CN103980387B - 一种生物酶法制备肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物酶法制备肝素钠的方法，通过将猪肺粉碎、酶解后，进行去蛋白处理，利用树脂交换后，再通过氧化脱色后得肝素钠溶液，将肝素钠溶液实施沉淀、脱水、干燥得到肝素钠精品。本发明原料来源广泛，通用性强，活性收率高，工艺品质稳定，生产成本低廉，实现肝素钠的低投入、低成本、高回收率。
Description
技术领域
本发明涉及粘多糖生物制药领域，尤其涉及一种生物酶法制备肝素钠的方法。
背景技术
肝素钠(HeparinSodium)肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。目前市面上肝素钠提取工艺种类繁多，不过多数采用猪肠来制备，但猪肺中肝素含量大大超过了猪肠，现需要提供一种以猪肺为原料生产成本低廉，工艺简单的制备肝素钠的方法。
发明内容
基本背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种制备肝素钠的方法，原料来源广泛，通用性强，活性收率高，工艺品质稳定，生产成本低廉，实现肝素钠的低投入、低成本、高回收率。
本发明提出的一种生物酶法制备肝素钠的方法，包括如下步骤：
S1、将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1∶1-2；
S2、向猪肺混合液中加入0.2-0.5mol/L的氢氧化钠溶液使pH达到8-9，加入以猪肺混合液为基准0.8-1.0wt％猪胰中提取的胰蛋白酶，在室温下以85-95rpm的搅拌速度搅拌70-75min得到一次酶解混合液，然后将一次酶解混合液以2-3℃/min的升温速率升至35-39℃并以30-40rpm的搅拌速度搅拌240-300min得到二次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为7.0-8.5；
S3、将二次酶解混合液以1-2℃/min的升温速率升至61-65℃并以30-40rpm的搅拌速度搅拌150-180min得到三次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.2-8.7；
S4、向三次酶解混合液加入0.1-0.2mol/L的盐酸，使液体pH值为4.3-5.4，将温度升至82-84℃并以70-80rpm的搅拌速度搅拌7-12min，再加入以三次酶解混合液为基准2-4wt％硫酸钠晶体后，维持温度为84-85℃并以65-75rpm的搅拌速度搅拌10-15min得到酶失活混合液；
S5、将酶失活混合液在75-80℃时进行一次过滤得到一次滤液，待一次滤液冷却至36℃时，用0.2-0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9-10进行二次过滤后，再滴加0.1-0.2mol/L的盐酸使pH值为8.2-8.7得到二次滤液；
S6、将二次滤液冷却至室温，以50-60rpm的搅拌速度搅拌5-10min后静置30-40min以进行分层，吸取分层后的下层溶液，将下层溶液升温至55-65℃，加入以下层溶液为基准3.5-4wt％D217树脂，以45-50rpm的搅拌速度搅拌3-3.6h后静置1-2h得到含吸附肝素钠成分D217树脂混合液；
S7、将含吸附肝素钠成分D217树脂混合液过滤后得到吸附肝素钠成分的D217树脂，将吸附肝素钠成分的D217树脂充分清洗后，用以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准120-140wt％硫酸钠溶液进行一次洗脱得到一次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9-1.1mol/L，洗脱时间为4-6h，再以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准40-50wt％进行二次洗脱得到二次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9-1.1mol/L，洗脱时间为1-2h，将一次洗脱液和二次洗脱液混合，用0.02-0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.5-9.7，以20-25rpm的搅拌速度搅拌2-4h后静置5-6h，分层后吸取上层溶液得到物料A；
S8、向物料A中滴加0.1-0.2mol/L的盐酸使pH值为6.0-6.5，加入以物料A为基准120-130wt％乙醇搅拌20-30min，乙醇体积百分比为95％，静置7-8h进行分层，再次吸取上层溶液，真空烘干得到物料B；
