CN104000910A - 一种抗肝癌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药技术领域，具体而言，本发明涉及一种抗肝癌组合物及其应用。本发明所述的一种抗肝癌组合物，包括人参，紫丹皮，延胡索，冬瓜子，青皮，其中，人参为80-140份，紫丹皮为15-45份，延胡索为60-80份，冬瓜子为40-70份，青皮为10-20份。本发明的有益效果在于：1、通过实验验证，药物有高效的抗癌效果。2、药物的抗癌机制很可能是由于药物种的有效成分抑制了L型氨基酸转运体1的转运功能，从而达到良好的抗癌效果。

Description

一种抗肝癌组合物及其应用

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体而言， 本发明涉及一种抗肝癌组合物及其应用。 

背景技术

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。中国是乙肝大国， 我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。开发一种对肝癌治疗效果好，且同时能够提高机体免疫力的药物，对人类的健康具有重大意义。 

L型氨基酸转运体1（L-type amino acid transporter 1, LAT1）是近年发现的一种在癌细胞表面特异性高表达的药物跨膜转运蛋白质。研究显示，LAT1功能主要是向癌细胞内运送蛋白质合成所需要的必需氨基酸，为癌细胞的过度分裂增殖提供充足的“营养供给”，对癌细胞的快速增殖起着重要的作用。因此，某种药物如果能够抑制LAT1的表达，就可以在一定程度上治疗抑制癌细胞的生长，这种药物具有成为抗癌药物的前景。 

在筛选治疗宫颈癌的药物的过程中，皂苷类物质由于植物来源丰富，容易获取，疗效好，且不良反应较低，一度成为人们关注的目标。人参为五加科人参属草本植物人参的干燥根，人参的主要成分为人参皂苷，人参皂苷单体化合物具有抗肿瘤，抗疲劳，抗衰老等功效。人参皂苷 Rb1 和 Rg1 在天然植物中含量较高，而Rg3、Rh2、compand K 等含量较少。许多药理研究表明，稀有人参皂苷（如 Rh1、Rh2、Rg3、Rb3 等）药效更为珍贵，在某些难治性疾病如肿瘤治疗方面显示独特的疗效，因此，对人参进行加工处理，增加人参稀有皂苷的含量，同时筛选药物组方配伍，形成一个有效的抗癌方剂是本领域技术人员研究的关键。 

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种抗肝癌药物及其应用。 

本发明所述的一种抗肝癌组合物，包括人参，紫丹皮，延胡索，冬瓜子，青皮，其中，人参为80-140份，紫丹皮为15-45份，延胡索为60-80份，冬瓜子为40-70份，青皮为10-20份。 

进一步的，人参为100-135份，紫丹皮为20-35份，延胡索为65-73份，冬瓜子为51-66份，青皮为12-18份。 

进一步的，所述人参经过如下方法加工：将人参原材料粉碎20-40目，用人参原料50%-70%重量的水湿润，喷入人参原料5-20% 重量的米根霉菌菌液，在25-30℃条件下有氧发酵24-72小时，得到生物转化人参。 

