，确定了Aβ纤丝结合刚果红的能力。2-天孵育的结果呈现在表5中。鉴于在所有测试浓度的咖啡因不会引起对Aβ1-42纤丝的显著抑制，这些化合物引起了对Aβ结合至刚果红的剂量依赖性的抑制。例如，当以测试化合物:Aβ摩尔比为10:1使用时，PD-150，PD-151和PD-152各自引起对刚果红结合至Aβ1-42纤丝的显著抑制（从59%-63%的抑制范围），以及当测试化合物:Aβ摩尔比为5:1使用时，对刚果红结合的显著抑制（46%-48%的抑制范围）。与硫磺素T荧光测定结果相似，本研究也表明本发明的化合物是Aβ纤丝的强有力的破坏者/抑制者，如通过Aβ纤丝结合至刚果红评估的，并通常以一种剂量依赖的方式发挥它们的作用。
表5化合物破坏/解聚Aβ纤丝/聚集物，如通过刚果红结合测定所测量的。
实例6：本发明的化合物直接抑制/破坏Aβ向含β-片的纤丝结构的体外转化
部分A：硫磺素T荧光测定
为测试所述化合物是否能抑制Aβ的β-片的形成，利用如在实例5中所述的相同的测定，但所述Aβ是制备的，这样使得它在所述测定开始时是处于一种非纤丝状的状态。为了达到这种非纤丝状的状态，将冻干的人类Aβ1-42（r肽）使用2mM NaOH溶解至1mg/mL（220μM）并且通过少量（μL）添加1MNaOH将pH被调节至10.5。然后将所述澄清的溶液冰冻，再冻干并溶解于包含9.5mM磷酸盐、137mM氯化钠和2.7mM氯化钾的缓冲液（磷酸盐缓冲盐水；PBS）中至2mg/mL（440μM）Aβ的浓度。在独立的管中，制备在PBS中不同浓度的测试化合物母液以使终反应包含等体积的所述测试化合物母液，并且所述Aβ溶液将会得到终Aβ浓度为1mg/mL（220μM），具有测试化合物:Aβ摩尔比为10:1、5:1、1:1和0.5:1。然后将包含Aβ+测试化合物（或Aβ+PBS为针对Aβ聚集物的对照）的反应孵育24小时，将所述孵育混合物1:20稀释至0.05mg/mL Aβ，并将50μL的每份稀释的孵育混合物转移到包含150μl的蒸馏水和50μl的硫磺素T溶液（即在250mM磷酸缓冲液中500μM硫磺素T，pH6.8）的96-孔微量滴定板中。Aβ的终浓度是2.2μM，并且硫磺素T试剂的浓度是在50mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）中100μM。使用ELISA平板荧光计读取485nm（444nm的激发波长）处的荧光值，并减去作为空白的单独的PBS缓冲液或单独的化合物的值。
呈现在表6中的这一研究的完整结果表明:本发明的化合物干扰Aβ聚集物，如通过它们阻止Aβ的β-片二级折叠的能力（如通过硫磺素T荧光测定评估的）表明的。例如，当以测试化合物:Aβ摩尔比为10:1使用时，PD-150，PD-151和PD-152各自引起对硫磺素T荧光的显著抑制（从61%-93%的抑制范围），以及当测试化合物:Aβ摩尔比为5:1使用时对硫磺素T荧光的显著抑制（23%-87%的抑制范围）。正如预期的，所述阳性对照化合物（对照4）进行并完全抑制Aβ聚集（100%）（以测试化合物:Aβ摩尔比为≥1:1），而所述阴性对照化合物（咖啡因）以所测试的任何浓度（50:1、10:1和1:1）都不能抑制Aβ聚集。本研究表明本发明的化合物是富含β-片的Aβ纤丝形成的强有力的抑制者（如通过硫磺素T荧光测定评估的），并且这些化合物通常以一种剂量依赖的方式发挥它们的作用。
表6化合物抑制Aβ的富含β-片的结构的形成，如通过硫磺素T荧光测定所测量的。
部分B：圆二色（CD）光谱
由于若干化合物示出减少了硫磺素T-阳性聚集物的丰度（表6），所以我们通过使用圆二色（CD）光谱对这些化合物直接抑制Aβ向包含β片结构的-的转化寻求独立的确认。为此目的，在聚集的24小时评估了在硫磺素T荧光测定（在本实例的部分A中）使用的Aβ反应。还在t=0，聚集之前通过CD光谱分析评估了单独的Aβ（t=0，未折叠的参考对照）。在24小时之后，将反应在PBS中稀释20倍，并在Jasco J-810分光偏光镜上使用0.1cm光程长吸收池获得了针对每个反应的CD光谱。以0.1nm的步长，1nm的带宽和0.05mg/ml的Aβ浓度记录所有光谱。将所述光谱在仍提供一个小于600V的倍增电极电压的最短波长处进行修整。然后将所述修整过的光谱经受一个数据处理程序，所述程序从由傅里叶变换进行的噪声消除开始接着减去空白谱（没有Aβ仅有媒介物）。然后将这些空白修正的谱在260nm处调零并将单位从毫度转换到特定的椭率。