S9、将物料B用浓度为0.2-0.4mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.5-0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5-11.5，加入以物料B为基准0.1-0.2wt％双氧水，将温度维持在24-26℃10-15h，过滤后加入0.5-0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5-11.5，以30-40rpm的搅拌速度搅拌0.5-0.6h后加入以物料B为基准0.2-0.3wt％双氧水，将温度维持在23-24℃，保温14-15h，过滤后滴加0.03-0.07mol/L的盐酸调节pH为6.7-7.2，得到二次氧化液，其中双氧水浓度为3-4％；
S10、向二次氧化液加入以二次氧化液为基准180-200wt％，乙醇的体积百分比为35％，在3-4℃沉淀36-40h，过滤后收集一次过滤物，加入以二次氧化液为基准0.2-0.5wt％硫酸钠溶液溶解，硫酸钠溶液的浓度为8-10％，再加入以二次氧化液为基准120-150wt％乙醇进行沉淀，乙醇的体积百分比为95％，过滤后收集二次过滤物，过滤物脱水、研细后，在35-45℃下真空烘干，即得肝素钠精品。
优选的，S10中真空烘干为红外真空烘干。
优选的，S9中，将物料B用浓度为0.3mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入以物料B为基准0.15wt％双氧水，将温度维持在25℃13h，过滤后加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，以35rpm的搅拌速度搅拌0.55h后加入以物料B为基准0.23wt％双氧水，将温度维持在23.5℃，保温14.5h，过滤后滴加0.05mol/L的盐酸调节pH为7，得到二次氧化液。
本发明通过采用对猪肺进行酶解生产，使原料来源广泛，通用性强，利用树脂交换后再通过氧化脱色得肝素钠溶液，其中采用D217树脂，可有效吸附高分子有机物，吸附稳定，不易破碎，降低生产成本，再将肝素钠溶液实施沉淀、脱水、干燥得到肝素钠精品，活性收率高，工艺品质稳定，生产成本低廉，实现肝素钠的低投入、低成本、高回收率。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种生物酶法制备肝素钠的方法，包括如下步骤：
S1、将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1∶2；
S2、向猪肺混合液中加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液使pH达到9，加入以猪肺混合液为基准0.8wt％猪胰中提取的胰蛋白酶，在室温下以95rpm的搅拌速度搅拌70min得到一次酶解混合液，然后将一次酶解混合液以3℃/min的升温速率升至35℃并以40rpm的搅拌速度搅拌240min得到二次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.5；
S3、将二次酶解混合液以1℃/min的升温速率升至65℃并以30rpm的搅拌速度搅拌180min得到三次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.2；
S4、向三次酶解混合液加入0.2mol/L的盐酸，使液体pH值为4.3，将温度升至84℃并以70rpm的搅拌速度搅拌12min，再加入以三次酶解混合液为基准2wt％硫酸钠晶体后，维持温度为85℃并以65rpm的搅拌速度搅拌15min得到酶失活混合液；
S5、将酶失活混合液在75℃时进行一次过滤得到一次滤液，待一次滤液冷却至36℃时，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9进行二次过滤后，再滴加0.2mol/L的盐酸使pH值为8.2得到二次滤液；
S6、将二次滤液冷却至室温，以60rpm的搅拌速度搅拌5min后静置40min以进行分层，吸取分层后的下层溶液，将下层溶液升温至55℃，加入以下层溶液为基准4wt％D217树脂，以45rpm的搅拌速度搅拌3.6h后静置1h得到含吸附肝素钠成分D217树脂混合液；
S7、将含吸附肝素钠成分D217树脂混合液过滤后得到吸附肝素钠成分的D217树脂，将吸附肝素钠成分的D217树脂充分清洗后，用以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准140wt％硫酸钠溶液进行一次洗脱得到一次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9mol/L，洗脱时间为6h，再以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准40wt％进行二次洗脱得到二次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为1.1mol/L，洗脱时间为1h，将一次洗脱液和二次洗脱液混合，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.5，以25rpm的搅拌速度搅拌2h后静置6h，分层后吸取上层溶液得到物料A；
