CN104004734A - 一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用 - Google Patents

一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其编码基因和应用，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列。本发明的β-甘露聚糖酶具有以下性质：最适pH6.0，具有弱酸性，在pH4.5-7.5范围内，酶活保持在40％以上。最适温度50℃。在50℃处理1h，酶活保持稳定。良好的pH稳定性和热稳定性。比活为1,046U mg–1，易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂,可广泛用于动物及鱼类饲料、食品、医药、酿酒、造纸、及洗涤剂工业等。

Description

一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用。
背景技术
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。β-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一种能降解甘露聚糖主链的水解酶，属于半纤维素酶类。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、饲料、医药、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。
许多微生物，植物和一些低等动物中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler,et alFEMS Microbiol.Lett.1996.141:183–188)。微生物是β-甘露聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。随着分子生物学的发展，部分甘露聚糖酶的编码基因已被克隆并进行了异源表达(Dhawan and Kaur,Crit.Rev.Biotechnol.2007.27:197–216；Moreira and Filho,Appl.Microbiol.Biotechnol.2008.79:165–178.)根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，β-甘露聚糖酶多被划分为糖苷水解酶家族5,11或113(Henrissat and Bairoch,Biochem.J.1993.293:781-788)。
不同来源的甘露聚糖酶因性质上的差别,其应用范围和价值也不尽相同。国内外研究和报道较多的细菌产甘露聚糖酶多为中性或碱性酶，包括芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、放线菌等。而真菌来源的β-甘露聚糖酶多为酸性，它们作用的最适pH值在2.4～5.0。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa～55kDa，最适作用pH为4.0～6.0，最适作用温度为55℃～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。
本发明得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶在酸性和中性条件下有高的酶活性，较好的耐热性和极好的抗蛋白酶能力，可应用于动物及鱼类的饲料，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产中性β-甘露聚糖酶。
本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备中性β-甘露聚糖酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述中性β-甘露聚糖酶的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒、造纸以及能源工业中应用新的β-甘露聚糖酶。本发明人筛选到一种天然菌株，它所产生的β-甘露聚糖酶适合于在饲料、食品、酿酒、造纸以及能源工业中使用。
从上述真菌中获得了一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1，其氨基酸序列如SEQID NO.1
其中，该酶全长468个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列“MVFTSTYALAALFTFTAA”。
因此，成熟的中性β-甘露聚糖酶Man26DW1的理论分子量为49kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2
本发明还提供了编码上述中性β-甘露聚糖酶的基因。
该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：
本发明通过PCR的方法分离克隆了这一β-甘露聚糖酶基因man26DW1,DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶Man26DW1结构基因man26DW1全长1461bp，含有1个内含子，+131～+187bp为其内含子序列，cDNA长1404bp，其cDNA序列如SEQ IDNO.4所示。
其中，信号肽的碱基序列为：ATGGTGTTCA CTTCAACATA TGCCCTGGCG GCACTCTTTACTTTCACCGC AGCT。
成熟基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示：
该酶属于糖基水解酶第26家族。将β-甘露聚糖酶基因man26DW1cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对确定Man26DW1是一种新的甘露聚糖酶。
本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-man26DW1。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man26DW1。
本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man26DW1。
本发明还提供了一种制备耐碱β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；以及
3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man26DW1。
本发明还提供了上述中性β-甘露聚糖酶的应用。本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有在酸性中性范围内均具有高活性，作用pH范围广，且具有较好的耐热性和优良的抗蛋白酶能力，较高的比活力，可作应用于动物及鱼类的饲料、食品、医药、造纸等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产中性甘露聚糖酶。
附图说明
图1man26DW1在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，1,分子量标准；2,发酵培养上清；3,纯化的重组β-甘露聚糖酶；4，脱糖基后的β-甘露聚糖酶。
图2 本发明重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。
图3 本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性。
图4 本发明β-甘露聚糖酶最适反应温度。
图5 本发明β-甘露聚糖酶热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存,毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L魔芋粉，5g/L(NH4)SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1β-甘露聚糖酶编码基因man26DW1的克隆
真菌Alternaria sp.分离自天山雪莲土壤。提取真菌基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。
根据已发表的甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物P1，P2。以总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环后72℃保温8min。得到一约230bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物usp1,usp2,usp3；dsp1,dsp2,dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。
表1.甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物
实施例2β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR分析
提取总RNA,利用反转录酶得到cDNA的一条链,然后设计恰当的引物(F:5'-TGGAATTCCAATCAGTGACCTACCAGGCTG-3,R:5'-TGGCGGCCGCTCAAGCTGATGTATTCCCATTCTTCCAG-3')扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。
通过比较甘露聚糖酶酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长1404bp，编码467个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因man26DW1的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的甘露聚糖酶基因序列进行同源比较，确定从Alternaria sp.中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。
实施例3重组β-甘露聚糖酶的制备。
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码甘露聚糖酶的基因man26DW1双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有甘露聚糖酶基因man26DW1的重组质粒pPIC-man26DW1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man26DW1。
以同样方法构建含信号肽编码序列的甘露聚糖酶基因man26DW1的重组质粒。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后,离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组甘露聚糖酶的表达量为15U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。
实施例4重组β-甘露聚糖酶的活性分析
采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH5.5，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。
甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。
实施例5甘露聚糖酶Man26DW1的最适pH及pH稳定性
经纯化的甘露聚糖酶Man26DW1在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液及pH10.0～12.0的Gly-NaOH系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶Man26DW1在不同pH的缓冲体系，50℃下测定的pH适性结果(图2)表明：Man26DW1的最适pH为6.0，在pH4.5～7.5范围内，酶活性维持在40％以上酶活。
将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH5.0～9.0之间保持最适pH下酶活的85％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。
实施例6甘露聚糖酶Man26DW1酶反应最适温度及热稳定性。
最适温度的测定在pH6.0缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间,再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为50℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，Man26DW1在50℃下稳定。
实施例7甘露聚糖酶Man26DW1的动力学参数的测定
用不同浓度的角豆胶(0.25–5mg ml-1)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(Ph6.0)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其Km值。经测定，以角豆胶为底物时的Km值和Vmax分别为11mg ml–1和4,000μmol min–1mg–1。比活力为1046U/mg。

Claims (9)

1.一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.2所示。
2.一种中性β-甘露聚糖酶基因man26DW1，其特征在于，编码权利要求1所述的中性β-甘露聚糖酶Man26DW1。
3.如权利要求2所述的中性β-甘露聚糖酶基因man26DW1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2所述中性β-甘露聚糖酶基因man26DW1的重组载体。
5.包含权利要求2所述中性β-甘露聚糖酶基因man26DW1的重组载体pPIC9-man26DW1。
6.包含权利要求2所述中性β-甘露聚糖酶基因man26DW1的重组菌株。
7.一种制备中性β-甘露聚糖酶Man26DW1的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；
3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶Man26DW1。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。
9.权利要求1所述的中性β-甘露聚糖酶Man26DW1的应用。
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