使用在约218nm处的椭率最小值并参考归一化为接近完全折叠和未折叠的参照值的比例，从处理的光谱中确定β-片百分比，与先前的报导一致（拉米雷斯-阿尔瓦拉多（Ramirez-Alvarado）等人，分子生物学杂志（J.Mol.Biol.），273:898-912，1997；安徒生（Andersen）等人，美国化学学会杂志（J.Am.Chem.Soc.），121:9879-9880，1999）。完全折叠的参照值是通过在持续24小时（完全纤丝化）纤丝化的Aβ的光谱上进行所述的计算找到的，并对所述差异分配100%β-片的任意值。未折叠参照是通过来自在起始时间点（t=0）时相同的样本的光谱来提供的并对此处发现的差异归因0%β-片的任意值。然后使用本发明的β-片值以提供各自相对的对β-片的%抑制，所述片由处于给定摩尔比（测试化合物:Aβ）的这些化合物诱导。
首先，为了确认Aβ1-42的确被转化为富含β-片的结构并在我们的系统中建立24小时的这种转化的定时，采集仅有Aβ的孵育混合物（无化合物）的等分试样并收集CD谱。在孵育的24小时，CD分析揭示一个大的丰度的一个或多个富含β-片的结构，指示为明显的特定的椭率—在218nm处的最小值和在197nm处的最大值（未示出）。然而，当在24小时的孵育时，所述反应混合物中单独包括适当浓度的测试化合物PD-150，PD-151，PD-152，PD-153或所述阳性对照化合物（对照4）时，在218nm处的最小值的改变的量级减少，相对于仅Aβ，并且所述光谱更有无规卷曲结构的特征。因此，我们得出以下结论：本发明的化合物中的一些抑制（至不同的程度）天然的未折叠的Aβ向富含β-片的结构的转化。在另一方面，阴性对照化合物（咖啡因）对218nm处的椭率最小值的改变的量级没有影响。这些结果汇总在表7中。作为抑制β-片在Aβ中形成的测试化合物的特定实例，当以测试化合物:Aβ摩尔比≥5:1使用时，化合物PD-150导致至少62%的抑制。一并考虑，这些结果表明本发明的化合物中的一些示出对Aβ聚集——淀粉样蛋白病（如阿尔茨海默病）的标志的强有力的抑制和阻止。
表7化合物抑制Aβ的富含β-片的结构的形成，如通过圆二色（CD）光谱所测量的。
实例7-本发明的化合物在血浆和大脑中显示治疗相关水平，与用于治疗中枢 神经系统失调的药物一致
为了选择在本发明中的化合物，我们已使用了野生型小鼠以确定以下的血浆药物代谢动力学（PK）参数：最大浓度（Cmax），以及曲线下面积（AUC），如从时间对比浓度曲线图中得到的。我们也已经确定了最大小鼠大脑水平和选择在本发明中的化合物期间的全脑暴露，分别表示为Cmax-大脑和AUC-大脑。为了建立所述方法，我们利用50mg/kg腹膜内（i.p.）注射2种对照化合物对随着时间推移的大脑和血浆的化合物水平进行了评估。这些结果表明，这些对照化合物在血浆水平和大脑摄取中的快速脉冲，接着在6小时给药后从血液中完全清除（数据未示出）。在评估本发明的化合物的一个典型的试验中，我们使用了CD-1雌性小鼠，具有等于4只小鼠每给药后时间点（例如7、15、30，和60min给药后）的一个样本大小（n）。我们选择早期时间点来评估起始暴露，由于在我们的研究中在最早的时间点评估的大脑和血浆水平是最高的（7分钟），所以当我们预期血浆和大脑暴露是高的时，我们也许已经错过了在更早时间点（在0和7分钟之间）的甚至更高的暴露。
为了这些研究的目的，每种化合物被配制为在PBS+0.1%抗坏血酸（w/v）中的在20%聚乙二醇（PEG）-400中5mg/mL。所述剂量体积是体重的10mL/kg。经由腹膜内注射向小鼠给予测试化合物，并且在按预定的处死之前约2-3分钟，将它们用2.5%阿佛丁深度麻醉。一旦被麻醉，通过心脏穿刺去除全血，转移至适当的含EDTA管中，并立即在冰上冷冻。这之后对每只小鼠用>15ml冷的0.9%盐水通过左心室套管插入术和降主动脉的夹合进行完全灌注。收获大脑，冰冻在干冰上并存储在-80℃用于测试化合物的生物分析。通过标准离心技术在1小时之内从全血中提取血浆。使用乙酸乙酯从血浆和大脑匀浆物中提取化合物（液-液），接着使用针对这些新颖的化合物开发的方法（即HPLC梯度和质谱分析参数）进行HPLC/MS定量。所有方法在相关基质和溶剂中建立足够的稳定性，并使用内部定量对照。使用用掺入适当基质（即20%PEG-400/PBS+0.1%抗坏血酸）中的化合物产生的校准曲线来达到定量。我们已经建立了下限的5-25ng/ml（血浆）和5-25ng/g（大脑）的定量敏感度，这对于这些研究足够了。在不同的给药后时间点确定大脑和血浆浓度之后，用WinNonLin软件（法赛特（Pharsight）公司）确定精选的血浆（Cmax和AUC）和大脑（Cmax-脑和AUC-脑）PK参数。我们将针对本发明中的化合物的这些值与针对阳性对照化合物的这些值进行比较，当以相同的治疗相关程序和剂量水平（以50mg/kg腹腔（i.p.）注射）给予时，已知在血浆和大脑中，它们以对于生物效应（即降低α-共核蛋白大脑水平和改善的运动功能；数据未示出）而言足够的水平存在。