S8、向物料A中滴加0.1mol/L的盐酸使pH值为6.5，加入以物料A为基准120wt％乙醇搅拌30min，乙醇体积百分比为95％，静置7h进行分层，再次吸取上层溶液，真空烘干得到物料B；
S9、将物料B用浓度为0.4mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11.5，加入以物料B为基准0.1wt％双氧水，将温度维持在26℃10h，过滤后加入0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5，以40rpm的搅拌速度搅拌0.5h后加入以物料B为基准0.3wt％双氧水，将温度维持在23℃，保温15h，过滤后滴加0.03mol/L的盐酸调节pH为7.2，得到二次氧化液，其中双氧水浓度为3％；
S10、向二次氧化液加入以二次氧化液为基准200wt％，乙醇的体积百分比为35％，在3℃沉淀40h，过滤后收集一次过滤物，加入以二次氧化液为基准0.2wt％硫酸钠溶液溶解，硫酸钠溶液的浓度为10％，再加入以二次氧化液为基准120wt％乙醇进行沉淀，乙醇的体积百分比为95％，过滤后收集二次过滤物，过滤物脱水、研细后，在45℃下真空烘干，即得肝素钠精品。
实施例2
本发明提出的一种生物酶法制备肝素钠的方法，包括如下步骤：
S1、将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1∶1；
S2、向猪肺混合液中加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液使pH达到8，加入以猪肺混合液为基准1wt％猪胰中提取的胰蛋白酶，在室温下以85rpm的搅拌速度搅拌75min得到一次酶解混合液，然后将一次酶解混合液以2℃/min的升温速率升至39℃并以30rpm的搅拌速度搅拌300min得到二次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为7；
S3、将二次酶解混合液以2℃/min的升温速率升至61℃并以40rpm的搅拌速度搅拌150min得到三次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.7；
S4、向三次酶解混合液加入0.1mol/L的盐酸，使液体pH值为5.4，将温度升至82℃并以80rpm的搅拌速度搅拌7min，再加入以三次酶解混合液为基准4wt％硫酸钠晶体后，维持温度为84℃并以75rpm的搅拌速度搅拌10min得到酶失活混合液；
S5、将酶失活混合液在80℃时进行一次过滤得到一次滤液，待一次滤液冷却至36℃时，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10进行二次过滤后，再滴加0.1mol/L的盐酸使pH值为8.7得到二次滤液；
S6、将二次滤液冷却至室温，以50rpm的搅拌速度搅拌10min后静置30min以进行分层，吸取分层后的下层溶液，将下层溶液升温至65℃，加入以下层溶液为基准3.5wt％D217树脂，以50rpm的搅拌速度搅拌3h后静置2h得到含吸附肝素钠成分D217树脂混合液；
S7、将含吸附肝素钠成分D217树脂混合液过滤后得到吸附肝素钠成分的D217树脂，将吸附肝素钠成分的D217树脂充分清洗后，用以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准120wt％硫酸钠溶液进行一次洗脱得到一次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为1.1mol/L，洗脱时间为4h，再以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准50wt％进行二次洗脱得到二次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9mol/L，洗脱时间为2h，将一次洗脱液和二次洗脱液混合，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.7，以20rpm的搅拌速度搅拌4h后静置5h，分层后吸取上层溶液得到物料A；
S8、向物料A中滴加0.2mol/L的盐酸使pH值为6，加入以物料A为基准130wt％乙醇搅拌20min，乙醇体积百分比为95％，静置8h进行分层，再次吸取上层溶液，真空烘干得到物料B；
S9、将物料B用浓度为0.2mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5，加入以物料B为基准0.2wt％双氧水，将温度维持在24℃15h，过滤后加入0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11.5，以30rpm的搅拌速度搅拌0.6h后加入以物料B为基准0.2wt％双氧水，将温度维持在24℃，保温14h，过滤后滴加0.07mol/L的盐酸调节pH为6.7，得到二次氧化液，其中双氧水浓度为4％；
