CN104003925B - 吲哚酮化合物或其衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(a)所示的吲哚酮化合物或其衍生物及其用途。本发明所解决的技术问题是提供了吲哚酮化合物或其衍生物及其用途。本发明采用氘取代吲哚酮化合物得到的一类氘富集的吲哚酮化合物，上述吲哚酮化合物，可同时作用于血管生成过程中涉及的3种关键受体家族—血管内皮生长因子受体(VEGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，抑制血管生成，从而达到治疗癌症的效果，上述氘代吲哚酮化合物或其衍生物作为药物具有高效的优点。

Description

吲哚酮化合物或其衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及吲哚酮化合物或其衍生物及其用途，属于化学医药技术领域。
背景技术
Nintedanib(BIBF1120)，其结构式如下：
是一种新型口服有效的血管抑制剂，可同时作用于血管生成过程中涉及的3中关键受体家族—血管内皮生长因子受体(VEGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。血管生成抑制剂抑制肿瘤周围以及内部血管形成，继而降低了肿瘤的氧气和营养供给，从而导致肿瘤细胞缩小、死亡。这种抗肿瘤的治疗方法与传统的化疗方法相比，有较少的副作用。
Nintedanib(BIBF1120)对多种肿瘤如肝癌、肺癌、直肠癌、子宫癌、脑癌转移性肠癌等等有较好疗效。临床一期数据表明：BIBF1120单一疗法在晚期的恶性肿瘤耐的治疗中耐受性良好。BIBF1120对于治疗复发性晚期非小细胞肺癌患者的II期临床双盲实验表明，在类似的患者群体中，BIBF1120相比其他血管生成抑制剂表现出较好的数据，至于安全方面，高血压、出血和血栓栓塞的发生率也较低，没有病人出现手脚综合症。
氘是通过从大量水多次蒸馏得到D2O(重水)而来的。通过重水发生H-D交换，可以得到期望位点氘代的化合物。老鼠和狗的10％-15％体液的氢用氘长期代替，未发现明显影响，尽管当氘的浓度升高至25％普遍对这些生物有毒。根据Wallace等研究，即使人体内重水(D2O)占体液的浓度高达23％时，在短期内未发现毒性。
氘代药物由于其代谢方面与全氢化合物存在相当大的区别，C-D键通常情况下比C-H键稳定6-10倍，这些更强的键很难断裂，可以降低键的断裂速率，这个效应被称作同位素效应(KIE)。这一优点可直接影响某些药物的吸收、分布、代谢和排泄等属性。从而提高药物的安全性、有效性和耐受性，延长其半衰期。而且氘代化合物保持了与母体化合物相同的物理化学性质(溶解性、熔点和与受体结合的能力等)。
氘富集化合物或药物相对于母体化合物有下面几个特点：
1)缩短药物研发周期，减少药物研发成本和降低研发风险；
2)氘富集药物相对于母体可能更安全，或减少有毒代谢物的生成；
3)氘富集药物相对于母体作用更长时间或更好的疗效；
4)氘富集药物相对于母体，可能降低单次给药剂量；
5)有可能减少不同患者之间对药物的不同反应。
虽然氘代化合物具有上述优点，但是，并非所有的氘代化合物都有比原本化合物更好的效果，氘代位置的不同直接影响药物的疗效和药物的半衰期。目前为止，未见吲哚酮化合物Nintedanib氘代的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为临床提供一种新的预防或治疗癌症药物：一类新的吲哚酮化合物或其衍生物。
本发明的技术方案：通式(a)所示吲哚酮化合物
其中，R1、R24、R25每一个独立表示未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22或R23每一个独立表示H或D；
式(a)所示化合物至少有一个D。
进一步地，在通式(a)的基础上，优选R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22或R23每一个独立表示H，其结构式如下通式(b)所示：
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C2烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为-CH2D、-CHD2或-CD3。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为-CD3；其结构式如下通式(c)所示：
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为未氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3或-CH2CH3。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3；其结构式如下通式(d)所示：
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为未氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为-CH3或-CH2CH3。
进一步地，优选本发明所述化合物为：
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述吲哚酮化合物的各种晶型、其药学上可接受的盐或其溶剂化合物。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一类预防或治疗癌症的药物，其活性成分包含上述吲哚酮化合物或上述吲哚酮化合物的各种晶型、其药学上可接受的盐或其溶剂化合物。
本发明具有的有益效果：本发明所述的吲哚酮化合物，通过氘取代吲哚酮化合物Nintedanib形成了氘富集化合物，本发明所述的吲哚酮化合物具有较高的血药浓度，本发明化合物B的血药浓度远高于Nintedanib，使药物在体内作用时间长，延长了吲哚酮化合物的抗癌半衰期，从而延长药效。
附图说明
图1是小鼠单次灌胃给予Ninedanib后的血浆药物浓度-时间曲线；
图2是小鼠单次灌胃给予化合物A后的血浆药物浓度-时间曲线；
图3是小鼠单次灌胃给予化合物B后的血浆药物浓度-时间曲线；
图4是小鼠单次灌胃给予化合物C后的血浆药物浓度-时间曲线；
图5是小鼠单次灌胃给予Ninedanib、化合物A、B和C后的血浆药物浓度-时间曲线；
图6是BIBF1120、化合物B在体内抗肿瘤活性实验中肿瘤体积生长曲线；
图7是BIBF1120、化合物B在体内抗肿瘤活性实验中小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
本发明所要解决的技术问题是为临床提供一种新的预防或治疗癌症药物：一类新的吲哚酮化合物或其衍生物。
本发明的技术方案：通式(a)所示吲哚酮化合物
其中，R1、R24、R25每一个独立表示未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22或R23每一个独立表示H或D；
式(a)所示化合物至少有一个D。
由于本发明化合物是氘代化合物，所以结构式中至少有一个D。