进一步的，所述的人参为鲜人参、干人参、红参中的任一种或几种。 

进一步的，一种抗肝癌组合物和药学上可接受的载体组成。 

所说的药学中可以接受的辅助性成分，可包括例如在片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂型等固体制剂形式口服药物制剂中可以接受和使用的填充剂：如淀粉、糊精、 糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、碳酸钙等；黏合剂：如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、糖浆、胶浆、阿拉伯胶等；赋形剂、润滑剂：如硬脂酸镁、硬脂酸钠、滑石粉、微粉硅胶、液体石蜡、聚乙二醇等；软胶囊剂中的基质：如植物油、聚乙二醇等；抗氧化剂：如亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸、维生素E等；在口服缓控释制剂中的阻滞剂：如蜂蜡、巴西棕榈蜡、氢化植物油、硬脂酸、聚维酮、乙基纤维素等；在注射制剂中允许使用的溶剂、助溶剂、稳定剂和附加剂等。经相应的制剂方法和过程，即可制备得到相应的口服或注射制剂形式的药物。在栓剂中使用的基质：如可可豆脂、半合成甘油脂肪酸酯类、香果脂、氢化油等；水溶性及亲水性基质：如甘油明胶、聚乙二醇、吐温-61、硬脂酸聚烃氧(40)酯、水溶性壳聚糖、泊洛沙姆等；吸收阻滞剂：如大豆卵磷脂、海藻酸、羟丙基甲级纤维素、硬脂酸、 蜂蜡等；在软膏中使用可药用辅料或赋形剂，如黏合剂：如预胶化淀粉、羟丙基纤维素等、填料：如乳糖、蔗糖、甘露醇等；润滑剂：如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅等、崩解剂：如淀粉、羧甲基纤维素钠；润滑剂：如十二烷基硫酸钠等。 

进一步的，口服制剂优选为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、纳米乳、脂质体；注射制剂优选冻干粉针、静脉乳剂、脂质体、纳米乳；外用制剂优选栓剂、软膏。 

本发明还提供了上述组合物在制备抗肝癌药物中的应用。 

进一步的，抗肝癌药物优选为用于肝癌的含有人参的组合物。 

本发明所述的组合物制备方法为：将前述的原料按相应的重量配比混合，先用清水清洗除杂，然后将其用等质量的30-50℃的温水浸泡1-3h，然后，加入原料重量3-5倍的水，在75-90℃提取3-5次，冷却过滤后，在65℃以下浓缩成为与原料等质量的流浸膏状，摇匀密封，至于阴凉通风处保存。上述浸膏可直接作药用，也可用于如动物抗癌模型试验。 

本发明的有益效果在于：1、通过实验验证，药物有高效的抗癌效果。2、药物的抗癌机制很可能是由于药物种的有效成分抑制了L型氨基酸转运体1的转运功能，从而达到良好的抗癌效果。 

附图说明

图1为不同浓度抗肝癌组合物3号对肝癌细胞HpeG2体外生长的抑制率。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。 

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的；下述实施例中的米根霉（根霉菌Rhizopus oryzae）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cgmcc3.6919，原始编号：3.851。 

实施例1：

中药组合物由下述原料按重量配比为：人参为140克，紫丹皮为45克，延胡索为60克，冬瓜子为40克，青皮为20克。

人参原材料粉碎20-40目，其中，所述的人参为鲜人参，用人参原料50%重量的水湿润，喷入人参原料5% 重量的米根霉菌菌液，在25-30℃条件下有氧发酵24小时，得到生物转化人参。 

制备方法为：将前述的原料按相应的重量配比混合，先用清水清洗除杂，然后将其用等质量的50℃的温水浸泡1h，然后，加入原料重量5倍的水，在75℃提取3次，冷却过滤后，在65℃以下浓缩成为与原料等质量的流浸膏状，得到抗肝癌组合物1号。 

实施例2：

中药组合物由下述原料按重量配比为：人参为80克，紫丹皮为15克，延胡索为80克，冬瓜子为70克，青皮为20克。

人参原材料粉碎20-40目，人参为干人参与红参混合物，重量比为1:1，用人参原料70%重量的水湿润，喷入人参原料20% 重量的米根霉菌菌液，在25-30℃条件下有氧发酵72小时，得到生物转化人参。 

制备方法为：将前述的原料按相应的重量配比混合，先用清水清洗除杂，然后将其用等质量的30℃的温水浸泡3h，然后，加入原料重量3倍的水，在80℃提取5次，冷却过滤后，在65℃以下浓缩成为与原料等质量的流浸膏状，得到抗肝癌组合物2号。 

实施例3：

中药组合物由下述原料按重量配比为：人参为135克，紫丹皮为32克，延胡索为68克，冬瓜子为62克，青皮为15克。

人参原材料粉碎20-40目，所述人参为红参，用人参原料67%重量的水湿润，喷入人参原料17% 重量的米根霉菌菌液，在25-30℃条件下有氧发酵38小时，得到生物转化人参。 

