CN103981254B - 一种脆性x综合症临床快速pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脆性X综合症临床快速检测试剂盒，所述的试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群和缓冲体系。本发明的试剂盒用于检测脆性X综合症致病基因FMR-1（CGG）n片段拷贝数，从而推断出拷贝数的含量范围，可以快捷的查出致病基因的携带者以及病人，可以用于产前诊断、阻止患儿出生从而降低脆性X综合症的发病率。
Description
技术领域
本发明涉及一种脆性X综合症临床快速PCR检测试剂盒,属于生物工程技术领域。
背景技术
脆性X综合症是一种发病率仅次于唐氏综合症的遗传性智力低下综合症，呈X连锁遗传，占X连锁智力低下的40%。其外显率因男女性别不同有明显差异，男性80%，女性30%。脆性X综合症的发病率也因男女性别不同有差异，男性为1/4000，女性为1/6000.
95%以上的脆性X综合症患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因上的CGG重复区结构扩展的突变引起的，5%以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响FMR1基因的正常结构所导致的。
FMR1基因位于染色体Xq27.3，含17个外显子，全长38kb。在基因5’非翻译区存在一段数目可变的（CGG）n，在其上游250bp处存在一个CpG岛。（CGG）n片段序列重复引起CpG岛的甲基化，使FMR1基因的转录受到抑制。正常人群FMR-1基因（CGG）n重复次数在1-50之间。当重复数扩展到50-200时，携带者表型正常或有部分表现，但在遗传过程中会进一步扩展，通常被称为FMR-1基因的前突变。当重复数扩展达200及以上时，个体表现患病特征，这种FMR-1基因的突变称全突变。前突变CpG岛无异常甲基化，全突变常伴随有CpG岛异常甲基化，使FMR-1基因表达翻译产物受到抑制，从而造成临床症状。
脆性X综合症发病率高，临床表现复杂，目前尚无有效地诊断方法。降低脆性X综合症发病率关键是查出携带者以及患者。通过遗传咨询，产前诊断阻止患儿的出生。女性前突变携带者表型不明显，易被忽视，导致发病率逐代递增。因此开发一种进行X染色体FMR-1基因（CGG）n片段的检测的方法是非常有必要的。本发明旨在开发一种适用于临床检测的脆性X染色体综合症快速检测试剂盒。
目前已公开的检测方法如利用甲基化PCR、MLPA、SouthernBlot、RealTimePCR等方法虽然都对脆性X综合征进行检测，但因其耗时长，消费高，步骤繁琐等缺点限制了其应用范围，而本发明很好的弥补了这些缺点，并在已有技术的基础上进行了创新，使脆性X综合症的检测方法更为完善。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种脆性X综合症临床快速PCR检测试剂盒。
本发明的用于检测脆性X综合症的PCR检测试剂盒，所述的PCR试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群和缓冲体系，
所述的引物群包括用于扩增FMR-1基因CGG重复区的上游引物F和下游引物R，以及用于扩增内参片段的上游引物F和下游引物M，所述的引物群的序列为下列（1）-（6）组中的任意一组，引物序列信息见表1：
表1：引物序列信息
| SEQ ID NO:1 | CGACCTGTCACCGCCCTTCA |
| SEQ ID NO:2 | GCACTTCCACCACCAGCTCCTC |
| SEQ ID NO:3 | GCGGGTGTAAACACTGAAACCA |
| SEQ ID NO:4 | TCACCGCCCTTCAGCCTTCC |
| SEQ ID NO:5 | GCACTTCCACCACCAGCTCCTC |
| SEQ ID NO:6 | GATCAACGCTGTTCCCTCCC |
| SEQ ID NO:7 | CGACCTGTCACCGCCCTTCA |
| SEQ ID NO:8 | TCCACCACCAGCTCCTCCATC |
| SEQ ID NO:9 | GGGTGTAAACACTGAAACCACG |
| SEQ ID NO:10 | TCACCGCCCTTCAGCCTTCC |
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| SEQ ID NO:12 | CGTGATCAACGCTGTTCCCTC |
| SEQ ID NO:13 | TTCAGCCTTCCCGCCCTCCA |
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| SEQ ID NO:15 | GATCAACGCTGTTCCCTCCC |
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| SEQ ID NO:17 | AGCCCCGCACTTCCACCACC |
| SEQ ID NO:18 | CGCTGCGGGTGTAAACACTGAA |
（1）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:1，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:2，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:1，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:3；
（2）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:4，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:5，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:4，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:6；
（3）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:7，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:8，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:7，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:9；
（4）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:10，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:11，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:10，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:12；
（5）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:13，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:14，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:13，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:15；
（6）目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:16，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:17，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:16，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:18；
所述的PCR增强剂选自7-deaza-dGTP、甜菜碱或甜菜碱类似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合；
所述的7-deaza-dGTP的工作浓度为0.05-0.2mmol/L，所述的甜菜碱或甜菜碱类似物的工作浓度为0.05-0.5mol/L，所述的DMSO的工作浓度为1-10%（v/v），所述的甘油的工作浓度为1-20%（v/v），所述的甲酰胺的工作浓度为1-10%（v/v），所述的聚乙二醇的工作浓度为1-20%（v/v）。
本发明中各个成分的“工作浓度”是指其在PCR体系中的浓度。
本发明还提供一种特异性区分脆X综合征检测用Marker，其组成为4个不同大小的DNA片段：1)170-230bp;2)420-480bp;3)600-640bp;4)1020-1080bp，浓度为50ng-100ng/ul.
