CN103439482A - 一种基于n,n’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用 - Google Patents

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本发明公开了一种基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用，该应用是以N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺作为颜色探针的生物传感试纸应用于双氧水、葡萄糖或前列腺特异性抗原的检测；以N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺作为颜色探针的生物传感试纸对双氧水具有特殊的变色反应，且稳定性强、灵敏度高、选择性好，检测方法快速、简单、经济，应用范围广。

Description

一种基于N,N’-二(三甲氧基硅烷基丙基)-戊二亚胺的生物传感试纸的应用
技术领域
本发明公开了一种基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用，属于生物传感器领域。
背景技术
席夫碱主要是指含有亚胺或甲亚胺特性基团（－RC=N－）的一类有机化合物，通常希夫碱是由胺和活性羰基缩合而成。应用方面比较广泛，可以应用于医学、催化、分析化学、腐蚀等领域。在医学领域，席夫碱具有抑菌、杀菌、抗肿瘤、抗病毒的生物活性；在催化领域，席夫碱的钴和镍配合物已经作为催化剂使用；在分析领域，席夫碱作为良好的配体，可以用来鉴别，鉴定金属离子和定量分析金属离子的含量；在腐蚀领域，某些芳香族的希夫碱经常作为铜的缓蚀剂；在光致变色领域，某些含有特性基团的希夫碱也具有独特的应用。
近年来，新型生物传感器的构建及应用发展迅速，在临床早期诊断、环境监测、食品检测等领域上得到了广泛应用。而很多传感器因其应用受仪器及相关技术和专业人员的限制而无法在许多发展中国家普及，所以构建一种简单、经济且无需借助精密仪器设备而能让终端使用者操作方便快捷的传感装置成为科研热门研究领域。基于颜色变化来实现检测的生物传感试纸，因其反应迅速、方便经济、操作简单等特点而受到众多科研工作者亲睐。
现有的定量检测双氧水、葡萄糖的方法包括电化学检测法，荧光检测法等。而检测前列腺特异性抗原的方法主要是酶联免疫法。但这些检测方法都依赖一定的仪器设备，而且较少有报道同一传感器能同时实现对上述多种物质的同时检测。基于颜色变化的生物传感试纸对双氧水、葡萄糖或前列腺特异性抗原的检测还未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用，以N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺作为颜色探针的生物传感试纸对双氧水有特异的变色反应，且稳定性强、灵敏度高、选择性好，快速、简单、经济地实现了双氧水、葡萄糖或前列腺特异性抗原的检测。
本发明提供了一种基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用，该应用是以N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺作为颜色探针的生物传感试纸应用于双氧水、葡萄糖或前列腺特异性抗原的检测。
所述的生物传感试纸是通过在3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中浸泡过的滤纸上滴加相对3-氨基丙基三甲氧基硅烷微量的戊二醛制得。
所述的双氧水的检测方法是在生物传感试纸上滴加待测双氧水溶液，在110～135℃下恒温6～12min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
所述的葡萄糖的检测方法是用壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定在生物传感试纸上，在固定了葡萄糖氧化酶的生物传感试纸上滴加待测葡萄糖溶液，先在37℃下反应6～12min，再在110～135℃下恒温6～12min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
所述的前列腺特异性抗原的检测方法是在生物传感试纸上用壳聚糖固定纳米金后，在纳米金表面组装前列腺特异性抗体，并用牛血清蛋白进行封闭；在封闭过的纳米金表面依次组装待测前列腺特异性抗原和二抗-纳米金棒-葡萄糖氧化酶复合物后，在所得生物传感滤纸上滴加葡萄糖溶液，先在37℃下反应6～12min，再在110～135℃下恒温8～10min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
所述的二抗-纳米金棒-葡萄糖氧化酶复合物由以下方法制备得到：用戊二醛将组装在纳米金棒上的半胱氨酸交联固定；再将固定了半胱氨酸的纳米金棒分散在葡萄糖氧化酶和前列腺特异性抗体混合溶液中反应后，即得。
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的制备方法是：将滤纸用打孔器制成直径为6mm的小圆片，将其于5～10vol%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）乙醇溶液中浸泡2～5分钟后，取出，至于室温下自然晾干，再将小圆片滴上15～20μL0.125vol%的戊二醛（GA）水溶液，出现砖红色，在500W红外灯下干燥10～15分钟，得到砖红色生物传感试纸。
本发明的N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的合成路线：
Figure BDA0000366847090000031
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对H2O2的检测方法：取待测双氧水溶液10μL滴于生物传感试纸上，5～10分钟后，将其置于110～135℃的烘箱中，6～12分钟后，拍下生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感试纸的颜色，进行比色分析。
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对葡萄糖的检测方法：在生物传感试纸上依次滴加10μL15mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，10μL0.5vol%的壳聚糖溶液，10μL待测葡萄糖溶液后，先在37℃水浴反应6～12分钟，再在110～135℃烘箱，恒温6～12分钟后，拍下生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感颜色的灰度值，进行比色分析。