进一步地，在通式(a)的基础上，优选R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22或R23每一个独立表示H，最终得到化合物的结构式如下通式(b)所示：
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C2烷基。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为-CH2D、-CHD2或-CD3。
进一步地，在通式(b)的基础上，优选R24为-CD3；得到化合物的结构式如下通式(c)所示：
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为未氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3或-CH2CH3。
进一步地，在通式(c)的基础上，优选R1为-CH3；得到化合物的结构式如下通式(d)所示：
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为未氘代的、一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为未氘代的C1～C4烷基。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
进一步地，在通式(d)的基础上，优选R25为-CH3或-CH2CH3。
进一步地，优选本发明所述化合物为：
本发明所述吲哚酮化合物可以制成各种晶型。
为了更便于临床应用，本发明所述的吲哚酮化合物可以制成药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的盐是上述吲哚酮化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐，酸加成盐包括与提供医药上可接受的阴离子所形成的盐，如与卤化氢、硫酸、磷酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸形成的盐。碱加成盐包括碱金属盐或碱土金属盐。
本发明吲哚酮化合物可以形成脂质悬浮液，脂质悬浮液的主要成分包括脂质载体、增稠剂及助流剂/增溶剂，脂质载体包括玉米油甘油酯、二乙二醇单乙基醚、乙醇、甘油、聚乙二醇四氢呋喃甲基醚(glycofurol)、聚乙二醇甘油(macrogolycerol)、辛基癸酸酯、聚乙二醇甘油亚油酸酯、中链部分甘油酯，中链甘油三酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚氧蓖麻油、聚氧氢化蓖麻油、丙二醇单辛酸酯、丙二醇单月桂酸酯、精制豆油、三醋酸甘油酯和柠檬酸三乙酯中至少一种；该增稠剂系包括形成油凝胶的赋形剂，如胶体硅石或膨润土、高粘度之亲酯性或两亲性赋形剂，如聚氧氢化蓖麻油、氢化植物油聚乙二醇甘油-羟基硬脂酸酯、聚乙二醇甘油-蓖麻油酸酯或硬脂肪；助流剂/增溶剂系选自卵磷脂，一种或多种聚乙二醇甘油类、聚乙二醇甘油-羟基硬脂酸酯或聚乙二醇甘油-蓖麻油酸酯。
本发明所述吲哚酮化合物制成的脂质悬浮液采用已知生产制剂的常规方法制备，即藉由在预定温度，依预定顺序混合该等成分，获得均质悬浮液。
上述的制剂可加入医药胶囊内，优选软质明胶胶囊，该胶囊壳包括作为增塑剂的甘油、硬明胶或羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊，视情况可密封或带状包装。该胶囊医药剂型可藉由文献中已知生产胶囊之常规方法制备。该软质明胶胶囊可藉由文献中已知生产软质明胶胶囊之常规方法制备，所述的胶囊可包装于适宜的玻璃容器、柔软塑料容器、铝袋或双层聚乙烯(poly)袋中。
本发明所述吲哚酮化合物可制成溶剂化合物，如水溶剂化合物。
本发明所述吲哚酮化合物的制备方法，包括如下步骤：
通式(a)所示化合物的合成路线如下所示：
将化合物9和化合物15的氘代甲醇悬浮液加热回流6～10h，冷却，持续搅拌，抽滤，甲醇洗涤，干燥得产品，即通式(a)所示结构的化合物。
进一步地，优选所述化合物9的合成路线如下所示：
将溶有KOH的CH3OH溶液加入到化合物8的氘代甲醇悬浮液中,反应体系继续搅拌15～45min，冷却，继续搅拌1～3h，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到化合物9。
进一步地，优选所述化合物8的合成包括如下步骤：
所述化合物8的合成路线如下所示：
取化合物6悬浮于甲苯中,向其中加入乙酸酐，对体系加热到90～120℃，慢慢加入化合物7，继续反应，待易挥发产物挥发出去，加入甲苯保持体系浓度不变，体系冷却，搅拌，抽滤得到粗品，依次用甲苯、甲苯与乙酸乙酯的混合液洗，干燥得到化合物8。
进一步地，优选所述化合物6的合成路线如下所示：
将氯乙酸酐加入到化合物5的甲苯悬浮液中，回流加热2～5h，冷却，然后加入甲基环己烷，搅拌冷却至室温，固液分离得到粗品，用冷的CH3OH洗涤，干燥得白色固体即化合物6。
进一步地，优选所述化合物5的合成路线如下所示：
将化合物4溶于乙酸中，加入Pd/C，在常压氢气压力下进行反应，反应完毕，过滤除去催化剂，蒸去溶剂，用少量乙酸乙酯洗涤产品，过滤，化合物5。
进一步地，优选所述化合物4的合成路线如下所示：
将溶于DMF的化合物2和化合物3的混合溶液滴加到叔丁醇钾的DMF溶液中，滴加完毕，在0～-15℃反应，TLC检测反应是否完全，反应完毕，将反应液倒入冰水与浓HCl的混合溶液中，用乙酸乙酯萃取，然后用饱和NaCl洗涤，干燥，柱层析分离，得到粗品化合物4。
其中，将反应液倒入冰水与浓HCl的混合溶液中的目的在于降低酸碱反应的危险，柱层析分离的目的是分离纯化产物。
进一步地，优选所述化合物2的合成路线如下所示：
将化合物1加入氘代甲醇或甲醇中，加入浓硫酸，于80～110℃微波反应，反应完毕，加入二氯甲烷，依次用饱和NaHCO3和饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤，旋干，得到化合物2。
其中，二氯甲烷的作用是稀释、萃取。
进一步地，优选所述化合物15的合成路线如下所示：
将化合物12溶于甲苯中，加热至30～50℃，向其中滴加化合物13，加热搅拌1～4h，降温，水洗，用异丙醇稀释甲苯的溶液体系，加入Pd/C，通入H2，搅拌，过滤除去催化剂，旋出溶剂，残留物用乙酸乙酯/石油醚重结晶，用石油醚洗涤，干燥，得到化合物15。
其中，用异丙醇稀释甲苯的溶液体系的目的在于助溶。
进一步地，优选所述化合物12的合成包括如下步骤：
所述化合物12的合成路线如下所示：
将化合物10加入乙酸乙酯中，加热至50～70，向其中加入化合物11和乙酸乙酯溶液，回流，降温至60～80℃，然后加入环己烷，结晶，冷却，搅拌，过滤，用环己烷洗，干燥，化合物12。
上述制备方法中可以采用TLC检测反应物反应的进程。
上述合成吲哚酮化合物的方法中的原料氘代化合物，部分为由原料化合物经氘代制得，部分购买所得。
本发明所述吲哚酮化合物或本发明所述吲哚酮化合物的各种晶型、其药学上可接受的盐或其溶剂化合物在制备治疗或预防癌症以及相关的疾病药物中的应用。
所述的癌症包括肝癌、肺癌、直肠癌、子宫癌、脑癌或转移性肠癌。
本发明提供了一类预防或治疗癌症的药物，其活性成分包含上述吲哚酮化合物或上述吲哚酮化合物的各种晶型、其药学上可接受的盐或其溶剂化合物。