本发明的试剂盒的检测结果更为直接，其特征在于扩增过程产生2条特征条带，其中一条为内参片段大小为：100-300bp；一条为目标片段，其大小为400-1200bp。当目标片段大小处于为400-650bp时，样品为阴性样本；当目标片段大小处于650bp-1100bp之间为阳性样本（前突变）；当目标片段大于1100bp或无法扩增时，样本为阳性（全突变）。
本发明的试剂盒工作原理如下：该试剂盒以聚合酶链式反应技术扩增FMR-1基因CpG岛至第一个外显子区域，同时扩增反应中加入一条内参引物扩增内参片段以验证PCR扩增的正确性。PCR反应过程中产生2条特征条带，其中一条为内参片段大小为：100-300bp；一条为目标片段，其大小为400-1200bp。当目标片段为400-650bp时，样品为阴性样本；当目标片段位于650bp-1100bp之间时为阳性样本（前突变）；当目标片段大于1100bp，或无法扩增时为阳性样本（全突变）。同时针对特定的引物群设计相匹配的的标准Marker，结合凝胶电泳技术快速高效地分析样本中（CGG）n重复序列的拷贝数。
本发明的试剂盒用于检测脆性X综合症致病基因FMR1（CGG）n片段拷贝数，从而推断出拷贝数的含量范围，可以快捷的查出致病基因的携带者以及病人，可以用于产前诊断、阻止患儿出生从而降低脆性X综合症的发病率。
附图说明
图1.实施例1中阴性样本检测电泳图；其中M为标准Marker，其分子量为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；M1为自制特异Marker，其分子量为1070bp，635bp，470bp，220bp；1为阴性样本PCR扩增结果。
图2.实施例2中阳性样本检测电泳图。其中M为标准Marker，其分子量为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；M1为自制特异Marker，其分子量为1070bp，635bp，470bp，220bp；2为阳性样本PCR扩增结果。
具体实施方式
实施例1制备检测脆性X综合症的PCR检测试剂盒
1、引物设计
在FRM-1基因的-600-+733区域设计一套特异的引物群，其包含用于扩增目标片段（含CGG重复区）的引物F、R；以及用于扩增内参片段的引物F、M。
引物群中F、R和M的序列选自表1中1-6组中的任意一组，引物序列见附表1。
2、准备PCR反应液
PCR反应液组分如下：1）10×缓冲液，缓冲液包括浓度为500mMTris-HCl（pH9.0）和20mMMgCl2。2）浓度为2.5mmol/L的dNTPs；3）浓度为10μmol/L的目的基因引物的上游引物F；4）浓度为10μmol/L的目的基因引物的下游引物R；5）浓度为10μmol/L的内参引物的上游引物F；6）浓度为10μmol/L的内参引物的下游引物M；7）活性为2.5U/μl的DNA聚合酶；8）PCR增强剂。9）双蒸水。
实施例2应用试剂盒进行阴性样本检测
1）DNA提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售全式金血液DNA提取试剂盒提取，并标定其浓度为100ng/μl。样本临床表现为阴性。
2）使用实施例1的试剂盒准备PCR扩增体系；
PCR扩增体系：
其中，
引物群的序列如表1中第1组所示，
PCR增强剂组成：2.5mol/L甜菜碱6μl，DMSO4μl。
（3）PCR扩增条件：95℃预变性8min，暂停添加Taq酶1ul；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环后终延伸10min。
（4）反应结束后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，DN2000Marker、特异Marker以及PCR产物同时进行电泳。电泳结束后，采用凝胶成像系统进行拍照检测。结果如图1。从结果可以看出，内参片段出现且大小相符，目标片段位于470bp和635bp之间，为阴性样本。此结果与临床检测结果相同。
实施例3应用试剂盒进行阳性样本检测
（1）DNA提取：在患者本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售全式金血液DNA提取试剂盒提取，并标定其浓度为100ng/μl。该样本临床检测为脆性X综合症阳性。
（2）使用实施例1的试剂盒准备PCR扩增体系；
PCR扩增体系：
其中，引物群的序列如表1中第1组所示，
PCR增强剂组成：2.5mol/L甜菜碱6μl，DMSO4μl。
（3）PCR扩增条件：95℃预变性8min，暂停添加Taq酶1μl；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环后终延伸10min。
（4）反应结束后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，DN2000Marker、特异Marker以及PCR产物同时进行电泳。电泳结束后，采用凝胶成像系统进行拍照检测。检测结果如图2所示。从结果可以看出，内参片段出现且大小相符，目标片段位于635bp和1070bp之间，为阳性样本（前突变）。此结果与临床检测结果相同。
结论：本发明的试剂盒可以快速地检测脆性X综合征。
序列表
<110>OrganizationName:江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司
<120>Title:一种脆性X综合症临床快速PCR检测试剂盒
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Claims (4)
1.用于检测脆性X综合症的PCR试剂盒，其特征在于，所述的PCR试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群、缓冲体系及检测用标准Marker；
所述的引物群包括用于扩增FMR-1基因CGG重复区的上游引物F和下游引物R，以及用于扩增内参片段的上游引物F和下游引物M，所述的引物群的序列如下，引物序列信息见表1：
目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:1，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:2，内参引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:1，下游引物M的核苷酸序列为SEQIDNO:3；
所述的试剂盒中还含有PCR增强剂，所述的PCR增强剂包含7-deaza-dGTP、甜菜碱或甜菜碱类似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还提供一种特异性区分脆X综合征检测用Marker，其组成为4个不同大小的DNA片段：1)170-230bp；2)420-480bp；3)600-640bp；4)1020-1080bp，浓度为50ng-100ng/μl。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，扩增过程产生2条特征条带，其中一条为内参片段大小为：100-300bp；一条为目标片段，其大小为400-1200bp。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当目标片段大小处于为400-650bp时，样品为阴性样本；当目标片段大小处于650bp-1100bp之间为前突变；当目标片段大于1100bp或无法扩增时，样本为全突变。
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