制备方法为：将前述的原料按相应的重量配比混合，先用清水清洗除杂，然后将其用等质量的44℃的温水浸泡2.5h，然后，加入原料重量4倍的水，在90℃提取4次，冷却过滤后，在65℃以下浓缩成为与原料等质量的流浸膏状，摇匀密封，得到抗肝癌组合物3号。 

实施例4：

在本实施例中，通过实验证明了抗肝癌组合物3号在抗肝癌方面具有良好的效果。

1 材料与方法 

1.1 受试药品

名称：抗肝癌组合物3号

1.2 细胞株：

肝癌细胞HpeG2。

1.3 主要试剂 

DMEM、RPMI1640、F12K、McCoy’s 5A培养基购自Hycelone公司和中科迈晨（北京）科技有限公司，胎牛血清（FBS）、胰酶购自Gibco公司，PBS粉末购自Sigma公司，100X青链霉素溶液购自北京索莱宝科技有限公司，MTS一步法细胞活力检测试剂盒（Promega）。

1.4 仪器 

Zenyth 1100多功能扫描仪：奥地利Anthos公司出品；IC 1000 Countstar全自动细胞计数仪：上海睿钰生物科技有限公司；HFsafe生物安全柜：力康生物医疗科技控股有限公司；HERAcell 150i CO₂培养箱：Thermo Scientific公司；LD5-2A低速离心机：北京医用离心机厂。

1.5 实验方法 

1.5.1 人癌细胞的体外培养与铺板

上述人源癌细胞用含10%FBS和青链霉素的DMEM/RPMI1640/F12K/McCoy’S 5A培养基于37℃、5%CO₂、95%饱和湿度的培养箱中常规培养、传代，待细胞生长至融合、于超净台内用胰酶将贴壁细胞进行消化，以培养基混悬成10⁴~10⁵cells/ml的细胞悬液，铺于96孔板，每孔铺细胞悬液100μl，继续培养24 h。

1.5.2 药物配制与96孔板投药 

1.5.2.1 抗肝癌组合物

精密称取抗肝癌组合物3号600mg，以10ml的DPBS溶解后离心12000rpm 40min，取上清液经0.22μm的微孔滤膜除菌过滤后再以培养基逐级稀释成逐级稀释成30、15、7.5、3.75、1.875、0.94、0.47mg/ml的溶液，投于96孔板，每孔50μl，使孔内的终浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31和0.15mg/kg,对照孔投与同体积的培养基，继续培养48 h。

1.5.3 MTT测定 

投药48 h后将MTS一步法细胞活力检测试剂盒中的试剂，每孔加入20μl，放入CO₂培养箱中继续培养1~3h，应用荧光扫描仪在492nm处测定每孔的OD值，对每孔的存活细胞产生的可溶性甲瓒的颜色进行测定。

1.5.4 结果计算 

根据每孔的OD值，按下列公式计算对细胞生长的抑制率：

抑制率（%）=（对照组平均OD值-给药组平均OD值）/对照组平均OD值×100% 。

2 结果 

2.1 抗肝癌组合物3号对癌细胞的体外生长抑制作用

试验结果可见，肝癌细胞HepG2在体外生长过程中受到不同程度的抑制，抑制率约89.57%（±1.57）以上。抗肝癌组合物3号的抑制浓度为0.15~10mg/ml，HepG2可见3个浓度以上的剂量依赖关系（见表1）。

3 结论 

抗肝癌组合物3号对人源癌细胞系的体外生长具有一定抑制作用。

表1   抗肝癌组合物3号对肝癌细胞的体外生长抑制作用 

 实施例5：

在本实施例中，通过实验证明了组合物在抗肝癌方面具有良好的效果。

1试验材料 

1.1药物

1.2抗肝癌组合物3号：试验时以0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC）将配成混悬液后给予裸鼠口服灌胃；