本发明预防或治疗癌症的药物的制备方法，将所述的吲哚酮化合物、上述吲哚酮化合物的各种晶型、其药学上可接受的盐和其溶剂化合物中的一种或多种和药学上可接受的载体进行混合，制成预防或治疗癌症药物。
上述的预防或治疗癌症的药物可制成各种剂型，包括注射剂、囊剂、片剂、丸剂、散剂或颗粒剂。
通过以下具体实施例，可以进一步了解本发明，但以下实施例并不是对发明的限定，而是由本发明的权利要求书和说明书限定。
实施例1化合物A:(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
化合物9-1的合成路线如下所示：
化合物2-1：间硝基苯甲酸三氘甲酯的制备
2.0g间硝基苯甲酸(1-1)加入到10mLCD3OD中，其中，CD3OD市售的，加入80mg98wt％的浓硫酸，于100℃微波反应10分钟，加入100mLCH2Cl2萃取，依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤，旋干，得到产品化合物间硝基苯甲酸三氘甲酯(2-1)1.95g，收率为88.5％。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；8.86(s,1H)；8.40(m,2H)；7.68(t,1H)；HRMS:184.0560。
化合物4-1：4-(2-三氘甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸三氘甲酯的制备
3.93g叔丁醇钾(35mmol)溶于30mLDMF中，冷却到-10℃，将溶于5mLDMF的间硝基苯甲酸三氘甲酯(2-1)(2.72g，15mmol)和氯乙酸三氘甲酯(3-1)(1.84g，16.5mmol)的混合溶液滴加到上述溶液中，滴加完后，在-10℃条件下反应至TLC检测不到原料，反应液倒入冰水(50mL)与浓盐酸(17mL)的混合溶液中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，干燥，旋干，柱层析分离，得到化合物4-(2-三氘甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸三氘甲酯(4-1)粗品2.36g。
化合物5-1：2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
将4-(2-三氘甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸三氘甲酯(4-1)(1.982g，7.65mmol)溶于40mL乙酸中，加入250mg10％的Pd/C，10％是指Pd在碳中的含量；在常压氢气压力下40℃反应过夜。过滤除去催化剂，蒸去溶剂，用少量乙酸乙酯洗涤产品，过滤，得到0.61g(产率为41％)产品化合物2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(5-1)。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；3.56(s,2H)；7.33(s,1H)重叠到7.34(d,1H)；7.57(d,1H)；10.53(s,1H)；HRMS:194.0766。
化合物6-1：1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
室温下，2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(5-1)(4.0g，20.71mmol)悬浮于12mL的甲苯中，将氯乙酸酐(5.4g，30.95mmol)加入到上述悬浮液中，加热回流3h，冷却到80℃，30min加入甲基环己烷(6mL)，悬浮液搅拌冷却到室温，抽滤得到粗品，用冷的甲醇(4mL)洗涤，干燥得白色固体5.155g(产率为93.5％)，即化合物1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(6-1)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.66(s,1H)；7.86(d,1H)；7.52(d,1H)；4.98(s,2H)；3.88(s,2H)；.HRMS：270.0488。
化合物8-1：(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6甲酸三氘甲酯的制备
环境温度下，1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(6-1)(1.2g，4.5mmol)悬浮于甲苯(6mL)中，向其中加入乙酸酐(1.62g，15.7mmol)，体系加热到110℃，1h内加入原苯甲酸三甲酯(7-1)(2.0g，10.8mmol),继续反应3h，易挥发产物挥发出去，加入甲苯(4mL)保持体系浓度不变，体系冷却到5℃，搅拌1h，抽滤得到粗品，依次用甲苯、甲苯与乙酸乙酯(1：1)的混合液洗，干燥得到1.63g淡黄色固体即化合物(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6甲酸三氘甲酯(8-1)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.73(d,1H)；8.09(d,1H)；7.90(dd,1H)；7.61-7.48(m,5H)；4.85(s,2H)；3.78(s,3H)；HRMS:388.0915。
化合物9-1：(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
溶有KOH(41mg，0.6mmol)的甲醇(0.4mL)溶液加入到63℃的(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(8-1)(800mg,2mmol)的氘代甲醇-d4(3.2mL)悬浮液中，反应体系继续搅拌30min，冷却到0℃，0℃下继续搅拌2h，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到600mg(产率为94.6％)黄色固体即化合物(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(9-1)。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；8.08(s,1H)；7.88(d,1H)；7.75(m,1H)；7.52-7.56(m,3H)；7.40-7.45(m,3H)；3.74(s,3H)；HRMS:312.1181。
化合物15-1的合成路线如下所示：
化合物12-1：2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺的制备
