CN103977049A - 食用土当归总有机酸的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食用土当归总有机酸的新用途，具体地说本发明公开了食用土当归总有机酸在预防或治疗炎症性肠病药物中的应用，属于药物技术领域。通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀、鸡蛋清致大鼠足跖肿胀、热板法镇痛试验、对冰醋酸致小鼠扭体试验、食用土当归总有机酸具有较好的抗炎、镇痛作用，对炎症性肠病具有较好的治疗作用。

Description

食用土当归总有机酸的新用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，涉及食用土当归总有机酸的新用途，特别是涉及食用土当归总有机酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病是一组非特异性慢性胃肠道炎症性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确。广义的炎症性肠病是包括各种的肠道炎性疾病，一般来说是累及回肠、直肠、结肠这些的都可以叫炎性肠病，它的表现一般都是腹泻、腹痛，甚至有些人可以有血便，总的来说就是有炎症改变的疾病。但在临床上炎症性肠病多指溃疡性结肠炎和克罗恩病这两类疾病。溃疡性结肠炎则是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠，病程漫长，常反复发作，临床症状以腹泻为主，排出含有血、脓和黏液的粪便，常伴有阵发性结肠痉挛性疼痛，并里急后重，排便后可获缓解。克罗恩病又称节段性结肠炎、肉芽肿性回肠炎或回肠结肠炎，其病变多见于末段回肠和邻近结肠，但从口腔至肛门各段消化道均可受累，呈节段性或跳跃式分布。临床以腹泻、腹痛、体重下降、腹块、瘘管形成为主要表现，可伴有发热、贫血、营养障碍以及关节、皮肤、眼、口腔粘膜、肝脏等肠外损害。

目前西医对于炎症性肠病的治疗常选用氨基水杨酸制剂，如柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪等。根据不同的严重程度，通常用免疫抑制剂来缓解症状，如强的松、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、6-巯嘌呤等。类固醇的药物也被常用来控制病情的突发，曾被作为维持药剂。近年来，生物疗法也被用来治疗炎症性肠病。对于药物治疗无效或者出现了严重的并发症的患者需要进行手术治疗，如肠切除、狭隘成形术或暂时性或永久性结肠造口术或回肠造口术。

食用土当归为五加科惚木属植物食用土当归的根，是商品九眼独活的主流品种，味辛、性微温，具有祛风和血、解热镇痛、疏风补虚、利尿消肿之功效，主要用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、头痛目眩等症。现有研究已表明食用土当归包含有氨基酸、蛋白质、多肽、脂肪油、鞣质、香豆素、甾体及皂苷类活性成分。现有研究已经表明食用土地当归的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物均有不同程度的抗炎镇痛作用。对于食用土地当归各活性成分的其它药理学作用还需进一步深入研究。

发明内容

针对炎症性肠病的临床特点，本发明的目的是提供一种药物的新用途。该药物能够有效的治疗炎症性肠病，对多种炎症和疼痛均有较强的抑制作用。

本发明将食用土当归总有机酸作为有效成分，用于预防或治疗炎症性肠病，本发明所述的炎症性肠病为溃疡性结肠炎和克罗恩病。

将食用土当归总有机酸与常规药用辅料混合，按照常规的工艺制备成丸剂、片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、糖浆、口服液、冻干粉针或注射液。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。

本发明的有益效果是：根据本发明，可以提供安全、有效的治疗包括溃疡性结肠炎、克罗恩病的炎症性肠病的药物，本发明药物为天然药材食用土当归的提取物，与同类化学合成药物相比，其毒副作用更小，且在治疗腹泻方面具有意想不到的的效果。

具体实施方式

下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：

称取食用土当归总有机酸100g，加入淀粉200g制粒，硬脂酸镁4g，糊精100g，微晶纤维素100g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例2：

称取食用土当归总有机酸150g，加入淀粉300g制粒，硬脂酸镁6g，糊精150g，微晶纤维素150g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例3：

称取食用土当归总有机酸300g，加入淀粉300g制粒，硬脂酸镁6g，糊精150g，微晶纤维素150g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例4：

称取食用土当归总有机酸400g，加入淀粉500g制粒，硬脂酸镁10g，糊精200g，微晶纤维素300g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例5：

称取食用土当归总有机酸500g，加入淀粉500g制粒，硬脂酸镁8g，糊精200g，微晶纤维素200g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例6：

