CN103265452A - 一种希夫碱配体和其铜配合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种希夫碱配体NS及其金属铜(II)配合物CuNS，以及两者在制备抗肿瘤药物中的应用。该希夫碱配体NS的结构式为：

。其金属铜(II)配合物CuNS的结构式为：

Description

一种希夫碱配体和其铜配合物及应用

技术领域

本发明涉及一种希夫碱配体及其金属铜(II)配合物，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

近几年，阴离子的分子识别和传感一直备受关注，尤其是对铜的选择性传感。铜作为必要的过渡金属离子存在于人体内，对生物系统具有重要的意义。铜能清除各种潜在的有害的病原体，因此对葡萄球菌、大肠杆菌等病原体有抗菌的作用。但过度累积的铜会引起严重的中毒，对环境也有严重的破坏。因此，对Cu²⁺的有效识别及传感对生物学，化学和环境具有重要的意义。G-四联体是由连续G序列的DNA形成的，通过Hoogsteen氢键的配对方式，首尾连接构成的平面的G-四分体，是一种特殊的核酸二级结构。由于G4DNA可以抑制端粒酶活性，很多癌症细胞的寿命因此受到影响，很多小分子也已经被设计用来促使G4DNA结构的形成或者使之稳定，这些物质可能对癌症有潜在的治疗意义。研究过渡金属配合物与DNA作用的模式和机制，探索金属配合物在抗肿瘤药物、分子生物学和生物工程方面的应用，是最近几年的热点。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了具有C=N结构和-OH基团的希夫碱配体，在配位化学中起着非常重要的作用，且-OH基团中的氧原子作为电子供体具有很好的络合金属离子的能力。提供了一种含希夫碱配体的金属铜配合物CuNS，它具有更好的药物活性、能促进G4DNA形成或者使之稳定。分别研究了希夫碱配体及含希夫碱配体的过渡金属铜(II)配合物与G4DNA的相互作用；研究它们对G4DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移情况；还研究了它们对人肝癌细胞（HepG2）的细胞毒性实验，表现出显著的抗肿瘤活性。

本发明的技术方案为：

一种希夫碱配体NS，其特征在于其如式(I)所示：

其中的含有C = N结构和-OH基团的希夫碱配体在配位化学中起着非常重要的作用，且-OH基团中的氧原子作为电子供体具有很好的络合金属离子的能力。

一种含有如式(I)所示的希夫碱配体NS的金属铜(II)配合物CuNS，过渡金属铜(II)与C=N结构中的N原子和-OH基团中的O原子络合形成N₂0₂配位的金属铜配合物。其特征在于其如式(II)所示：

所述的希夫碱配体NS和金属铜(II)配合物CuNS的晶体部分录用条件、结构精修和晶体学数据见表1，两者的主要键长

和键角

见表2，其中表2涉及到的原子编号见附图9和附图10。 

希夫碱配体NS的合成的具体步骤为：在氮气保护下，将50 mg（0.316 mmol）的2,3-二氨基萘加入在装有10 mL的无水乙醇的圆底烧瓶中，待样品完全溶解后，将0.639 mmol水杨醛慢慢的滴加到2,3-二氨基萘的乙醇溶剂中，先室温搅拌10 min，然后加热回流4小时，伴有大量的橙黄色固体生成。反应结束冷却至室温，过滤，收集固体部分，真空干燥，将固体溶解在3 ml二氯甲烷中，并且滴入0.5 ml正己烷，静置2天后，有橙黄色的晶体析出。得到橙黄色固体98 mg，产率为84.6%。Positive ESI-MS (CH₂Cl₂): m/z = 367.3({M+H}).¹H NMR (300 MHz, CD₃Cl，Me₄Si, δ in ppm) δ: 8.75 (s,2H, amide H), 7.86 (q, 2H, J = 6.2 Hz, J = 2.9 Hz, 1-benzene H), 7.60 (s, 2H, 2-naphthalene H), 7.48 (q, 2H, J = 7.7 Hz, J = 1.6 Hz 1-benzene), 7.42(d, 2H, J = 8.4 Hz, 2-naphthalene), 7.40 (t, 2H, J = 7.1 Hz, 2-naphthalene), 7.26 (s, 2H, J = 7.1 Hz, 2-naphthalene), 7.07 (d, 2H, J = 8.2 Hz aromatic C-OH), 6.96(t, 2H, J = 7.5 Hz, 1-benzene), IR (KBr disk, ν/cm^-1): 1607 ν (C = N). 1567 ν (C = N), 1567, 1499, 1468 (ArC)。