将N-甲基-4-硝基苯胺(10-1)(2.5g，16.43mmol)加入乙酸乙酯(3mL)中，加热到60℃，15分钟内加入氯乙酸酐(11-1)(3.25g，19mmol)乙酸乙酯(8mL)溶液，回流1h，降温到75℃，然后加入10mL环己烷，60℃结出晶体，冷却到0℃，搅拌1h，过滤，用环己烷洗涤，干燥，得到白色晶体3.2g(产率为85.2％)即化合物2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺(12-1)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.29(d,2H)；7.69(d,2H)；4.35(s,2H)；3.33(s,3H)；HRMS:228.0322。
化合物15-1：N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺的制备
2g2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺(12-1)溶于15mL甲苯中，加热到40℃，在30min内滴加N-甲基哌嗪(13-1)(2.19g，2.5eq)，加热搅拌2h，此时控制温度为55℃，搅拌完毕，降到室温，加入5mL水洗，用15mL异丙醇稀释甲苯的溶液体系，加入100mgPd/C(10％)，通入氢气(4bar)，常温搅拌3h，过滤除去催化剂，旋出溶剂，残留物用乙酸乙酯/石油醚重结晶，用石油醚洗涤，干燥，得到白色晶体2.02g(产率为88.0％)即化合物N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺(15-1)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；6.90(d,2H)；6.65(d,2H)，5.22(2H)；3.04(s,3H)；2.79(s,2H)；2.32(m,4H)；2.23(m,4H)；2.10(s,3H)；HRMS:262.1774。
化合物A的合成路线如下所示：
化合物A：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(9-1)(200mg,0.64mmol)和N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺(15-1)(171mg,0.65mmol)的氘代甲醇-d4(1.8mL)悬浮液加热回流8h，缓慢冷却到10℃，10℃下继续搅拌1h，抽滤，冷甲醇洗，干燥得310mg(89％)黄色固体即化合物(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(A)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；2.00-2.35(m,11H)；2.7(s,2H)；3.06(s,3H)；5.82(d,1H)；6.87(d,2H)；7.11(d,2H)；7.17(d,1H)；7.40-7.60(m,6H)；10.94(s,1H)；12.22(s,1H)；HRMS：542.2710。
其中，氯乙酸三氘甲酯的制备方法如下：
氯乙酸三氘甲酯的生产方法:将5g的氯乙酰氯溶于20mL干燥的二氯甲烷中，0℃下，1.76g的氘代甲醇(CD3OD)缓慢加入到体系中，搅拌1h，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到氯乙酸三氘甲酯。
氯乙酸三氘甲酯HRMS：111.0162。
实施例2化合物B：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
化合物9-2的合成路线如下所示：
化合物2-2：间硝基苯甲酸甲酯的制备
2.0g间硝基苯甲酸(1-1)加入到10mL甲醇中，加入80mg98wt％的浓硫酸，于100℃微波反应10分钟，加入100mLCH2Cl2萃取，依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤，旋干，得到产品化合物间硝基苯甲酸甲酯(2-2)1.95g，收率为88.5％。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；4.00(s,3H)；8.86(s,1H)；8.40(m,2H)；7.68(t,1H)；HRMS:181.0360。
化合物4-2：4-(2-甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸甲酯的制备
3.93g叔丁醇钾(35mmol)溶于30mLDMF中，冷却到-10℃，将溶于5mLDMF的间硝基苯甲酸甲酯(2-2)(2.72g，15mmol)和氯乙酸甲酯(3-2)(1.84g，16.5mmol)的混合溶液滴加到上述溶液中，滴加完后，在-10℃条件下反应至TLC检测不到原料，反应液倒入冰水(50mL)与浓盐酸(17mL)的混合溶液中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，干燥，旋干。柱层析分离，得到化合物4-(2-甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸甲酯(4-2)粗品2.36g。
化合物5-2：2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
将4-(2-甲氧基-2-乙酰基)-3-苯甲酸甲酯(4-2)(1.982g，7.65mmol)溶于40mL乙酸中，加入250mg10％的Pd/C，在常压氢气压力下40℃反应过夜。过滤除去催化剂，蒸去溶剂，用少量乙酸乙酯洗涤产品，过滤，得到0.61g(产率为41％)产品化合物2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(5-2)。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；3.56(s,2H)；3.84(s,3H)；7.33(s,1H)重叠到7.34(d,1H)；7.57(d,1H)；10.53(s,1H)；HRMS:191.0586。
化合物6-2：1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
室温下，2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(5-2)(4.0g，20.71mmol)悬浮于12mL的甲苯中，将氯乙酸酐(5.4g,30.95mmol)加入到上述悬浮液中，加热回流3h，冷却到80℃，30min加入甲基环己烷(6mL)，悬浮液搅拌冷却到室温，抽滤得到粗品，用冷的甲醇(4mL)洗涤，干燥得白色固体5.155g(93.5％)，即化合物1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(6-2)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.66(s,1H)；7.86(d,1H)；7.52(d,1H)；4.98(s,2H)；3.95(s,3H)；3.88(s,2H)；HRMS：267.0288。
化合物8-2：(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6甲酸甲酯的制备