S10、向二次氧化液加入以二次氧化液为基准180wt％，乙醇的体积百分比为35％，在4℃沉淀36h，过滤后收集一次过滤物，加入以二次氧化液为基准0.5wt％硫酸钠溶液溶解，硫酸钠溶液的浓度为8％，再加入以二次氧化液为基准150wt％乙醇进行沉淀，乙醇的体积百分比为95％，过滤后收集二次过滤物，过滤物脱水、研细后，在35℃下真空烘干，即得肝素钠精品。
实施例3
本发明提出的一种生物酶法制备肝素钠的方法，包括如下步骤：
S1、将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1∶1.3；
S2、向猪肺混合液中加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液使pH达到8.7，加入以猪肺混合液为基准0.9wt％猪胰中提取的胰蛋白酶，在室温下以90rpm的搅拌速度搅拌73min得到一次酶解混合液，然后将一次酶解混合液以2.2℃/min的升温速率升至37℃并以34rpm的搅拌速度搅拌270min得到二次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为7.6；
S3、将二次酶解混合液以1.5℃/min的升温速率升至63℃并以35rpm的搅拌速度搅拌170min得到三次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.5；
S4、向三次酶解混合液加入0.15mol/L的盐酸，使液体pH值为5，将温度升至83℃并以76rpm的搅拌速度搅拌10min，再加入以三次酶解混合液为基准3wt％硫酸钠晶体后，维持温度为84℃并以70rpm的搅拌速度搅拌13min得到酶失活混合液；
S5、将酶失活混合液在77℃时进行一次过滤得到一次滤液，待一次滤液冷却至36℃时，用0.3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.3进行二次过滤后，再滴加0.13mol/L的盐酸使pH值为8.5得到二次滤液；
S6、将二次滤液冷却至室温，以53rpm的搅拌速度搅拌7min后静置35min以进行分层，吸取分层后的下层溶液，将下层溶液升温至60℃，加入以下层溶液为基准3.7wt％D217树脂，以47rpm的搅拌速度搅拌3.3h后静置1.6h得到含吸附肝素钠成分D217树脂混合液；
S7、将含吸附肝素钠成分D217树脂混合液过滤后得到吸附肝素钠成分的D217树脂，将吸附肝素钠成分的D217树脂充分清洗后，用以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准130wt％硫酸钠溶液进行一次洗脱得到一次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为1mol/L，洗脱时间为5h，再以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准45wt％进行二次洗脱得到二次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为1mol/L，洗脱时间为1.5h，将一次洗脱液和二次洗脱液混合，用0.03mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.6，以23rpm的搅拌速度搅拌3h后静置5.6h，分层后吸取上层溶液得到物料A；
S8、向物料A中滴加0.13mol/L的盐酸使pH值为6.3，加入以物料A为基准126wt％乙醇搅拌27min，乙醇体积百分比为95％，静置7.8h进行分层，再次吸取上层溶液，真空烘干得到物料B；
S9、将物料B用浓度为0.3mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入以物料B为基准0.15wt％双氧水，将温度维持在25℃13h，过滤后加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，以35rpm的搅拌速度搅拌0.55h后加入以物料B为基准0.23wt％双氧水，将温度维持在23.4℃，保温14.5h，过滤后滴加0.05mol/L的盐酸调节pH为7，得到二次氧化液，其中双氧水浓度为3.5％；
S10、向二次氧化液加入以二次氧化液为基准190wt％，乙醇的体积百分比为35％，在3℃沉淀38h，过滤后收集一次过滤物，加入以二次氧化液为基准0.3wt％硫酸钠溶液溶解，硫酸钠溶液的浓度为9％，再加入以二次氧化液为基准140wt％乙醇进行沉淀，乙醇的体积百分比为95％，过滤后收集二次过滤物，过滤物脱水、研细后，在40℃下真空烘干，即得肝素钠精品。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种生物酶法制备肝素钠的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1∶1-2；
