CN103981111A - 一种抗ros氧化胁迫高效分泌表达外源蛋白的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种能抗ROS氧化胁迫的高效分泌表达重组外源蛋白的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明通过自克隆表达毕赤酵母(Picha pastoris)N-乙酰转移酶基因mpr1来降低诱导过程中细胞所受到的氧化胁迫。本发明以P.pastoris总DNA为模板经过PCR的方法获得N-乙酰转移酶基因mpr1，用pPICZ或者pPIC3.5系列构建mpr1表达载体，转化P.pastoris，从而实现了N-乙酰转移酶Mpr1在细胞内的过表达，以提升酵母抗氧化胁迫的能力。以胞外分泌表达来源于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶P.pastoris对照菌为例，当在工业级发酵培养基中发酵培养时，胞内过表达mpr1基因的重组菌的ROS含量同对照相比降低了62％，细胞活性则提高了14％；同时，目的蛋白α-葡萄糖苷酶的降解也被抑制。本菌株对研究进一步提高P.pastoris重组表达异源蛋白的表达效率具有很好的利用价值。

Description

一种抗ROS氧化胁迫高效分泌表达外源蛋白的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种将来源于P.pastoris自身的N-乙酰转移酶Mpr1进行自克隆表达，在此基础上进一步重组转入所需表达的外源基因，从而实现重组菌具有高抗ROS氧化胁迫功能和高效分泌外源蛋白的功能，属于基因工程领域。

背景技术

N-乙酰转移酶Mpr是乙酰转移酶的一种，目前研究最多的是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的Mpr1，并且在许多酵母中已经发现了它的同源基因。来源于芽殖酿酒酵母细胞∑1278b的mpr1基因，编码的N-乙酰转移酶Mpr1使脯氨酸类似物氮杂环丁烷二羧酸盐(AZC)乙酰化，变成乙酰化AZC，从而防止生物将AZC作为脯氨酸利用造成中毒；在酿酒酵母对乙醇耐受性研究中发现mpr1的缺失突变体对乙醇胁迫高度敏感，而mpr1在酵母细胞内的共表达表达可以使酵母细胞获得高乙醇耐受性。当酵母细胞在热激、冻融、甲醇诱导的过程中会造成ROS水平提高，降低细胞活性从而影响表达效率，容易对发酵过程造成严重干扰，mpr1基因的表达能够降低酵母胞内的ROS水平，保护细胞在各种胁迫环境下的活性，提高抗逆生物功能，如抗氧化胁迫、热胁迫、冻融等。

P.pastoris表达系统是一种应用广泛的高效表达外源蛋白的真核表达系统，它不仅克服了E.coli等原核表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、易形成不溶性包涵体等缺陷，而且弥补了昆虫细胞及哺乳类细胞等真核表达系统操作复杂、产业化生产成本昂贵的不足。在P.pastoris利用甲醇为碳源和诱导剂的代谢中，其生理特性在于，除了具有普通好氧生物中线立体需氧呼吸链会释放ROS，细胞在过氧化物酶体中利用乙醇氧化酶(AOX)氧化甲醇时也会产生大量的ROS物质如H₂0₂，从而导致P.pastoris受到更加强烈的氧化胁迫。将mpr1基因在P.pastoris中表达之后，可以胞内的活性氧的含量，保护细胞免受氧化损伤，提高酵母细胞的活性而避免蛋白酶的分泌；可降低重组蛋白质在发酵液中的降解，有利于提高重组蛋白质的表达水平。