环境温度下，1-氯乙酰基-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(6-2)(1.2g，4.5mmol)悬浮于甲苯(6mL)中,向其中加入乙酸酐(1.62g，15.7mmol)，体系加热到110℃，1h内加入原苯甲酸三甲酯(7-1)(2.0g,10.8mmol),继续反应3h,易挥发产物挥发出去，加入甲苯(4mL)保持体系浓度不变，体系冷却到5℃，搅拌1h，抽滤得到粗品，依次用甲苯、甲苯与乙酸乙酯(1：1)的混合液洗，干燥得到1.63g淡黄色固体即化合物(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6甲酸甲酯(8-2)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.73(d,1H)；8.09(d,1H)；7.90(dd,1H)；7.61-7.48(m,5H)；4.85(s,2H)；3.89(s,3H)；3.78(s,3H)；HRMS:385.0715。
化合物9-2：(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
溶有KOH(41mg,0.6mmol)的甲醇(0.4mL)溶液加入到63℃的(E)-1-氯乙酰基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6甲酸甲酯(8-2)(800mg,2mmol)的甲醇3.2mL)悬浮液中,反应体系继续搅拌30min,冷却到0℃，0℃下继续搅拌2h，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到600mg(94.6％)黄色固体即化合物(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(9-2)。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；8.08(s,1H)；7.88(d,1H)；7.75(m,1H)；7.52-7.56(m,3H)；7.40-7.45(m,3H)；3.92(s,3H)；3.74(s,3H)；HRMS:309.1005。
化合物15-2的合成路线如下所示：
化合物:12-1：2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺的制备
将N-甲基-4-硝基苯胺(10-1)(2.5g，16.43mmol)加入乙酸乙酯(3mL)中，加热到60℃，15分钟内加入氯乙酸酐(11-1)(3.25g，19mmol)乙酸乙酯(8mL)溶液，回流1h，降温到75℃，然后加入10mL环己烷，60℃结出晶体，冷却到0℃，搅拌1h，过滤，用环己烷洗涤，干燥，得到白色晶体3.2g(85.2％)即化合物2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺(12-1)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；8.29(d,2H)；7.69(d,2H)；4.35(s,2H)；3.33(s,3H)；HRMS:228.0322。
化合物:15-2：N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺的制备
2g2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)乙酰胺(12-1)溶于15mL甲苯中，加热到40℃，在30min内滴加4-三氘甲基哌嗪(13-2)(2.19g，2.5eq)，加热搅拌2h，此时控制温度为55℃，搅拌完毕，降到室温，加入5mL水洗，用15mL异丙醇稀释甲苯的溶液体系，加入100mgPd/C(10％)，通入氢气(4bar)，常温搅拌3h，过滤除去催化剂，旋出溶剂，残留物用乙酸乙酯/石油醚重结晶，用石油醚洗涤，干燥，得到白色晶体2.02g(产率为88.0％)即化合物N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺(15-2)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；6.90(d,2H)；6.65(d,2H)；5.22(2H)；3.04(s,3H)；2.79(s,2H)；2.32(m,4H)；2.23(m,4H)；HRMS:265.1974。
化合物B的合成路线如下所示：
化合物B:(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(E)-甲基-3-(甲氧基(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(9-2)(200mg，0.64mmol)和N-(4-氨基苯基)-N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰胺(15-2)(171mg,0.65mmol)的甲醇(1.8mL)悬浮液加热回流8h，缓慢冷却到10℃，10℃下继续搅拌1h，抽滤，冷甲醇洗，干燥得310mg(89％)黄色固体即化合物(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(B)。
1HNMR(DMSO-d6,400MHz)；2.00-2.35(m,8H)；2.7(s,2H)；3.06(s,3H)；3.76(s,3H)；5.82(d,1H)；6.87(d,2H)；7.11(d,2H)；7.17(d,1H)；7.40-7.60(m,6H)；10.94(s,1H)；12.22(s,1H)；HRMS：542.2710。
其中，4-三氘甲基哌嗪(13-2)合成步骤：
其反应路线如下所示：
将哌嗪(1.0g，11.6mmol)和哌嗪盐酸盐(1.845，11.6mmol)溶于乙醇/氘代水(5:1)，回流1小时，冷却到0℃。滴加氘代碘甲烷(0.85mL，9.29mmol)，然后在环境温度下搅拌90min，体系温度降至0℃后，用2mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH大概为9.0。萃取，蒸馏，收集120-130℃的产品，得到无色液体0.7g(产率58.3％)。
1HNMR(CDCl3,400MHz)；2.69-2.71(m,4H)；3.17-3.19(m,4H)；HRMS：103.1180。
实施例3化合物C：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸三氘甲酯(C)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用4-三氘甲基哌嗪替换4-甲基哌嗪，从而制得目标化合物，其中，4-三氘甲基哌嗪的合成方法按照实施例2中所述。
实施例4化合物D：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸二氘甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸二氘甲酯(D)的结构式如下所示：
按照实施例1中所述的方法，用CD2HOH替换实施例1中的CD3OD，用氯乙酸二氘甲酯替换施例1中的氯乙酸三氘甲酯进行制备。