铜配合物的合成具体步骤如下：

在氮气保护下，将28 mg（0.0764 mmol）的NS加入到装有8 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，待样品完全溶解后，加入用无水乙醇溶解的15.3 mg（0.0764 mmol）的Cu(CH₃COO)₂·H₂O，加热回流4小时，伴有大量的黄褐色固体生成。反应结束冷却至室温，过滤，并用95%的乙醇洗涤数次，真空干燥，收集固体部分。将固体溶于少量DMSO中，并滴入少量乙腈重结晶。几天后，有针状的黄褐色晶体析出。得到黄褐色固体20 mg，产率为58.7%。Positive ESI-MS (CH₂Cl₂): m/z = 428.0({M+H})。 Anal. Calcd for C₂₄H₁₈N₂O₃Cu·0.5H₂O: C, 63.30；H, 4.18；N, 6.15； Found: C, 63.01；H, 4.26；N, 6.39. IR (KBr disk, ν/cm^-1): 1605 (C = N), 1583, 1524, 1445 (ArC)。

本发明含有C=N结构和-OH基团的希夫碱配体和其铜配合物；通过紫外-可见吸收光谱法，熔点测定和CD光谱研究了希夫碱配体及含希夫碱配体的过渡金属铜(II)配合物与G4DNA的相互作用；研究它们对G4DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移情况；结果表明此希夫碱配体和金属铜配合物与G4DNA有较强的相互作用，特别是铜配合物对G4DNA有更高的亲和性。还研究了它们对人肝癌细胞（HepG2）的细胞毒性实验，希夫碱配体和金属铜配合物都表现出显著的抗肿瘤活性，配体NS和配合物CuNS的IC50值分别为：22.12和13.97 μM。含希夫碱配体的金属铜配合物呈现更好的药物活性，能促进G4DNA形成或者使之稳定。

所述的G4DNA为生工生化试剂，其序列为：5’-CATGGTGGTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTACCAC-3’。

附图说明

图1：随着G4DNA浓度增加，配体NS的紫外吸收光谱图；

图2：随着G4DNA浓度增加，配合物CuNS的紫外吸收光谱图；

图3：随着温度升高（40-90 ℃），配体NS、配合物CuNS与G4DNA作用的熔点图；

图4：配体NS与G4DNA作用的CD图；

图5：配合物CuNS与G4DNA作用的CD图；

图6：不同浓度的配体NS对G4DNA作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳图； 1：G4DNA； 2-5：G4DNA + NS(1,5,10,20,30 μM)；

图7：不同浓度的配配合物CuNS对G4DNA作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1：G4DNA； 2-5：G4DNA + CuNS(1,5,10,20,30 μM)。

图8：为配体NS及金属铜配合物CuNS对HepG2细胞的细胞活性图；

图9：配体NS的ORTEP图；

图10：铜配合物CuNS的ORTEP图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

希夫碱配体NS的合成：

在氮气保护下，将50 mg（0.316 mmol）的2,3-二氨基萘加入在装有10 mL的无水乙醇的圆底烧瓶中，待样品完全溶解后，将0.639 mmol水杨醛慢慢的滴加到2,3-二氨基萘的乙醇溶剂中，先室温搅拌10 min，然后加热回流4小时，伴有大量的橙黄色固体生成。反应结束冷却至室温，过滤，收集固体部分，真空干燥，将固体溶解在3 ml二氯甲烷中，并且滴入0.5 ml正己烷，静置2天后，有橙黄色的晶体析出。

实施例2

铜配合物的合成如下：

在氮气保护下，将28 mg（0.0764 mmol）的NS加入到装有8 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，待样品完全溶解后，加入用无水乙醇溶解的15.3 mg（0.0764 mmol）的Cu(CH₃COO)₂·H₂O，加热回流4小时，伴有大量的黄褐色固体生成。反应结束冷却至室温，过滤，并用95%的乙醇洗涤数次，真空干燥，收集固体部分。将固体溶于少量DMSO中，并滴入少量乙腈重结晶。几天后，有针状的黄褐色晶体析出。得到黄褐色固体20 mg，产率为58.7%。Positive ESI-MS (CH₂Cl₂): m/z = 428.0({M+H})。 Anal. Calcd for C₂₄H₁₈N₂O₃Cu·0.5H₂O: C, 63.30；H, 4.18；N, 6.15； Found: C, 63.01；H, 4.26；N, 6.39. IR (KBr disk, ν/cm^-1): 1605 (C = N), 1583, 1524, 1445 (ArC)。

实施例3

      通过紫外-可见吸收光谱、熔点测定、圆二色谱法和切割实验研究表明配体NS和金属铜配合物CuNS与G4DNA有较强的相互作用，特别是铜配合物对G4DNA的形成有明显的稳定作用。

