CN104004513B

CN104004513B - 一种检测锌离子的荧光分子探针及其制备方法

Info

Publication number: CN104004513B
Application number: CN201410241567.8A
Authority: CN
Inventors: 白德成; 沈蓉; 程菊; 刘迪; 席聘贤; 陈凤娟; 洪金鹏; 魏惠; 安丽
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2034-06-03
Also published as: CN104004513A

Abstract

本发明公开了一种检测锌离子的荧光分子探针。该荧光分子探针具有如下的化学结构：

Description

一种检测锌离子的荧光分子探针及其制备方法

技术领域

本发明属于荧光分子探针领域，具体涉及一种用于检测锌离子的荧光分子探针及其制备方法。

背景技术

锌是有机体内一种必不可少的微量元素，在细菌及动植物生长发育、组织修复、信号传输、基因转录、金属酶调控等许多生命活动中发挥着至关重要的作用。锌摄入过多或过少，都会造成机体内新陈代谢紊乱，引起很多疾病，危害生态环境和人类健康。

随着人们对锌在生命活动中作用的认识的加深，细胞内锌的研究已成为多种交叉学科研究的热点研究课题，因此锌检测，尤其是活体细胞和组织中锌的测定与荧光显微成像也成为备受关注的热点领域。

近年来，荧光分子探针技术迅速发展、应用广泛，其检测信号直观、方法简便、易于实现对活细胞状态的检测。目前用于检测锌离子的荧光分子探针有很多，如基于双(2-吡啶甲基)胺、大环多胺、联二吡啶、席夫碱、三氮唑衍生物为受体的荧光探针，而其缺点这类探针只能在纯有机溶剂中发挥有效作用，限制了在水性介质中的应用，且很难区分镉离子，容易受多种重金属离子如铜、钴和镍离子的干扰导致荧光淬灭。此外，这些荧光分子探针渗透细胞膜的能力较弱，很难快速高效的测定细胞内的锌离子浓度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测锌离子的荧光分子探针所存在的上述缺陷，提供一种新型的检测锌离子的荧光分子探针。

本发明的另一目的是提供所述荧光分子探针的制备方法。

本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种检测锌离子的荧光分子探针，所述荧光分子探针具有如下化学结构式：

。

上述荧光分子探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）8-氨基喹啉与氯乙酰氯在吡啶作用下反应得到中间体，所述中间体的化学结构式：；

（2）步骤（1）的中间体在KOH和KI的作用下反应得到所述荧光分子探针。

进一步，步骤（1）中，吡啶用量为8-氨基喹啉摩尔量的2-3倍。优选为2.5-3倍。

进一步，步骤（1）中，所述氯乙酰氯用量为8-氨基喹啉摩尔量的2-3倍。

进一步，步骤（2）的反应温度为60-80℃。

进一步，步骤（2）中，所述KOH的用量为中间体摩尔量的1-1.5倍，优选为1.1-1.2倍；所述KI的用量为中间体摩尔量的0.01-0.1倍，优选为0.05-0.1倍。

步骤（2）的反应溶剂优选为乙腈水混合溶剂，乙腈与水的体积比为（3-8）：1，优选为5：1。

上述荧光分子探针用于检测锌离子。

进一步，用于检测细胞体内的锌离子。

进一步，用于检测植物体内的锌离子。

附图说明

图1为探针与不同浓度锌离子作用后的荧光光谱。

图2为荧光分子探针对锌离子及常见金属离子的选择性。

图3为各种常见金属离子对荧光探针-锌离子络合物的竞争性。

图4为荧光分子探针在正常人类乳腺细胞（HBL-100）中对锌离子的识别成像图。

图5为荧光分子探针在小麦根部对锌离子的识别成像图，其中，a为未用锌离子培养的小麦根系识别成像图；b为用锌离子培养后小麦根尖的识别成像图；c为用锌离子培养后小麦根毛的识别成像图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

荧光分子探针的合成路线如下：

。

具体过程为：

在圆底烧瓶中加入8-氨基喹啉（0.69g，4.8mmol）、吡啶（1ml，12.4mmol）、氯仿（7ml），在冰浴条件下搅拌并缓慢滴加氯乙酰氯和氯仿的混合溶液（氯乙酰氯0.8ml（10.6mmol）、氯仿5ml），搅拌约1 h后恢复至室温条件，继续搅拌24h待反应结束后旋干溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，将产物经硅胶柱层析法分离提纯，旋干二氯甲烷得到淡黄色中间产物L2（产率90%）。