其中，氯乙酸二氘甲酯的生产方法如下：将5g的氯乙酰氯溶于20mL干燥的二氯甲烷中，0℃下，1.76g的CD2HOH缓慢加入到体系中，搅拌1h，依此用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到氯乙酸二氘甲酯；HRMS：110.0114。
实施例5化合物E：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-(4,5,7-三氘吲哚酮)-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-(4,5,7-三氘吲哚酮)-6-甲酸甲酯(E)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用d4-间硝基苯甲酸代替间硝基苯甲酸，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。
其中，d4-间硝基苯甲酸的合成路线如下所示：
其中，D4-3-硝基苯甲酸的合成方法如下：
将1.5g的3-氨基苯甲酸，150mg的10％Pd/C，重水60mL，加入到200mg的高压反应釜中，氮气交换三次，氢气交换三次，使高压反应釜中充满常压氢气，180℃反应24小时。过滤除去Pd/C催化剂，减压除去重水即可得到D4-3-甲基苯胺。8℃下，5-20％的丙酮水溶液与4当量的以碳酸氢钠做缓冲的过氧单磺酸钾溶液同时加入到D4-3-甲基苯胺中，TLC检测反应进度，反应完成后，用乙酸乙酯萃取，干燥，旋干，硅胶柱纯化得到D4-3-硝基苯甲酸；HRMS:171.0477。
实施例6化合物F：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基-2，3，5，6-八氘哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基-2，3，5，6-八氘哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(F)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用N-甲基-2，3，5，6-八氘哌嗪代替N-甲基哌嗪，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。其中，N-甲基-2，3，5，6-八氘哌嗪为市售的。
实施例7化合物G：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)二氘乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)二氘乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(G)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用氯二氘乙酰氯代替氯乙酰氯，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。氯二氘乙酰氯来源为市售。
实施例8化合物H：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(2，3，4，5，6-五氘苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(2，3，4，5，6-五氘苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(H)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用原五氘苯甲酸三甲酯代替原苯甲酸三甲酯，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。
其中，原五氘苯甲酸三甲酯的合成路线如下：
原五氘苯甲酸三甲酯制备方法参考以下文献：
苯胺的氘代参考HironaoSajikietal,TetrahedronLetters46(2005)6995–6998；氘代苯胺的氨基转换成溴参考ItsuroShimada,Bioorganic&MedicinalChemistry16(2008)3309–3320；原五氘苯甲酸三甲酯的制备参考ByKantlehner,Willietal.Synthesis,1981(5),380-381；原五氘苯甲酸三甲酯HRMS:187.1259。
实施例9化合物I：(Z)-3-((4-(N-三氘甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-三氘甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(I)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用N-三氘甲基对硝基苯胺代替N-甲基对硝基苯胺，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。
其中，N-三氘甲基对硝基苯胺的合成路线如下所示：
N-三氘甲基对硝基苯胺的合成路线参照Ullmannamination参考文献JiaoJiao.J.Org.Chem.2011,76,1180-1183。N-三氘甲基对硝基苯胺HRMS:155.0776。
实施例10化合物J：(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)-2,3,5,6-四氘苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)-2,3,5,6-四氘苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯(J)的结构式如下所示：
按实施例1中所述的方法，不同点在于：用N-甲基对硝基四氘苯胺代替N-甲基对硝基苯胺，甲醇替换d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，从而制得目标化合物。
其中，N-甲基对硝基四氘苯胺的合成路线如下所示：
合成步骤参考文献：
苯环上硝基参照AlwynSpencer.JournalofOrganometallicChemistry,295(1985)199-210；氨基转换成溴参照ItsuroShimada,Bioorganic&MedicinalChemistry16(2008)3309–3320；N-甲基对硝基四氘苯胺的合成参照Ullmannamination参考文献JiaoJiao.J.Org.Chem.2011,76,1180-1183；N-甲基对硝基四氘苯胺HRMS:156.0846。
实施例11化合物K：(Z)7-氘-3-((4-(N-甲基-2-(4-三氘甲基哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
化合物K的结构式如下所示：
按照实施例1所述方法，其中采用化合物2-氘-3硝基苯甲酸代替化合物间硝基苯甲酸，甲醇代替d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯。
