CN104004038B - 一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要公开一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,具体是一种从江南星蕨中提取槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的方法,该方法包括江南星蕨原料有效成分超声提取和浸泡提取,树脂分离得到黄酮粗品和黄酮产品纯化等步骤。本发明提供的提取方法简便、快捷,得到的产品纯度高,可以达到96%左右,收率高,可以用于从江南星蕨中较大规模的制备槲皮素-3-甲氧基-7-<i>O</i>-<i>α</i>-<i>L</i>-阿拉伯(1→6)-<i>β</i>-<i>D</i>-葡萄糖苷,为该化合物今后的研究开发奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于天然药物有效成分提取及分离技术领域,具体涉及药物有效成分提取及分离技术领域,具体涉及一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,也是一种从江南星蕨中提取槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的方法。
背景技术
槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷,英文名:Quercetin-3-methylether-7-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside,黄色无定形粉末,是一种黄酮苷类化合物,mp:181~183℃,分子量:594,分子式:C27H30O15,盐酸镁粉反应呈阳性,Molish反应呈阳性,盐酸水解后纸色谱检出葡萄糖和阿拉伯糖,UV365下有强烈的紫外吸收。结构式如下:
江南星蕨Microsorumfortunei(T.Moore)Ching,又名大叶骨牌草、七星剑,旋鸡尾,为水龙骨科星蕨属植物,产于我国江南广大地区,陕西等地也有。分布于西南及陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、海南、广西等地。附生、土生均可,野外多生于海拔200-1800m的山坡林下、溪谷边树干或岩石上。在民间全草及根状茎均可入药,具有清热利湿、凉血止血、消肿止痛功效。可治疗流行性感冒、哮喘、支气管炎、黄疸、小儿惊风、肺痨咳嗽、痢疾、尿路感染、白带、风湿关节痛、吐血、便血、外伤出血、跌打损伤、蛇虫咬伤等症。目前,从江南星蕨全草中分离得到的化合物有:9(11)-羊齿烯,24-亚甲基环木菠萝烷醇乙酸酯和24-亚甲基环木菠萝烷酮,尿嘧啶,尿甙,马栗树皮素-3-羧酸,β-谷甾醇、谷甾醇β-D-吡喃葡萄糖苷、松脂素、槲皮素、槲皮素3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,瓦利苷和蕨素A。[周虹云,徐润生,程存归.江南星蕨的化学成分研究.中国现代应用药学杂志.2009,26(2):119-122]。
发明内容
本发明的目的是提供一种从江南星蕨中提取高纯度槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷黄酮单体的方法。
本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,包括以下步骤:
1)取粉碎过的干燥江南星蕨原料,置于超声提取器内,用体积浓度为60-90%的乙醇溶液在40-60℃条件下超声提取0.5-2h,提取结束后过滤,收集提取液,将过滤得到的滤渣加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液浸泡3-24h,浸泡结束后过滤,收集滤液,再次向滤渣中加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液,重复浸泡提取操作1-4次,合并所有提取液和滤液,并进行真空减压浓缩,得提取浸膏,备用;
2)向步骤1)得到的提取浸膏中加入其重量30-60倍的乙醇进行溶解,过滤,将得到的滤液用树脂吸附、装柱,依次用体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,收集体积浓度为40-50%乙醇水溶液洗脱馏分,减压浓缩成浸膏,并将得到的浸膏在50-60℃下真空减压干燥,即得到黄酮粗品,备用;
3)将步骤2)得到的黄酮粗品研碎,并置于烧杯中,加入蒸馏水后加热至60-80℃,用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性使粗品完全溶解,静置后过滤,将得到的滤液用浓HCl调节pH值为酸性,再次静置,冷却至不再产生沉淀,过滤,将得到的沉淀用水洗涤至中性,干燥即得到的黄酮中间品,备用;
4)将步骤3)得到的黄酮中间品用甲醇在温度为50℃超声波条件下溶解,溶解完毕后趁热用活性炭过滤,将得到的滤液在5℃条件下静置,析出淡黄色结晶物,干燥即得到黄酮单体纯品。
步骤1)所述的超声提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为江南星蕨原料重量的10-20倍;浸泡提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积为2-4倍柱体积。
所述的步骤2)中的树脂为D101或AB-8型大孔吸附树脂,或聚酰胺树脂。
步骤3)所述的溶解黄酮粗品的蒸馏水的加入量为其重量的10-15倍。
步骤3)所述的用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性时,pH值为7.2-8.5;用浓HCl调节pH值为酸性时,pH值为2.0-3.2.