近年来，随着P.pastoris的广泛应用，该表达系统的一些局限性日益突出，因此迫切需要解决P.pastoris受到强烈的ROS氧化胁迫给细胞造成的生理和功能上受损的问题。通过鉴定发现P.pastoris的mpr1基因具有强烈的抗ROS的功能，因而可通过过表达Mpr1酶以有效提升细胞看氧化胁迫的能力，这对进一步提高P.pastoris重组表达异源蛋白的表达效率具有很好的利用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在自身体内过表达Mpr1酶的P.pastoris基因工程菌，当Mpr1酶过表达时可增强酵母抗代谢甲醇过程中产生的ROS功能，在此基础上再导入外源基因进行表达，从而提升细胞的表达效率。具体过程为：由P.pastoris GS115总DNA为模板经过PCR的方法获得N-乙酰转移酶基因mpr1，将mpr1基因与载体连接，重组质粒经限制性内切酶酶切线性化后电转至P.pastoris中，经抗性平板筛选后最终获得mpr1基因过表达的重组菌株。在此基础上，继续向过表达菌株中导入需要表达的外源基因，从而获得抗ROS氧化胁迫高效分泌外源蛋白的基因工程菌。

以本实验室前期采用P.pastoris胞外表达来源于黑曲霉Aspergillusniger的α-葡萄糖苷酶aglu^OP基因为例，所构建的菌株为P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP，可分泌表达α-葡萄糖苷酶。详见：Xu Liu，Dan Wu，Jing Wu，Jian Chen.Optimization of the production ofAspergillus nigerα-glucosidase expressed in Pichiapastoris.World J Microbiol Biotechnol，(2013)29：533-540。在mpr1过表达基因工程菌中进一步导入α-葡萄糖苷酶aglu^OP基因构建重组表达菌株P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1，以P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP为对照，在3L罐进行对比发酵，观察细胞活性和胞内活性氧含量变化。P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1细胞活性比对照菌高出14％，活性氧含量降低了62％，对发酵液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析发现，P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1菌株表达的α-葡萄糖苷酶在发酵过程中的降解明显减少，α-葡萄糖苷酶比活提高27％。

本发明的优点在于：通过过表达mpr1基因提升细胞抗ROS氧化胁迫功能，在超过100小时甲醇诱导过程中显著降低了ROS，从而避免了其对细胞器的损伤，提高了细胞活性。起到了延长细胞分泌表达时间和减少蛋白酶分泌的作用，从而提高细胞的表达效率。

附图说明

图1N-乙酰转移酶基因mpr1基因PCR产物核酸电泳图。

M，DL2,000DNA Marker；1、2：目的基因

图2重组大肠杆菌JM109胞内上清液SDS-PAGE图。

图3重组菌P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1胞内上清液SDS-PAGE图。

M，分子量标准蛋白；α_对照，出发菌株；α₁、α₂、α₃、α₄，重组菌株；箭头，Mpr1酶

图4P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP菌株与P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1菌株摇瓶培养158h，流式细胞仪检测细胞活性和胞内ROS含量分析。

B12：P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP；A12：P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1。

图5P. pastoris/pPIC9K-aglu^OP菌株与P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1菌株与3L罐发酵过程OD对比。

P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1(■)，P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP(▲)。

图6P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP菌株与P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1菌株3L罐发酵过程蛋白电泳图对比。

图6左：P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP，图4右：P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1。

M，分子量标准蛋白；A目的条带，B降解条带。

具体实施方式

实施例1：mpr1转乙酰功能鉴定

1、根据NCBI上登录的mpr1的基因序列(Genbank号8198718)设计引物从P.pastorisGS115总DNA中经过PCR获得N-乙酰转移酶基因mpr1，连接到T载体，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行测序鉴定。结果表明此基因全长627个核苷酸，和NCBI上登录的mpr1的基因序列完全相同，电泳条带大小如图1。

2、从T载上进行PCR获得mpr1基因，和质粒pQE30经酶切连接构建大肠杆菌重组表达载体，将重组质粒转化大肠杆菌JM109，经转化、抗性平板筛选获得重组表达菌株，在摇瓶中进行诱导表达。经ITPG诱导18h后转乙酰酶活达到1.75U/mL，含空载的重组菌转乙酰酶活为0。电泳条带如图2所示，后面3个泳道中24kd的条带为Mpr1酶条带。由此鉴定P.pastoris中Mpr1酶也具有类似S.cerevisiae中Mpr1酶的转乙酰活性。

实施例2：mpr1过表达基因工程菌的构建

1、将pPICZA质粒和重组T载体分别进行BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接得到pPICZA-mpr1，酶切验证质粒片段大小正确。