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对前列腺特异性抗原的检测方法：先在生物传感试纸上滴加10μL0.5wt%壳聚糖，在500W红外灯下干燥10～15分钟；再滴加粒径为13nm的纳米金溶液5μL，在室温下培育1小时；再滴加5μL，100mg/mL的前列腺特异性抗原，室温下培育1h后；采用5μL1wt%的牛血清蛋白（BSA）进行封闭0.5小时；封闭完成后，将生物传感试纸先置于待测的前列腺特异性抗原溶液中，在室温下培育1小时；再在5μL二抗（Ab2）-纳米金棒（GNR）-葡萄糖氧化酶（GOx）的复合物中培育1小时；最后，在修饰完成的生物传感滤纸上滴加10μL10mM葡萄糖溶液，置于37℃水浴中，反应6～12分钟，再在110～135℃烘箱，恒温6～12分钟后，拍下生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感滤纸颜色的灰度值，进行比色分析；其中，复合物Ab2-GNR-GOx的合成方法：将合成的GNR分散于0.02M的半胱氨酸溶液中，组装2h，然后加入0.25vol%的戊二醛，交联反应1小时后；以8000rpm的转速离心10分钟，将离心出来的金棒分散在含有4mg/mL的葡萄糖氧化酶和100μg/mL的前列腺特异性抗体混合溶液中反应1小时，再以8000rpm的转速离心15分钟，得Ab2-GNR-GOx复合物，将其分散于1mL PBS中备用。
本发明的有益效果：本发明首次采用简单的方法由过量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷和戊二醛生成具有特殊砖红色的N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺化合物，并且意外发现该化合物在双氧水的氧化作用下，会发生颜色变化，将它作为颜色探针的生物传感试纸应用于双氧水的检测，有较高灵敏度，肉眼即可辨别其颜色变化，实现了双氧水的定性分析，并且，还发现随着双氧水的浓度由低到高变化，该化合物的颜色会出现有规律的变化（红—黄色—白色），完全可以借助Image2x软件实现双氧水的定量分析；此外，由N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺构建的生物传感试纸颜色明显，化学性能稳定，在室温下能长期保存不变色，适用范围广。在此研究的基础上，根据葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下会生成双氧水，而且生成的双氧水量与葡萄糖浓度成比例关系；发明人在所述生物传感试纸上固定葡萄糖氧化酶，实现了对葡萄糖进行检测，并具有较好的响应及线性范围；再根据传统的“三明治”夹心结构法，在所述的生物传感试纸上固定一抗，用GOx作为二抗标记物，利用结合的抗原数目与葡萄糖氧化酶的比例关系（抗原结合得越多，相应结合的葡萄糖氧化酶数目也越多，产生的双氧水也相应增加），实现了对前列腺特异性抗原的检测，灵敏度高、选择性好、重现性优。该生物传感试纸经济、简便、无需借助高端仪器设备，肉眼即可观察其颜色变化，应用前景广阔。
附图说明
【图1】为本发明的N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺红外谱图。
【图2】为实施例1的3-氨基丙基三甲氧基硅烷原料红外谱图。
【图3】为实施例2的不同浓度H2O2对本发明生物传感试纸的显色变化图及相应的标准曲线。
【图4】为实施例3的不同浓度葡萄糖对修饰后的生物传感试纸的显色变化图及相应的标准曲线。
【图5】为实施例4的不同浓度前列腺特异性抗原对修饰后的生物传感试纸的显色变化图及相应的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1
新型基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺生物传感试纸制作步骤如下：将滤纸用打孔器制成多个直径为6mm的小圆片，将其浸泡于5vol%的APTS乙醇溶液2分钟，取出至于室温下自然晾干，再将每个小圆片滴上15μL0.125vol%的GA水溶液，出现砖红色，在500W红外灯下干燥12分钟，而得到砖红色生物传感试纸。
用溶剂提取试纸上的砖红色化合物，通过红外测试如图1所示，对比图2的APTS原料谱图，从图中明显看到1654cm-1为明显的碳氮双键特征吸收峰，图1中相对图2的3349cm-1和3282cm-1的氨基双峰明显消失，说明APTS和GA生成了N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺。
实施例2
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对H2O2的检测方法：配备不同浓度的H2O2（0，2.5，5，10，30，50，70，100，300，500，1000mM），分别取10μL滴于各生物传感试纸上，5分钟后，将它们置于130℃的烘箱中，10分钟后，分别拍下各生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感试纸的颜色，进行比色分析，制得的标准曲线如图3所述。
实施例3
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对葡萄糖的检测方法：先在多张生物传感试纸上分别依次滴加10μL15mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，10μL0.5vol%的壳聚糖溶液，配备不同浓度葡萄糖溶液（0.25，0.5，0.75，1.0，2.5，5.0，7.5，10，15，20，30，60，80，100，500，1000mM）分别各取10μL滴加到各生物传感试纸上后，先在37℃水浴反应10分钟，再在130℃烘箱，恒温10分钟后，分别拍下各生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感颜色的灰度值，进行比色分析，制得的标准曲线如图4所示。
实施例4
本发明的基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸对前列腺特异性抗原的检测方法：先在多张生物传感试纸上分别滴加10μL0.5wt%壳聚糖，在500W红外灯下干燥15分钟；再滴加粒径为13nm的纳米金溶液5μL，在室温下培育1小时；再滴加5μL100mg/mL的前列腺特异性抗体，室温下培育1h后；采用5μL1wt%的BSA进行封闭0.5小时；封闭完成后，置于5μL浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，7.0，10ng/mL的前列腺特异性抗原中，在室温下培育1小时；再在5μL二抗（Ab2）-纳米金棒（GNR）-葡萄糖氧化酶（GOx）的复合物中培育1小时；最后，在各修饰完成的生物传感滤纸上分别滴加10μL10mM葡萄糖溶液，置于37℃水浴中，反应10分钟，再在120℃烘箱，恒温10分钟后，分别拍下各生物传感试纸的颜色，借助ImageJ2x分析生物传感滤纸颜色的灰度值，进行比色分析，制得标准曲线如图5所示。