使用以上所述的方案，例如，我们确定PD-151具有一个血浆Cmax=5，340ng/mL以及血浆AUC=212,417min*ng/mL。这一血浆暴露与阳性对照化合物相比是有利的，所述阳性对照化合物具有一个血浆Cmax=8,230ng/mL以及血浆AUC=420,406。在大脑中，PD-151具有一个Cmax-大脑=59.2ng/g和AUC-大脑=2,147min*ng/g。这一大脑暴露与阳性对照化合物相比是有利的，所述阳性对照化合物具有一个Cmax-大脑=94.6ng/g和AUC-大脑=7,029min*ng/g。PD-150也示出了可接受的血浆和大脑暴露。例如，PD-150具有一个血浆Cmax=3,284ng/mL，血浆AUC=127,662min*ng/mL，Cmax-大脑=99.5ng/g和AUC-大脑=3,048min*ng/g。
一并考虑，这些结果指示：本发明的化合物中的一些示出具有与旨在治疗中枢神经系统失调（如阿尔茨海默病或帕金森病）（这里的初始靶是一种大脑蛋白）的药物一致的血浆和大脑暴露。例如，当所述对照化合物是以一个治疗有效量给予到疾病相关动物模型中时，本发明中的化合物的水平具有与对照化合物是可比的大脑和血浆暴露（即与所述对照化合物不同的不大于3.3倍）。

Claims (14)

1.一种选自下组的化合物，所述组由具有以下化学式的化合物组成：
其中：
R1-3独立地被氢、甲基和苄基基团取代，
R4被氢、或苯基基团取代，并且
其中所述苯基或苄基基团独立地被高达2个选自以下的基团取代：H、OH、F、Cl、Br、葡糖苷酸、硫酸盐、氰基、甲基、NH2、SH、CH2OH、CN、CF3、NHSO2CH3、N(CH3)2、NHCH3、N(CN)2、NHCN、C(CN)3、NH(C=O)NH2、NH(C=O)CH3、(C=NH)NH2、(C=NOH)NH2、O(C=O)OCH3、和NH(C=O)H、及其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自下组，所述组由以下各项组成：
3.如权利要求1所述的化合物，其中R1被苄基基团取代，R2或R3独立地被甲基或苄基基团取代，并且R4被氢取代，并且其中所述苄基基团各自被两个羟基基团取代。
4.一种药物组合物，包括如权利要求1所述的化合物以及一种药学上可接受的赋形剂。
5.一种治疗淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝的形成、沉积、积聚、或持续的方法，包括用有效量的如权利要求1所述的化合物治疗所述纤丝。
6.一种治疗患上一种淀粉样蛋白病或一种共核蛋白病的哺乳动物中的疾病的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1所述的化合物。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述淀粉样蛋白病选自以下疾病的组，所述组由以下各项组成：阿尔茨海默病、II型糖尿病、系统性AA淀粉样变性、唐氏综合征、带有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血、以及大脑β-淀粉样血管病。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述淀粉样蛋白病是阿尔茨海默病。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述共核蛋白病选自下组，所述组由以下各项组成：帕金森病、家族性帕金森病、路易小体病、阿尔茨海默病的路易小体变异、路易小体痴呆、多系统萎缩症、以及关岛型帕金森症-痴呆复合征。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述共核蛋白病是帕金森病。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述化合物是以0.1mg/Kg/天与1000mg/Kg/天之间的量给予的。
12.如权利要求5所述的方法，其中所述化合物是以1mg/Kg/天与100mg/Kg/天之间的量给予的。
13.如权利要求5所述的方法，其中给予的化合物的量是10mg/Kg/天与100mg/Kg/天之间的一个量。
14.一种制造物品，包括包装材料、被包含在包装材料之中的如权利要求1所述的化合物或其一种药学上可接受的盐，它被用于治疗β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝和/或聚集物的形成、沉积、积聚、或持续，并且还包括一个标签，该标签指示所述化合物或其药学上可接受的盐是用于治疗β-淀粉样蛋白或α-共核蛋白纤丝和/或聚集物的形成、沉积、积聚、或持续。
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