步骤4)所述的甲醇的添加量为黄酮中间品重量的20-30倍。
本发明的有益效果
本发明提供的提取方法简便、快捷,得到的产品纯度高,可以达到96%左右,收率高,可以用于从江南星蕨中较大规模的制备槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷,为该化合物今后的研究开发奠定了基础。
附图说明
图1为本发明提取得到的槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的1HNMR图谱;
图2为本发明提取得到的槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的13CNMR图谱;
图3为槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷对照品HPLC图谱;
图4为槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷测试样品HPLC图谱。
具体实施方式
一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,包括以下步骤:
1)取粉碎过的干燥江南星蕨原料,置于超声提取器内,用体积浓度为60-90%的乙醇溶液在40-60℃条件下超声提取0.5-2h,提取结束后过滤,收集提取液,将过滤得到的滤渣加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液浸泡3-24h,浸泡结束后过滤,收集滤液,再次向滤渣中加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液,重复浸泡提取操作1-4次,合并所有提取液和滤液,并进行真空减压浓缩,得提取浸膏,备用;
2)向步骤1)得到的提取浸膏中加入其重量30-60倍的乙醇进行溶解,过滤,将得到的滤液用树脂吸附、装柱,依次用体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,收集体积浓度为40-50%乙醇水溶液洗脱馏分,减压浓缩成浸膏,并将得到的浸膏在50-60℃下真空减压干燥,即得到黄酮粗品,备用;
3)将步骤2)得到的黄酮粗品研碎,并置于烧杯中,加入蒸馏水后加热至60-80℃,用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性使粗品完全溶解,静置后过滤,将得到的滤液用浓HCl调节pH值为酸性,再次静置,冷却至不再产生沉淀,过滤,将得到的沉淀用水洗涤至中性,干燥即得到的黄酮中间品,备用;
4)将步骤3)得到的黄酮中间品用甲醇在温度为50℃超声波条件下溶解,溶解完毕后趁热用活性炭过滤,将得到的滤液在5℃条件下静置,析出淡黄色结晶物,干燥即得到黄酮单体纯品。
步骤1)所述的超声提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为江南星蕨原料重量的10-20倍;浸泡提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积为2-4倍柱体积。
所述的步骤2)中的树脂为D101或AB-8型大孔吸附树脂,或聚酰胺树脂。
步骤3)所述的溶解黄酮粗品的蒸馏水的加入量为其重量的10-15倍。
步骤3)所述的用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性时,pH值为7.2-8.5;用浓HCl调节pH值为酸性时,pH值为2.0-3.2.
步骤4)所述的甲醇的添加量为黄酮中间品重量的20-30倍。
槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷含量的测定:色谱柱:AgilentZorbaxSBC18色谱柱(4.6×250mm,5um);流动相:甲醇-乙腈-0.4%磷酸(15:5:80);流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:360nm。
所得到的槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷经HPLC、NMR、HR-MS测定化合物的结构,波谱图如图1-4所示,波谱数据如下:
黄色无定形粉末,mp181~183℃,盐酸镁粉反应呈阳性,molish反应呈阳性,盐酸水解后纸色谱检出葡糖糖和阿拉伯糖。ESI-MSm/z:593[M-H]-(分子式为C27H30O15)。
如图1所示:1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.72(5-OH),7.61(IH,d,J=2.0Hz,2'-H),7.49(1H,dd,J=8.4Hz,2.0Hz,6'-H),6.95(1H,d,J=8.4Hz,5'-H),6.76(1H,d,J=2.0Hz,8-H),6.46(1H,d,J=2.0Hz,6-H),5.11(IH,d,J=7.6Hz,1"-H),4.74(1H,d,J=2.0Hz,1"'-H),3.81(3H,s,3-OCH3).