称取食用土当归总有机酸600g，加入淀粉600g制粒，硬脂酸镁15g，糊精200g，微晶纤维素200g，均匀制得颗粒，压片，得到片剂。

实施例7：

称取食用土当归总有机酸100g，加入淀粉100g制粒，硬脂酸镁6g，糊精100g，微晶纤维素100g，均匀制得颗粒，装入胶囊，得到胶囊剂。

实施例8：

称取食用土当归总有机酸150g，加入淀粉100g制粒，硬脂酸镁4g，糊精100g，微晶纤维素100g，均匀制得颗粒，装入胶囊，得到胶囊剂。

实施例9：

称取食用土当归总有机酸100g，按照常规工艺加入常规辅料，制备成丸剂。

实施例10：

称取白术内酯食用土当归总有机酸200g，按照常规工艺加入常规辅料，制备成丸剂。

实施例11：

称取食用土当归总有机酸100g，按照常规工艺加入常规辅料，制备成注射液。

实施例12：

称取食用土当归总有机酸100g，按照常规工艺加入常规辅料，制备成颗粒剂。

实施例13：

称取食用土当归总有机酸100g，按照常规工艺加入常规辅料，制备成泡腾剂。

本发明食用土当归总有机酸按本发明人前期研究的制备工艺方法制备，详见专利201310016091.3和201310472558.5说明书中记载的工艺方法。

下面通过具体的药学试验来验证本发明的有益效果：

一、食用土当归总有机酸的抗炎镇痛作用研究

1.材料与方法

1.1试验药物

食用土当归药材购自四川省成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定。食用土当归醇提取物：食用土当归粉末，8倍95％乙醇回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，经酸碱滴定法测定所含总有机酸含量为14％，每1g相当于原生药4g，以10％吐温-80溶解成质量浓度分别为1.92、0.96、0.48g.Kg^-1混悬液；食用土当归总有机酸：食用土当归醇提取物适量，石油醚萃取，减压浓缩石油醚，用1％KOH溶液等体积萃取，碱水层加浓盐酸至PH＝1，石油醚萃取，减压浓缩石油醚即得，经酸碱滴定法测定所含总有机酸含量为65％，每1g相当于原生药20g，以10％吐温-80溶解成质量浓度分别为0.38、0.19、0.10g.Kg^-1混悬液；阿司匹林肠溶片：沈阳奥吉娜药业有限公司，国药准字H20065051。

1.2动物

昆明种小鼠，体重18～22g，购自成都中医药大学动物实验中心，合格证号：scxk(川)2008-11；SD大鼠，体重200～250g，SPF级，购自成都中医药大学动物实验中心，合格证号：SCXK(川)2008-24。

1.3试剂

冰醋酸：成都市科龙试剂厂，批号070405；二甲苯：天津恒兴化学试剂有限公司，批号090316；吐温-80：成都市科龙试剂厂，批号110825。

1.4仪器

YLS-6B热板测试仪：北京众实迪创科技发展有限责任公司；PV-200足趾容积测量仪：成都泰盟科技有限公司；FA2004N型电子天平：上海民怡仪器仪表有限公司。

1.5方法

1.5.1二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

选取禁食12h的20～25g雄性小鼠80只，随机分成8组。即空白对照组(10％吐温-80)，阿司匹林组(0.25g.Kg^-1)，，食用土当归醇提取物高、中、低剂量组(1.92、0.96、0.48g.Kg^-1)，总有机酸高、中、低剂量组(0.38、0.19、0.10g.Kg^-1)。按照0.2ml.10g^-1连续ig给药7天，于末次给药1h后，在小鼠右耳廓前后均匀涂抹100％二甲苯0.02ml，左耳不涂做对照。致炎后30min将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8mm的打孔器分别在左右两耳相同的位置打孔，于分析天平上称质量，计算左右耳的质量之差(肿胀度)及抑制率。抑制率＝(空白对照组-给药组)/空白对照组×100％。

1.5.2鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

选取禁食12h的150～200g的雄性大鼠64只，随机分成8组，分组与给药同1.5.1。于末次给药前先用足趾容积测量仪测量各组大鼠的右后足容积作为原始足容积，给药后1h，自大鼠足跖中部皮下注入10％新鲜鸡蛋清o.1ml，分别于注入后1、2、3、4h用上述方法测定其右后足容积，计算足跖肿胀率。足跖肿胀率(％)＝(肿胀后足容积-原始足容积)/原始足容积×100％。