Claims (6)

1.一种基于N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺的生物传感试纸的应用，其特征在于，以N,N’-二（三甲氧基硅烷基丙基）-戊二亚胺作为颜色探针的生物传感试纸应用于双氧水、葡萄糖或前列腺特异性抗原的检测。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物传感试纸是通过在3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中浸泡过的滤纸上滴加相对3-氨基丙基三甲氧基硅烷微量的戊二醛制得。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的双氧水的检测方法是在生物传感试纸上滴加待测双氧水溶液，在110～135℃下恒温6～12min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的葡萄糖的检测方法是用壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定在生物传感试纸上，在固定了葡萄糖氧化酶的生物传感试纸上滴加待测葡萄糖溶液，先在37℃下反应6～12min，再在110～135℃下恒温6～12min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的前列腺特异性抗原的检测方法是在生物传感试纸上用壳聚糖固定纳米金后，在纳米金表面组装前列腺特异性抗体，并用牛血清蛋白进行封闭；在封闭过的纳米金表面依次组装待测前列腺特异性抗原和二抗-纳米金棒-葡萄糖氧化酶复合物后，在所得生物传感滤纸上滴加葡萄糖溶液，先在37℃下反应6～12min，再在110～135℃下恒温8～10min后，通过ImageJ2x分析生物传感试纸颜色的灰度值，并进行比色分析。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的二抗-纳米金棒-葡萄糖氧化酶复合物由以下方法制备得到：用戊二醛将组装在纳米金棒上的半胱氨酸交联固定；再将固定了半胱氨酸的纳米金棒分散在葡萄糖氧化酶和前列腺特异性抗体混合溶液中反应后，即得。
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