如图2所示:13CNMR(100MHz,DMSO-dr):δ:156.2(C-2),138.1(C-3),178.3(C-4),161.2(C-5),99.4(C-6),163.1(C-7),94.6(C-8),156.2(C-9),106.1(C-10),121.0(C-1'),115.9(C-2'),145.4(C-3'),1491(C-4'),116.1(C-5'),120.9(C-6'),100.0(C-1''),73.3(C-2"),76.4(C-3"),70.0(C-4"),75.7(C-5"),67.1(C-6"),108.7(C-1'''),82.23(C-2"'),77.4(C-3"'),84.2(C-4"'),61.5(C-5"')。
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明:
实施例1:
一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,包括以下步骤:
1)取粉碎过的干燥江南星蕨原料1㎏,置于超声提取器内,用用其重量10倍的体积浓度为60%的乙醇溶液在40℃条件下超声提取2h,提取结束后过滤,收集提取液,将过滤得到的滤渣加入体积浓度为60%的乙醇溶液浸泡3h,乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10倍,浸泡结束后过滤,收集滤液,再次向滤渣中加入体积浓度为60%的乙醇溶液,重复浸泡提取操作4次,合并所有提取液和滤液,并进行真空减压浓缩,得提取浸膏,备用;
2)向步骤1)得到的提取浸膏中加入其重量30倍的乙醇进行溶解,过滤,将得到的滤液用D101型大孔吸附树脂吸附、装柱,依次用体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积为4倍柱体积,收集体积浓度为40-50%乙醇水溶液洗脱馏分,减压浓缩成浸膏,并将得到的浸膏在50-60℃下真空减压干燥,即得到黄酮粗品,共34g,备用;
3)将步骤2)得到的黄酮粗品研碎,并置于烧杯中,加入其重量15倍的蒸馏水后加热至80℃,用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为8.5使粗品完全溶解,静置后过滤,将得到的滤液用浓HCl调节pH值为2.0,再次静置,冷却至不再产生沉淀,过滤,将得到的沉淀用水洗涤至中性,干燥即得到的黄酮中间品,共16.5g,备用;
4)将步骤3)得到的黄酮中间品用其重量30倍的甲醇在温度为50℃超声波条件下溶解,溶解完毕后趁热用活性炭过滤,将得到的滤液在5℃条件下静置,析出淡黄色结晶物,干燥即得到黄酮单体纯品,共12.3g。
经测定,得到的产品中,槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷单体的含量为96.8%。
实施例2:
1)取粉碎过的干燥江南星蕨原料1㎏,置于超声提取器内,用体积浓度为90%的乙醇溶液在40℃条件下超声提取0.5h,乙醇溶液的添加量为江南星蕨原料重量的20倍,提取结束后过滤,收集提取液,将过滤得到的滤渣加入体积浓度为90%的乙醇溶液浸泡24h,乙醇溶液的添加量为滤渣重量的20倍,浸泡结束后过滤,收集滤液,再次向滤渣中加入体积浓度为90%的乙醇溶液,重复浸泡提取操作1次,合并所有提取液和滤液,并进行真空减压浓缩,得提取浸膏,备用;
2)向步骤1)得到的提取浸膏中加入其重量60倍的乙醇进行溶解,过滤,将得到的滤液用AB-8型大孔吸附树脂吸附、装柱,依次用体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积为2倍柱体积,收集体积浓度为40-50%乙醇水溶液洗脱馏分,减压浓缩成浸膏,并将得到的浸膏在50-60℃下真空减压干燥,即得到黄酮粗品,共30.8g,备用;
3)将步骤2)得到的黄酮粗品研碎,并置于烧杯中,加入其重量10倍的蒸馏水后加热至60℃,用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为7.2使粗品完全溶解,静置后过滤,将得到的滤液用浓HCl调节pH值为3.2,再次静置,冷却至不再产生沉淀,过滤,将得到的沉淀用水洗涤至中性,干燥即得到的黄酮中间品,共14.6g,备用;
4)将步骤3)得到的黄酮中间品用其重量20倍的甲醇在温度为50℃超声波条件下溶解,溶解完毕后趁热用活性炭过滤,将得到的滤液在5℃条件下静置,析出淡黄色结晶物,干燥即得到黄酮单体纯品,共11.2g。
经测定,得到的产品中,槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷单体的含量为95.7%。
活性测试
一.抗氧化活性研究
1.试验材料
槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷(由实施例1制备得到)。
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、无水乙醇、双氧水、抗坏血酸(VC)、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、盐酸(HC1)均为分析纯,大豆卵磷脂(>90%)。
2.方法
(1)清除超氧阴离子自由基(O-2·)的测定方法