阳性对照药：注射用环磷酰胺，0.2g/支，批号04130205，由山西普德药业股份有限公司生产。试验时以生理盐水溶解后给予裸鼠腹腔注射（i.p.）。

1.3细胞株 

肝癌细胞HpeG2，购买于中国科学院细胞库。

1.4动物 

ALB/c-nu裸小鼠，♂性，SPF级，18~20g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001，动物质量合格证号11400700039362。

2 试验方法 

将肝癌细胞HpeG2细胞复苏，进行常规培养，贴壁生长2代后收集细胞悬液，并以培养基稀释成10⁷个/ml的浓度，分别皮下注射于裸鼠双侧腋下，待肿瘤长成后摘下肿瘤，无菌环境下切成2×2mm大小的小块，移植于裸鼠单侧腋窝皮下，按此方法传代后开始给药。

给药前根据肿瘤体积将肝癌细胞HpeG2荷瘤裸鼠各分为5组，包括模型对照组、阳性药对照组，抗肝癌组合物3号高、中、低三个剂量组，每组5只。待体内第3次传代肿瘤生长至100 mm³后开始口服给药，阳性药对照组i.p.环磷酰胺50mg/kg，每两周注射一次，抗肝癌组合物3号按100、300和900mg生药/kg剂量分别口服灌胃给药，每天一次，连续30天。处死后，取瘤块、胸腺及脾脏，称重并计算抑瘤率、胸腺指数及脾脏指数，公式如下：抑瘤率=（空白组瘤重-给药组瘤重/空白组瘤重）×100%；胸腺指数=胸腺重/体重（mg/g）；脾系指数=脾中/体重（mg/g）。 

3 试验结果 

3.1 对肝癌细胞HpeG2异位移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用

实验结果显示，与空白对照组相比，抗肝癌组合物3号对肝癌细胞HpeG2异位移植瘤表现出较好的抑制作用，抑瘤率最高可达44.41%，瘤重有极显著差异（P<0.01）。抗肝癌组合物3号在发挥抗肿瘤作用的同时对小鼠的体重的增加没有抑制作用（表2）。

4 结论 

抗肝癌组合物3号对肝癌细胞HpeG2荷瘤小鼠肿瘤的生长有较好的抑制作用。

表2.  抗肝癌组合物3号对肝癌细胞HpeG2异位移植瘤的抑制作用（n=10，±s） 

Claims (8)

1.一种抗肝癌组合物，其特征在于，包括人参，紫丹皮，延胡索，冬瓜子，青皮，其中，所述人参为80-140份，紫丹皮为15-45份，延胡索为60-80份，冬瓜子为40-70份，青皮为10-20份。

2.根据权利要求1所述的一种抗肝癌组合物，其特征在于，所述人参为100-135份，紫丹皮为20-35份，延胡索为65-73份，冬瓜子为51-66份，青皮为12-18份。

3.根据权利要求2所述的一种抗肝癌组合物，其特征在于，所述人参经过如下方法加工：将人参原材料粉碎20-40目，用人参原料50%-70%重量的水湿润，喷入人参原料5-20% 重量的米根霉菌菌液，在25-30℃条件下有氧发酵24-72小时，得到生物转化人参。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种抗肝癌组合物，其特征在于，所述的人参为鲜人参、干人参、红参中的任一种或几种。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的一种抗肝癌组合物，其特征在于和药学上可接受的载体组成。

6.根据权利要求1-3任意一项所述的抗肝癌组合物，其特征在于，口服制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、纳米乳、脂质体。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的抗肝癌组合物，其特征在于注射用制剂可以为冻干粉针、注射用静脉乳剂、注射剂、脂质体、纳米乳、输液；外用制剂可以为栓剂、软膏。

8.一种如权利要求1所述的抗肝癌组合物作为有效成分在治疗抗肝癌药物中的应用。