其中，2-氘-3硝基苯甲酸的制备方法如下：
在干燥氮气氛围下，7.2mmol的2-溴-3-硝基苯甲酸，21g4.8％的钠汞齐，在MeOD(10mL)与D2O(5mL)的混合溶液中回流3小时，冷却后，轻轻倒出，用甲醇洗涤钠汞齐，旋干甲醇溶液，用10％的盐酸酸化剩余物，乙醚萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤并除去溶剂得到2-氘-3硝基苯甲酸；HRMS:168.0289。
实施例12化合物L:(Z)-3-((4-(N-甲基-2-(4-甲基-2，6-四氘哌嗪-1-取代)乙酰氨基)苯胺基)(苯基)亚甲基)-2-吲哚酮-6-甲酸甲酯的制备
化合物L的结构式如下所示：
按照实施例1所述方法，其中采用甲醇代替d4-甲醇，氯乙酸甲酯替换氯乙酸三氘甲酯，1-甲基(3,3,5,5-D4)哌嗪代替4-甲基哌嗪。
其中，1-甲基-(3,3,5,5-D4)哌嗪的合成方法如下：
4-甲基哌嗪-2,6-二酮(1.28g,10mmol)的四氢呋喃溶液(25mL)在一小时内加入到含有氘化铝锂(1.26g,30mmol)的四氢呋喃溶液中，回流四小时，冷却，缓慢加入水，用乙醚萃取数次，干燥乙醚层，旋干，蒸馏得到纯的1-甲基(3,3,5,5-D4)哌嗪；HRMS:104.1259。
实施例13化合物体外激酶抑制实验
利用迁移分析(MobilityShiftAssay)法在KmATP的情况下，检测4个化合物(Nintedanib、化合物A、化合物B、化合物C)对激酶FGFR-1，KDR，PDGFR-α的抑制活性。
实验中，本发明发明人对体外3个激酶FGFR-1，KDR，PDGFR-α进行化合物的筛选，每个化合物从10uM起始，3倍稀释，10个浓度点进行检测(2复孔)，采用化合物十字孢碱(staurosporine)作为标准对照。
KmATP表示在激酶与ATP最大反应速度一半时对应的ATP浓度。
实验材料：
以下材料由尚华集团购买：
KDR(fromCarna,Cat.No.08-191,Lot.No.07CBS-0540)
FGFR1(fromCarna,Cat.No.08-133,Lot.No.09CBS-0989)
FGFR3(fromCarna,Cat.No.08-135,Lot.No.06CBS-3177)
PDGFRα(fromInvitrogen,Cat.No.PR7346A,Lot.No.682476L)
ATP(fromSigma,Cat.No.A7699-1G,CASNo.987-65-5)
DMSO(fromSigma,Cat.No.D2650,Lot.No.474382)
EDTA(fromSigma,Cat.No.E5134,CASNo.60-00-4).96-wellplate(fromCorning,Cat.No.3365,Lot.No.22008026)
384-wellplate(fromCorning,Cat.No.3573,Lot.No.12608008)
实验方法:
Mobilityshiftassay
Ⅰ、配制1x的激酶缓冲液和终止液
1、缓冲液
50mM/LHEPES，pH7.5；
0.0015％Brij-35；0.015％为体积百分数，即1L缓冲液中含0.00015LBrij-35；
10mM/LMgCl2；
2mM/LDTT；
2、终止液
100mM/LHEPES，pH7.5；
0.015％Brij-35；0.015％为体积百分数，即1L终止液中含0.00015LBrij-35；
0.2％CoatingReagent#3；0.2％为体积百分数，即1L终止液中含0.002LCoatingReagent#3；
50mM/LEDTA；
mM/L指每升目标液中物质的浓度。如终止液中100mM/LHEPES指1L终止液中HEPES的浓度为100mmol/L。
II.化合物配制
1)化合物稀释
3、供试化合物分别用100％DMSO溶解成10mM的浓度。化合物检测终浓度为10μM。首先配置成50倍浓度，即500uM。
4、在96孔板中A行第2个孔加入100μL500μM上述步骤3稀释的化合物，3倍稀释该化合物，共10个浓度。具体操作如下：
除第2个孔以外每个孔加入60μL100％DMSO，从第2个孔中取30μL化合物到第3个孔，依次类推，稀释到第11孔，共10个浓度。
2)转移5倍化合物到反应板
5、从上述96孔板的每一孔取10μL到另一块96孔板中，加入90μL1x的激酶缓冲液。因此，化合物溶解于体积浓度为10％的DMSO中。在振板机上振荡10分钟，混匀。
6、从上述96孔板中取出5μL到一块384孔反应板。每行设阴性对照孔和阳性对照孔各2个。96孔板中A行化合物以左右复孔的形式转入384孔板A行第13～24孔。因此，384孔反应板中就有5μL的体积浓度为10％DMSO溶解的5倍化合物，即未加2.5倍激酶溶液和2.5倍底物溶液时，384孔板中化合物浓度为50mM/L。
III.激酶反应
1)配制2.5倍酶溶液
7、以浓度(单位是激酶的效价)2.5倍的激酶，加入到1倍体积的激酶缓冲液中得到2.5倍的缓冲液；
2)配制2.5倍的底物溶液
8、与浓度为(单位是激酶的效价)2.5倍的激酶相对应浓度的底物“FAM标记的多肽和ATP”，加入到1倍体积的激酶缓冲液中得到2.5倍的底物溶液；
3)向384孔板中加入酶溶液
9、384孔反应板中已有5μL的体积浓度为10％的DMSO溶解的5倍化合物；
10、在384孔反应板中加入10μL的2.5倍酶溶液；
11、室温下孵育10分钟；
4)向384孔板中加入底物溶液
12、在384孔反应板中加入10μL的2.5倍底物溶液；
5)激酶反应和终止
13、28℃下孵育一定时间(由各个激酶决定)；
14、加25μL终止液终止反应；
IV.Caliper读取数；
15、Caliper上读取转化率数据；
V.抑制率计算
16、从Caliper上复制转化率数据；
17、把转化率转化成抑制率数据。其中max是指DMSO对照的转化率，min是指无酶活对照的转化率；Conversion是指加有化合物、激酶溶液和底物溶液三者的反应孔的转化率。
百分抑制率(Percentinhibition)＝(max-conversion)/(max-min)*100
VI.体外激酶抑制实验结果见表1
表1Nintedanib、化合物B、化合物A、化合物C的IC50检测结果
化合物 KDR FGFR-1 PDGFR-α
Nintedanib 3.1 81 5.5
A 3.1 75 5.5
B 2.9 67 5.5
C 4.3 79 4.4
表1中IC50的单位nM/L。
体外激酶活性检测表明，化合物A、B、C的激酶活性与Nintedanib接近，其原因是化合物A、B、C是在Nintedanib的结构基础上将特定位点的氢替代为氘。从碳氢键变为碳氘键并未改变化合物的空间结构和排布，从而对化合物与血管生长因子(KDR，FGFR-1，PDGFR-α)之间的偶联不构成较大影响。
实施例14药代动力学研究实验
将化合物Nintedanib(BIBF1120)、化合物A、化合物B和化合物C进行药代动力学实验。
小鼠分别灌胃给予Nintedanib、化合物A、化合物B和化合物C，采集不同时间点全血样品，分离血浆，以液相色谱—串联质谱法测定血浆中总的药物浓度。
1、给药方案