用pH8.0、浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷稀释成不同的浓度梯度,各取1.5mL不同梯度溶液,然后依次加入0.5mLNBT(300μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mLNADH(468μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mLPMS(60μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),混匀后在25℃中水浴5分钟,取出在波长560nm处测定吸光度,空白对照组以缓冲液代替样品溶液。
E(O-2·)(%)=(1-A1/A0)×100(1)
式中:E(O-2·)为样品O-2·的清除率(%);A1为样品吸光度;A0为空白吸光度。
(2)清除DPPH自由基的测定方法
将槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷样品稀释成不同的浓度梯度,各取2mL上述浓度的溶液于试管中,再加入2mL浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液,混合均匀,反应20分钟,3500r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517nm处测其吸光度为Ai;另各取2mL上述浓度的溶液于试管中,分别加入无水乙醇2mL,反应20分钟,3500r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517nm处测其吸光度为Aj;以2mL0.04mg/mLDPPH和2mL无水乙醇反应作为参比,其吸光度记为A0。
E(DPPH)(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100(2)
式中:E(DPPH)为样品对DPPH自由基的清除率(%);A0为2mLDPPH溶液+2mL无水乙醇的吸光度;Ai为2mLDPPH溶液+2mL样品溶液的吸光度;Aj为2mL无水乙醇+2mL样品的吸光度。
(3)清除羟自由基(·OH)的测定方法
将槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷用双蒸水配制成不同浓度梯度,各取2mL上述浓度的溶液,依次加入2mL6mmol/L的FeSO4、2mL6mmol/L的H2O2,混匀后静置10分钟,再加入2mL6mmol/L水杨酸,混匀,静置30分钟,在波长510nm处测其吸光度记为Ai,当用双蒸水代替水杨酸时的吸光度记为Aj。空白对照组以双蒸水代替样品溶液吸光度记为A0。
E(·OH)(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100
式中:E(·OH)为羟自由基的清除率(%);Ai为槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷反应的吸光度;A0为空白吸光度;Aj为无水杨酸参加反应时槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的吸光度。
(4)抗脂质体过氧化活性的测定
在10mL比色管中加入不同质量浓度的样品溶液1.00mL,卵磷脂溶液1.0mL,0.4mmol/LFeSO41.0mL,混匀,于37℃水浴中放置60分钟,再加入三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HC1)混合2.0mL,100℃水浴15分钟后急速冷却,以3000r/min离心10分钟,取上清液在波长532nm处测定吸光度,以蒸馏水作参比,VC为对照,计算抑制率。
抑制率/%=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100
式中:A0为空白对照液的吸光度;Ax为加入样品溶液后的吸光度;Ax0为不加卵磷脂的样品溶液吸光度。
3.结果
(1)清除超氧阴离子自由基(O2-·)
在所选质量浓度范围内,槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着质量浓度的增大,对超氧阴离子自由基的清除作用增强,呈现量效关系。虽然槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷的清除O-2·效果不如VC强,但其已经表现出很强的清除O-2·的效果。
(2)清除DPPH自由基
DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基,对其清除的效果表明受试药物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷表现出很强的清除DPPH自由基的能力。
(3)清除羟自由基(·OH)
羟基自由基是最强的氧化剂,在生物体内几乎可以和所有细胞成分发生反应,对机体危害很大。槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷和VC相比有类似的清楚羟基自由基效果。
(4)抗脂质体过氧化活性
脂质过氧化损伤与许多疾病的发生有关,如肿瘤、衰老、心脑血管、自身免疫疾病等。槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷对Fe2+引发的卵磷脂脂质体过氧化有抑制作用,随着样品质量浓度的增加抑制率增强。
二、慢性酒精性肝损伤修复实验
1.实验材料
供试样品:槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷(实施例1制备得到)。