1.5.3热板法镇痛试验

选取禁食12h的20～25g雌性小鼠，置于恒温(55±0.5)热板仪上分别测定给药前痛阈值，每只小鼠测定2次，间隔0.5h，取痛阈平均值在5～30s内的小鼠，随机分成8组，分组与给药同1.5.1，于末次给药后30min、60min、90mim、120min分别测定各组小鼠痛阈值(超过60s无反应均以60s计)。

1.5.4对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响

取禁食12h小鼠80只，雌雄各半，按体重平均分成8组，分组与给药同1.3.1，于末次给药1h后，分别给每只小鼠按0.2ml.10g^-1腹腔注射0.6％醋酸溶液，立即开始计时，观察20min内各鼠发生扭体反应的次数及出现扭体反应的时间(扭体潜伏期)，并计算药物镇痛率，药物镇痛率(％)＝(空白对照组扭体次数-给药组扭体次数)/空白对照组扭体次数×100％。

2.结果

2.1二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

表1结果显示，食用土当归总有机酸与醇提取物对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用。与空白组比较，除醇提取物低剂量组无显著性差异，其它各给药组均有显著性差异；总有机酸与醇提取物各剂量组比较无显著性差异。

表1二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01

2.2鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

表2结果显示，食用土当归总有机酸与醇提取物对鸡蛋清所引起的大鼠足肿胀度在1～4h内均有一定的抑制作用；与空白组比较，除醇提取物低剂量组无显著性差异，其它各给药组与均有显著性差异；总有机酸与醇提取物相比，差异无显著性，但起效时间更早，抗炎效果更好。

表2鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01

2.3热板法镇痛试验

表3结果显示，食用土当归总有机酸与醇提取物对热板所致的小鼠疼痛均有一定的抑制作用，与空白组比较，除了醇提取物低剂量组，其它不同剂量组均有显著性差异，且在90min作用明显；总有机酸与醇提取物各剂量组相比无显著性差异。

表3热板法致小鼠足痛的影响

注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01

2.4对醋酸致小鼠扭体反应的影响

表4结果显示，醇提取物与总有机酸在一定程度上均能对抗0.6％醋酸刺激所致的小鼠疼痛反应。与空白对照组比较，醇提取物高剂量组、总有机酸高、中剂量组有显著性差异(P<0.05、0.01)，且药物镇痛率大于50％；总有机酸各剂量组与醇提取物各剂量组小鼠扭体反应的次数相比相差不大，表明一定浓度的总有机酸与醇提取物对醋酸刺激所致的小鼠疼痛反应均有一定的抑制作用。

表4对醋酸致小鼠扭体反应的影响

注：与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01

二、食用土当归总有机酸的止泻作用研究

1.试验材料

选用健康成年昆明小鼠80只，雌雄各半，体重20±2g。试验前将动物称重，编号，随机分成空白对照组，黄连素(盐酸小檗碱)对照组，食用土当归总有机酸高剂量组，食用土当归总有机酸中剂量组及食用土当归总有机酸低剂量组，一共五组，每组10只。

2.试验样品制备

空白对照组仅给予蒸馏水灌胃，黄连素(盐酸小檗碱)对照组按照3mg/ml的盐酸小檗碱水溶液灌胃给药；食用土当归总有机酸分别按照浓度0.38、0.19、0.10g.Kg^-1的浓度给药。

3.试验方法及步骤

本实验采用番泻叶致小鼠腹泻模型，即每只小鼠每天采用4g/(kg.d)的剂量连续灌胃7天，然后再给药观察各组药物对番泻叶致小鼠腹泻的抑制作用，通过一定时间内观察小鼠湿粪的总粒数来作为研究评价指标。

各组实验动物均按2ml/20g体重灌胃给药相应的药物水溶液，其中空白对照组灌服等体积的蒸馏水1小时，每只小鼠按4g/(kg.d)的剂量灌服番泻叶溶液，然后单独观察每只小鼠湿粪计数，以湿粪排出粒数的多少表示腹泻程度，记录各小鼠灌服番泻叶后4小时内的湿粪总数，并计算各组药物对番泻叶所致的小鼠腹泻抑制率。