健康Balb/c小鼠，雄性，体重18～20g。分别单次灌胃给予50mg/mL的Nintedanib、化合物A、化合物B、化合物C，化合物以0.5％(w/v)羟丙基甲基纤维素溶液溶解，给药体积为10mL/kg。给药前禁食12h，自由饮水。给药6h后统一进食。于给药后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和24.0h，每个时点3只小鼠，经小鼠眼球后静脉丛取血0.3mL，置肝素化试管中，3500rpm离心10min，分离血浆，于-80℃冰箱中冻存。
2、液相色谱—串联质谱检测方法
LC—MS/MS样品分析方法流动相
流动相A：乙腈
流动相B：0.1mol/L乙酸铵水溶液(使用浓氨水调pH至8.5)
按体积比A(70％)，B(30％)；
3、药代动力学实验结果如下：
小鼠单次灌胃给予浓度为50mg/mL，给药体积10mL/kg的Nintedanib、化合物A、化合物B、化合物C后小鼠血药浓度-时间曲线见图1，图2，图3，图4，图5。
小鼠单次灌胃给予浓度为50mg/mL，给药体积10mL/kg的Nintedanib、化合物A、化合物B、化合物C后的药代动力学参数见表2。
表2
化合物 T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUC0-t(mg/L*h) AUC0-∞(mg/L*h)
Nintedanib 2.03 2 232 843 1036
A 2.9 2 132 556 785
B 3.05 2 556 1339 1564
C 1.58 2 211 650 735
由实验结果可见，化合物B较Nintedanib、化合物A、化合物C在小鼠体内有较高的血药浓度，化合物C的体内血药浓度略微低于Nintedanib，化合物A体内血药浓度明显低于Nintedanib。
原因是：将Nintedanib吲哚环上甲氧基和哌嗪环上氮甲基都进行氘代所得化合物C并未减弱CYP450的代谢作用，因此其体内药代动力学参数略微低于Nintedanib但与之相差较少。将Nintedanib吲哚环上甲氧基进行氘代所得化合物A，其小鼠体内药代动力学参数明显低于Nintedanib，原因是甲氧基氘代后降低了药物在小鼠体内的吸收。将Nintedanib哌嗪环上氮甲基进行氘代所得化合物B，其小鼠体内药代动力学参数明显优于Nintedanib，原因是哌嗪环上氮甲基的氘代减弱或阻断了相应代谢酶对化合物B的代谢作用，使其血药浓度高于Nintedanib，在体内停留时间得以延长，整体药代动力学参数优于Nintedanib；哌嗪环上氮烷基的氘代会减弱或阻断了相应代谢酶对化合物的代谢作用，从而延长化合物在体内停留时间。
实施例15BIBF1120与化合物B在体内抗肿瘤活性研究
FaDu在RPMI1640+10％FBS培养基中培养；当对数生长期的细胞汇合度达到80％－90％的时候，使用胰酶消化，离心，并用双无的培养基洗涤细胞三次，再计数，最后细胞用双无的培养基重悬。在进行皮下模型构建时，按照每只裸鼠接种5*106个/100μL的浓度接种于裸鼠右侧后背部皮下。接种后15天，当平均的肿瘤体积达到100～150mm3时，对老鼠进行随机分组，每个组7只，分别为溶剂对照组，化合物B(50mg/kg)，化合物B(25mg/kg)，化合物B(12.5mg/kg)，化合物BIBF1120(25mg/kg)。药物给药方式为灌胃口服，频率为一天一次，周期为27天，每三天进行一次肿瘤体积测量。
最终，得到肿瘤体积生长曲线如图6所示,图6中化合物B的浓度为50mg/kg时抑制率为97.4％；浓度为25mg/kg时抑制率为87.9％；浓度为12.5mg/kg时抑制率为63.0％；BIBF1120浓度为25mg/kg时抑制率为82.3％。表明给药浓度25mg/kg时，化合物B比阳性对照化合物BIBF1120的抑制率略好；给药浓度50mg/kg时，肿瘤基本被抑制住生长。
小鼠体重变化曲线如图7所示。图7小鼠体重变化曲线表明：化合物B在3个不同给药剂量组下，体重下降均较阳性对照给药组BIBF1120大，表明化合物B体内毒性较阳性对照化合物BIBF1120大。
图6、图7中vehicle具体是溶媒对照组，即给0.5％的羟乙基纤维素。
FaDu细胞株购买于美国典型物种保存中心(AmericanTypeculturecollection,ATCC)；化合物B和BIBF1120由四川大学生物治疗国家重点实验室合成；RPMI-1640培养基购买于赛默飞世尔公司；FBS胎牛血清购买于Gibco公司；胰酶购买于英韦创津公司；青链霉素购买于大连宝生物公司；配制药物的溶剂羟乙基纤维素(4,500-6,500mPa.s)TCI公司；所需SPF级BALB/c裸鼠购买于北京华阜康生物科技有限公司，5～6周龄，体重18～20g，全部为雌性。

Claims (13)

1.通式(b)所示吲哚酮化合物
其特征在于：R1为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基；R25为未氘代的C1～C4烷基；R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C4烷基。
2.根据权利要求1所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R24为一次或多次氘代的或全氘代的C1～C2烷基。
3.根据权利要求2所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R24为-CH2D、-CHD2或-CD3。
4.根据权利要求3所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R24为-CD3；其结构式如下通式(c)所示：
5.根据权利要求4所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R1为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
6.根据权利要求4所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R1为-CH3或-CH2CH3。
7.根据权利要求6所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R1为-CH3；其结构式如下通式(d)所示：
8.根据权利要求7所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R25为未氘代的C1～C4烷基。
9.根据权利要求8所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R25为-CH3、-CH2CH3、-(CH2)2CH3或-(CH2)3CH3。
10.根据权利要求9所述的吲哚酮化合物，其特征在于：R25为-CH3或-CH2CH3。
11.根据权利要求1所述的吲哚酮化合物，其特征在于：所述化合物为：
12.权利要求1～11任一项所述的吲哚酮化合物的药学上可接受的盐。
13.预防或治疗癌症的药物，其特征在于：其活性成分包含权利要求1～11任一项所述的吲哚酮化合物或权利要求12所述的吲哚酮化合物的药学上可接受的盐。
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