S2、向猪肺混合液中加入0.2-0.5mol/L的氢氧化钠溶液使pH达到8-9，加入以猪肺混合液为基准0.8-1.0wt％猪胰中提取的胰蛋白酶，在室温下以85-95rpm的搅拌速度搅拌70-75min得到一次酶解混合液，然后将一次酶解混合液以2-3℃/min的升温速率升至35-39℃并以30-40rpm的搅拌速度搅拌240-300min得到二次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为7.0-8.5；
S3、将二次酶解混合液以1-2℃/min的升温速率升至61-65℃并以30-40rpm的搅拌速度搅拌150-180min得到三次酶解混合液，在搅拌过程中维持液体pH值为8.2-8.7；
S4、向三次酶解混合液加入0.1-0.2mol/L的盐酸，使液体pH值为4.3-5.4，将温度升至82-84℃并以70-80rpm的搅拌速度搅拌7-12min，再加入以三次酶解混合液为基准2-4wt％硫酸钠晶体后，维持温度为84-85℃并以65-75rpm的搅拌速度搅拌10-15min得到酶失活混合液；
S5、将酶失活混合液在75-80℃时进行一次过滤得到一次滤液，待一次滤液冷却至36℃时，用0.2-0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9-10进行二次过滤后，再滴加0.1-0.2mol/L的盐酸使pH值为8.2-8.7得到二次滤液；
S6、将二次滤液冷却至室温，以50-60rpm的搅拌速度搅拌5-10min后静置30-40min以进行分层，吸取分层后的下层溶液，将下层溶液升温至55-65℃，加入以下层溶液为基准3.5-4wt％D217树脂，以45-50rpm的搅拌速度搅拌3-3.6h后静置1-2h得到含吸附肝素钠成分D217树脂混合液；
S7、将含吸附肝素钠成分D217树脂混合液过滤后得到吸附肝素钠成分的D217树脂，将吸附肝素钠成分的D217树脂充分清洗后，用以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准120-140wt％硫酸钠溶液进行一次洗脱得到一次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9-1.1mol/L，洗脱时间为4-6h，再以吸附肝素钠成分的D217树脂为基准40-50wt％硫酸钠溶液进行二次洗脱得到二次洗脱液，硫酸钠溶液的浓度为0.9-1.1mol/L，洗脱时间为1-2h，将一次洗脱液和二次洗脱液混合，用0.02-0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为9.5-9.7，以20-25rpm的搅拌速度搅拌2-4h后静置5-6h，分层后吸取上层溶液得到物料A；
S8、向物料A中滴加0.1-0.2mol/L的盐酸使pH值为6.0-6.5，加入以物料A为基准120-130wt％乙醇搅拌20-30min，乙醇体积百分比为95％，静置7-8h进行分层，再次吸取上层溶液，真空烘干得到物料B；
S9、将物料B用浓度为0.2-0.4mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.5-0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5-11.5，加入以物料B为基准0.1-0.2wt％双氧水，将温度维持在24-26℃10-15h，过滤后加入0.5-0.7mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.5-11.5，以30-40rpm的搅拌速度搅拌0.5-0.6h后加入以物料B为基准0.2-0.3wt％双氧水，将温度维持在23-24℃，保温14-15h，过滤后滴加0.03-0.07mol/L的盐酸调节pH为6.7-7.2，得到二次氧化液，其中双氧水浓度为3-4％；
S10、向二次氧化液加入以二次氧化液为基准180-200wt％，乙醇的体积百分比为35％，在3-4℃沉淀36-40h，过滤后收集一次过滤物，加入以二次氧化液为基准0.2-0.5wt％硫酸钠溶液溶解，硫酸钠溶液的浓度为8-10％，再加入以二次氧化液为基准120-150wt％乙醇进行沉淀，乙醇的体积百分比为95％，过滤后收集二次过滤物，过滤物脱水、研细后，在35-45℃下真空烘干，即得肝素钠精品。
2.如权利要求1所述制备肝素钠的方法，其特征在于，S10中真空烘干为红外真空烘干。
3.如权利要求1所述制备肝素钠的方法，其特征在于，S9中，将物料B用浓度为0.3mol/L的硫酸钠溶液完全溶解，加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入以物料B为基准0.15wt％双氧水，将温度维持在25℃13h，过滤后加入0.6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11，以35rpm的搅拌速度搅拌0.55h后加入以物料B为基准0.23wt％双氧水，将温度维持在23.5℃，保温14.5h，过滤后滴加0.05mol/L的盐酸调节pH为7，得到二次氧化液。
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