腹泻抑制率计数公式如下：

4.实验结果

各样品组治疗后的湿粪计数变化。结果见下表5。

表5各样品组治疗后湿粪计数

结果表明，食用土当归总有机酸各剂量组对番泻叶致小鼠腹泻均有不同程度的治疗作用。

三、食用土当归总有机酸的对炎症性肠病的抑制作用

1.实验材料

SPF级SD大鼠170只，雌雄各半，体重200±20g。试剂：2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司提供，批号：P2297；肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)定量试剂盒，美国RD公司提供，批号：201106；白介素-1β(Interleukin-1，IL-1β)定量试剂盒，美国RD公司提供，批号：201106；白介素-4(Interleukin-4，IL-4)定量试剂盒，美国RD公司提供，批号：201106；白介素-10(Interleukin-10，IL-10)定量试剂盒，美国RD公司提供，批号：201106；无水乙醇，成都科龙化工厂；水合氯醛，成都科龙化工厂；二甲苯，成都科龙化工厂；40％甲醛，成都科龙化工厂。主要仪器：海尔BCD-258WBCSTX冰箱，Hair；Bp6181036539型电子分析天平，Sartorius AG；Legend RT+230v台式冷冻离心机，Thermo；酶标定量测定仪，Thermo Multiskan AsCant；GE1160型包埋机，Leica；HI1210型摊片机，Leica；HI1220型烘片机，Leica；RM2245型切片机，Leica；BX51型研究显微镜，Olympus；DFC-300FX型摄像系统，Leica。

2.实验方法

TNBS灌肠液的制备：无水乙醇加双蒸水配成50％乙醇75ml，然后将5％TNBS10ml×15与50％乙醇(2：1＝V：V)混合均匀，灭菌后装瓶4℃保存。用2％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，予TNBS灌肠液1ml灌肠。灌肠器插入肛门约6～8cm，注入灌肠液1ml。大鼠头朝下体位，且灌肠器拔出后再继续保持1min左右，以防灌肠液溢出。每隔5d重复灌肠1次，共5次以复制炎症性肠病模型。

造模结束后，造模大鼠随机分为1个模型组、食用土当归总有机酸高剂量组，食用土当归总有机酸中剂量组及食用土当归总有机酸低剂量组，阳性对照美沙拉秦组并同时设立一组空白对照组，一共六组，每组10只。食用土当归总有机酸分别按照浓度0.38、0.19、0.10g.Kg^-1的浓度给药，美沙拉秦组按照0.5g.Kg^-1的剂量给药。

3.指标检测及方法

给药7天后，各组动物禁食不禁水24h，股动脉取血处死大鼠，取血后不抗凝4℃静置保存2-3h。离心15min后取上清液，即为待测样本，用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。

采用ELISA方法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10，严格按照试剂盒说明书操作具体步骤如下：⑴从冰箱中取出试剂盒，在室温下平衡20min后，取出所需板条。⑵设置标准品孔和样品孔，标准品孔加各不同浓度的标准品50μL。⑶样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。⑷除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育10min。⑸洗板机洗板。⑹每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。⑺每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。⑻在EXECL工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值做纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，根据曲线方程计算各样本浓度值。

4.数据分析与统计方法

实验数据以形式表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

5.实验结果

与空白组比较，模型组TNF-α水平显著升高(P﹤0.05)；与模型组比较，阳性对照组、高、中及低剂量组显著降低TNF-α水平(P﹤0.05)。与空白组比较，模型组大鼠IL-1β水平显著升高(P﹤0.05)；与模型组比较，阳性对照组、高、中剂量组IL-1β水平显著降低(P﹤0.05)。结果见表6。

表6模型大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响

与空白组相比:^▲P﹤0.05；与模型组相比：^*P﹤0.05

与空白组比较，模型组IL-4水平显著降低(P﹤0.05)；与模型组比较，阳性对照组、食用土当归总有机酸高、中剂量组IL-4水平显著升高(P﹤0.05)。与空白组比较，模型组IL-10水平显著降低(P﹤0.05)；与模型组比较，食用土当归总有机酸高剂量组IL-10水平显著升高(P﹤0.05)。结果见表7。

表7本发明药物对脾气虚CD大鼠血清IL-4、IL-10的影响

与空白组相比:^▲P﹤0.05；与模型组相比：^*P﹤0.05

食用土当归总有机酸为食用土当归的提取物，为食用土当归的活性成分，通过上述实验表明，食用土当归总有机酸对腹泻、炎症及疼痛具有较好的治疗作用，对炎症性肠病具有较好的治疗效果。

Claims (3)

1.食用土当归总有机酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的炎症性肠病为溃疡性结肠炎。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的炎症性肠病为克罗恩病。