酒精(分析纯,天津市福晨化学试剂厂)造模,采用水飞蓟素(由德国马博士药厂生产)作为阳性对照,SD级Wistar大鼠,雌雄各半,体重190-250g,随机分组,标准饲料喂养,自由进水(河南科技大学实验动物中心提供)。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、血清冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、血清白蛋白(ALB)试剂盒和血清球蛋白(GLB)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)。
2.试验方法
将大鼠随机分组,分为:(1)正常对照组:以蒸馏水灌胃,1次/天,皮下注射植物油,2次/周,并持续6周;(2)模型组:10%酒精+蒸馏水灌胃,1次/天,持续6周;(3)阳性对照组:10%酒精+蒸馏水灌胃,1次/天,按1:1的比例皮下注射水飞蓟素+植物油,2次/周,持续6周;(4)剂量组:10%酒精,灌胃,同时划分高、中、低剂量组,并分别按200mg/kg/天、100mg/kg/天、50mg/kg/天的量给高、中、低剂量组予供试样品,持续6周。
3.实验数据与结果分析
表5槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷对酒精所致小鼠慢性肝损伤血清TG、ALT、AST的影响
样品对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用分析:与正常对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较*p<0.05。实验结果表明:与空白对照组比较,模型对照组小鼠血清ALT、AST、TG含量显著升高(p<0.05),肝组织中TG、MDA含量显著升高;样品高、中、低剂量组可显著降低小鼠血清ALT、AST、TG含量和肝组织中MDA含量,呈剂量依赖性,说明槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷具有一定的肝损伤修复作用。
Claims (7)
1.一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)取粉碎过的干燥江南星蕨原料,置于超声提取器内,用体积浓度为60-90%的乙醇溶液在40-60℃条件下超声提取0.5-2h,提取结束后过滤,收集提取液,将过滤得到的滤渣加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液浸泡3-24h,浸泡结束后过滤,收集滤液,再次向滤渣中加入体积浓度为60-90%的乙醇溶液,重复浸泡提取操作1-4次,合并所有提取液和滤液,并进行真空减压浓缩,得提取浸膏,备用;
2)向步骤1)得到的提取浸膏中加入其重量30-60倍的乙醇进行溶解,过滤,将得到的滤液用树脂吸附、装柱,依次用体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱,收集体积浓度为40-50%乙醇水溶液洗脱馏分,减压浓缩成浸膏,并将得到的浸膏在50-60℃下真空减压干燥,即得到黄酮粗品,备用;
3)将步骤2)得到的黄酮粗品研碎,并置于烧杯中,加入蒸馏水后加热至60-80℃,用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性使粗品完全溶解,静置后过滤,将得到的滤液用浓HCl调节pH值为酸性,再次静置,冷却至不再产生沉淀,过滤,将得到的沉淀用水洗涤至中性,干燥即得到的黄酮中间品,备用;
4)将步骤3)得到的黄酮中间品用甲醇在温度为50℃超声波条件下溶解,溶解完毕后趁热用活性炭过滤,将得到的滤液在5℃条件下静置,析出淡黄色结晶物,干燥即得到黄酮单体纯品,其中黄酮单体是指槲皮素-3-甲氧基-7-O-α-L-阿拉伯(1→6)-β-D-葡萄糖苷。
2.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:步骤1)所述的超声提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为江南星蕨原料重量的10-20倍;浸泡提取用的体积浓度为60-90%的乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
3.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积为2-4倍柱体积。
4.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:所述的步骤2)中的树脂为D101或AB-8型大孔吸附树脂,或者聚酰胺树脂。
5.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:步骤3)所述的溶解黄酮粗品的蒸馏水的加入量为其重量的10-15倍。
6.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:步骤3)所述的用质量浓度为20%的NaOH调节pH值为弱碱性时,pH值为7.2-8.5;用浓HCl调节pH值为酸性时,pH值为2.0-3.2。
7.如权利要求1所述的一种从江南星蕨中提取黄酮单体的方法,其特征在于:步骤4)所述的甲醇的添加量为黄酮中间品重量的20-30倍。
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