（1）在浓度为（4.0×10^-6 mol/L）配体NS和金属铜配合物CuNS溶液中（6.6% DMSO-TBS）分别加入一系列不同量（0-20 μM）的G4DNA，并测定它们在250-800 nm范围内的紫外可见吸收光谱的变化。如图1所示，配体NS在340 nm处的吸光度随着G4DNA浓度的增大而减小，从紫外-可见吸收谱图可计算出其键合常数约5.2×10⁵ M^-1；金属铜配合物CuNS(图2)在420 nm处的吸光度随着G4DNA的浓度的增大而减小，从吸收谱图计算出其键合常数约1.5×10⁶ M^-1。结果表明CuNS对G4DNA有更高的亲和性。

（2）G4DNA熔点实验是通过改变温度，监测G4DNA在295 nm处的紫外可见吸收光谱的变化。在浓度为（1.0×10^-5mol/L）的G4DNA溶液（1.6% DMSO-TBS, pH 7.2）加入配体NS和金属铜配合物CuNS后的紫外可见吸收光谱的变化。如图3所示，配体NS与G4DNA作用后的熔点比G4DNA自身的熔点高出6℃；金属铜配合物CuNS与G4DNA作用后的熔点比G4DNA自身的熔点高出12 ℃。说明金属铜配合物与G4DNA作用后可以使其更稳定。

（3）圆二色谱用美国AVIV Model 420 圆二色谱仪测量。光谱扫描使用1 mm石英比色皿；仪器参数：波长范围200-350 nm，带宽（bandwith）1 nm，步长（step size）2.5 nm，数据点读数时间是0.5 s。缓冲基线也在同一比色池中测量得到，所有样品测试前于室温放置平衡，所测样品的旋光度数值均扣除缓冲液自身所造成的背景值。每个测试样品重复扫描至少三次取平均值。浓度为（1.0×10^-5 mol/L）G4DNA溶液（TBS缓冲液，pH 7.2）并分别逐滴加入一系列不同量的配体NS和金属铜配合物CuNS（C_M/C_G4DNA = 0.1-4.0，M代表配体NS和金属铜配合物CuNS，并用圆二色谱仪来测定它们的光谱变化。如图所示，随着配体NS（图4）和金属铜配合物CuNS（图5）浓度的的增大，其G4DNA的构象都有不同的变化。

（4）G4DNA用作切割实验的底物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行G4DNA切割实验，包含0.7μL的G4DNA(置于95 ℃的环境下5分钟，TBS缓冲液，pH 7.2),待自然冷却至室温后，加入分别含不同浓度的配体NS和金属铜配合物CuNS的溶液，总体积为15 μL。样品在室温下反应12 h后，加入3 μL上样缓冲液（含有0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，60%甘油）。将样品加在20%的聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，以TBE（Tris-boric acid-EDTA (TBE) buffer, pH = 8.0）做电泳缓冲液，电泳约3小时。如图6所示，随着配体NS的浓度增大，聚丙烯酰胺电泳中，G4DNA没有新的带出现；而随着金属铜配合物CuNS浓度的的增大（图7），聚丙烯酰胺电泳中，G4DNA有新的带出现，且迁移速率较慢。实验结果表明铜配合物对G4DNA有明显的切割效果。

实施例5

对HepG2细胞进行了细胞毒性实验的研究，用MTT法检测细胞的存活性。HepG2细胞接种于96孔细胞培养板培养3天，密度为4×10⁶个/孔，并使细胞粘附在添加的不同浓度的配体NS及金属铜配合物CuNS生长后，置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养24 h。培养板用培养液洗两次，然后加入MTT，再培养4小时；用没有经化合物处理的细胞作为对照。相对细胞毒性用公式[OD_sample-OD_blank]/[ OD_control-OD_blank]×100计算得到百分数表示，而且每个实验重复三次。如图8所示，配体NS和配合物CuNS表现出显著的抗肿瘤活性。配体NS和配合物CuNS的IC50值分别为：22.12和13.97 μM。

Claims (4)

1.一种希夫碱配体NS，其特征在于其如式(I)所示：

。

2.如权利要求1所述的希夫碱配体NS的金属铜(II)配合物CuNS，其特征在于其如式(II)所示：

  式(II)中Cu为铜(II)离子。

3.如权利要求1所述的希夫碱配体NS，其特征在于其在制备抗肿瘤药物的应用。

4.如权利要求2所述的希夫碱配体NS的金属铜(II)配合物CuNS，其特征在于其在制备抗肿瘤药物的应用。

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