2、重组表达载体pPICZA-mpr1经Sac I单酶切线性化后电转至P.pastoris KM71中，将重组菌涂布与含2mg/mL Zeocin抗性的YPD平板。挑取抗性平板上的单菌落接种于10mL含Zeocin抗生素的YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L)，30℃培养过夜，提取酵母基因组进行PCR鉴定菌株重组正确，命名为P.pastoris/pPICZA-mpr1，接甘油管保藏。将过表达菌株进行摇瓶发酵培养，诱导96h后收集菌体，高压破壁，破壁上清SDS-PAGE结果如图3所示，可见约23KD左右的Mpr1酶的蛋白条带。

实施例3：本例说明mpr1的过表达能显著提高细胞抗ROS氧化胁迫功能并有利于提高外源蛋白质的表达水平。

将来源于黑曲霉Aspergillus niger的α-葡萄糖苷酶aglu^OP基因和pPIC9K质粒构建重组质粒并转化mpr1基因过表达菌株P.pastoris/pPICZA-mpr1，经G418抗性平板筛选获得重组菌株命名为P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1。将该菌株和对照菌P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP进行3L罐发酵培养实验。

吸取200μL的甘油管菌液接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min培养22～24h，将上述培养液以10％接种量接入装液量为1L的3L发酵罐(BIOFLO，America)，控制pH5，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在20％-30％，当溶氧迅速上升，开始指数流加甘油补料液，当菌体浓度达到一定值时，停止补料，溶氧再次反弹后，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始诱导阶段，设置诱导温度26℃，添加2％甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极(FC2002，华东理工大学)维持甲醇浓度0.5％，诱导α-葡萄糖苷酶表达。诱导发酵过程中取样测细胞活性和胞内ROS含量，如图4所示，对照菌株P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP细胞活性和ROS含量分别为78.5％和97.2％，过表达mpr1菌株P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mpr1细胞活性和ROS含量分别为89.6％和92.7％。相比之下，过表达Mpr1酶可以有效提高细胞抗ROS能力和提升细胞活性。另外，P.pastoris/pPIC9K-aglu^OP/pPICZA-mprlOD长时间维持在300左右(图5)，细胞OD显著高于对照菌。取发酵上清液SDS-PAGE进行检测，结果参见图6，在诱导大致相同时间下，如在对照菌株诱导113小时降解条带(图6左图B)要浓于目的条带(图6左图A)，而在mpr1过表达菌株中诱导123小时还没有出现降解条带(图6右图)，说明提高P.pastoris抗ROS氧化胁迫能力有利于抑制α-葡萄糖苷酶在发酵过程中的降解。通过计算各自的比活，mpr1过表达菌株到123h时的比活还维持在1.21U/mg，而对照在113h时的比活仅为0.95U/mg，显示在过表达菌株发酵中的重组α-葡萄糖苷酶具有更好的稳定性。

Claims (3)

1.一种抗ROS氧化胁迫高效分泌表达外源蛋白的基因工程菌及其构建方法，所构建的菌株在抗ROS氧化胁迫能力上有明显提升。将外源基因导入该基因工程菌中，有利于菌株高效表达蛋白质。

2.根据权利要求1所述的抗ROS氧化胁迫的基因工程菌，其特征在于，所用的抗ROS氧化胁迫基因为毕赤酵母自带的mpr1基因，将此基因过表达以提高细胞抗ROS氧化胁迫功能，mpr1基因序列的NCBI登陆号为8198718，基因序列如SEQ ID No1所示。

3.根据权利要求2所述重组基因工程菌，其特征在于，所用于过表达的载体为pPICZ系列或者pPIC3.5系列，所用的菌株为P.pastoris。构建重组菌步骤如下：

1)提取毕赤酵母基因组，并以此为模板，PCR扩增获得mpr1基因；

2)构建含mpr1基因的重组质粒，转化至E.coli JM109中扩增；

3)将重组质粒经酶切线性化后电转至P.pastoris中，于抗性平板上挑选转化子。