将中间产物L2（1.1g，5mmol）、KOH（0.336g，6mmol）、KI（42mg，0.25mmol）、乙腈/水（40ml:8ml，v/v）加入圆底烧瓶中，在60～80℃下搅拌并回流8 h，待冷却后旋干溶剂，以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶柱层析法分离纯化，旋干二氯甲烷得到白色固体（产率57%），即目标产物L1。

荧光探针L1的结构数据表征如下：

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 10.49 (s, 1H), 8.85 (dd, J = 4.3, 1.7 Hz, 1H), 8.83 – 8.73 (m, 1H), 8.22 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 7.62 – 7.55 (m, 2H), 7.54 – 7.47 (m, 1H), 4.43 (s, 2H), 2.97 (s, 1H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ 169.881, 148.363, 136.587, 128.050, 127.382, 122.206, 121.716, 117.068, 62.915.

ESI-MS: (m/z) =203.3.

实施例2

将荧光分子探针L1溶于水-乙醇溶液（8:2，v/v，pH 7.2）中，配制成10μM浓度的溶液，然而加入锌离子，在360nm激发波长下，检测不同锌离子浓度下的荧光强度（荧光分光光度计，型号：Hitachi F-4500）。如图1所示，随着锌离子浓度的增加，荧光在500nm波长处逐渐增强。

实施例3

按探针L1与金属离子的摩尔比为1:5，将探针L1分别加入到金属离子的水-乙醇溶液（8:2，v/v，pH 7.2）中，如图2所示，探针L1与锌离子络合后在500nm处表现出非常强的荧光强度，而其他金属离子荧光强度非常弱且荧光峰主要在400-450nm之间，因此，探针L1对锌离子表现出非常强的选择性(采用浓度相同的其他金属离子作为对照：镉离子、钾离子、钠离子、铁离子、铬离子、镍离子、镁离子、银离子、汞离子、铝离子、钴离子、锰离子、铅离子、锂离子、铜离子等)。

实施例4

按探针L1与金属离子的摩尔比为1:2，将探针L1分别加入到竞争金属离子的水-乙醇溶液（8:2，v/v，pH 7.2）中，记录探针与各种金属离子结合的荧光强度后再加入锌离子（使锌离子浓度与竞争金属离子相同），检测竞争结合后的荧光强度。如图3所示，除铁离子对锌离子与探针L1的络合具有一定的荧光淬灭作用外，几乎不受其他金属（镉、钾、钠、铬、镍、镁、银、汞、铝、钴、锰、铅、锂、铜等）离子干扰，并表现出显著荧光增强。

实施例5 渗透性实验

将探针L1加入培养好的HBL-100细胞中，在37℃下培养5-10 min，在激光共聚焦显微镜（型号为：Olympus FV1000，激发波长405nm）下观察可见细胞有微弱荧光（如图4a）；同时，在培养好的HBL-100细胞中加入30μM锌离子，在37℃培养0.5 h后加入10μM 探针L1继续培养5-10 min，观察可见细胞内荧光显著增强（如图4b）。

将发芽的小麦种子分组，分别用不含锌离子和含有锌离子的培养液培养，10天后分别取两组小麦根尖，用蒸馏水冲洗三次后浸泡在含有探针L1（10μM）的溶液中0.5 h，用激光共聚焦显微镜观察（激发波长405nm），未用锌离子培养的小麦根系无荧光发出（如图5a），用锌离子培养的小麦根冠及根毛表现出显著的荧光增强（如图5b和图5c）。

上述实验表明探针L1具有良好的快速渗透能力，可用于生物或植物体内锌离子的快速检测。

Claims

1.一种防止铜离子干扰导致荧光淬灭的检测锌离子的荧光分子探针，其特征在于：所述荧光分子探针具有如下化学结构式：

。

2.权利要求1所述荧光分子探针的制备方法，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，吡啶用量为8-氨基喹啉摩尔量的2-3倍。

4.根据权利要求2所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氯乙酰氯用量为8-氨基喹啉摩尔量的2-3倍。

5.根据权利要求2所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）的反应温度为60-80℃。

6.根据权利要求2所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述KOH的用量为中间体摩尔量的1-1.5倍；所述KI的用量为中间体摩尔量的0.01-0.1倍。

7.权利要求1所述荧光分子探针的应用，其特征在于：用于检测锌离子。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：用于检测细胞体内的锌离子。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：用于检测植物体内的锌离子。