CN103975919B - 一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及害虫生物防治技术领域，具体公开了一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法，所述分生孢子微胶囊以爪哇棒孢霉菌<i>Isaria</i><i> javanicus</i>的分生孢子悬浮液为囊心，以等量明胶与阿拉伯胶所形成的复合胶为囊壁，并以转谷氨酰胺酶作为固化剂通过复凝聚反应制备得到。所制得的分生孢子微胶囊外形呈球形，大小均匀，表面光滑，平均粒径为20～30μm左右；所述微胶囊贮藏期长，抗紫外能力强，可以延长真菌杀虫剂的货架期寿命，同时增强农药的贮藏稳定性和生物防虫效果，在农作物防虫方面具有实际的应用价值。

Description

一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及害虫生物防治技术领域，更具体地，涉及一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法。

背景技术

目前，大量使用化学杀虫剂仍然是防治害虫最主要的方法，然而，化学杀虫剂的使用不仅费用投入较高，且对环境造成污染，影响食品安全；同时还会致使害虫对杀虫剂产生抗性，这些缺点使得人们越来越重视发展害虫生物防治技术。

虫生真菌资源丰富，对人、畜无毒害，且不会造成环境污染，因此真菌治虫在害虫生物防治中占有重要地位。然而，真菌杀虫剂因为本身是生命体，对高温、干旱及紫外线等环境因子敏感，作为防虫制剂的货架寿命短，防治效果不稳定，影响了其发展与应用。因此发展剂型加工技术是解决真菌杀虫剂的稳定性和延长货架寿命的重要途径。目前，真菌杀虫剂已研制出的剂型主要有：原粉剂、粉剂、可湿性粉剂、油剂、颗粒剂及无纺布菌条等。

微胶囊制剂是20世纪30年代开发的新剂型，在70年代中期得到了迅猛发展。微胶囊技术是一种新剂型加工技术，微胶囊化能保护有效成份提高其抗逆能力，能使有效成份缓慢释放提高药效。在我国，活菌微胶囊技术发明以细菌为主，真菌微胶囊很少，说明我国虫生真菌微胶囊技术还处在初级发展阶段。

申请号为201110457248.7的中国发明专利公开一种白僵菌微胶囊剂技术，由白僵菌分生孢子、高岭土、水制成的菌悬液为囊心，由海藻酸钠为囊壁，在正十六烷、玉米油和卵磷脂不同比例分散剂中分散，通过钙离子进行交联，使微胶囊固化成粒径小于100μm的具有包膜的微小颗粒。白僵菌分生孢子萌发时芽管可穿破囊壁包膜。该微胶囊剂中还加入了分生孢子萌发营养液，提高了分生孢子的萌发率和萌发速度，可有效阻隔外界紫外线、干旱等不良环境对分生孢子的影响，在相同温度、湿度及紫外线影响下萌发率较高，对农林害虫具有较好的防治效果。

赵军的“球孢白僵菌微胶囊剂的研制”的研究中，以重要茶树小绿叶蝉为目标害虫，筛选出球孢白僵菌菌株，并研制出适用的微胶囊剂型。

真菌的分生孢子对外界环境，如温度、湿度、光照等，较为敏感，真菌杀虫剂剂型的加工要比化学杀虫剂复杂的多。爪哇棒孢霉（Isariajavanicus）是一类重要的虫生真菌，其分布广，寄主多，常用于防治小菜蛾、蚜虫、粉虱等重要害虫。现有技术中还没有针对爪哇棒孢霉的所制备得到的包埋率高、杀虫效果优秀的微胶囊制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有棒孢霉真菌杀虫剂应用技术的不足，提供一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的爪哇棒孢霉分生孢子微胶囊，所述微胶囊具有潜在和重要的推广应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

本发明提供了一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法，即将爪哇棒孢霉菌Isariajavanicus分生孢子纯粉（简称纯孢粉，其含水量小于3%，分生孢子含量大于5×10¹¹个，下同）、0.05%吐温80溶液制成的菌悬液与10～20%w/v明胶溶液混合后加入与明胶等质量的10～20%w/v阿拉伯胶溶液进行复凝聚反应，以转谷氨酰胺酶为固化剂进行交联，最后过筛和冷冻干燥得到粒径20～30μm左右的微胶囊。

本发明针对所要包裹的内含物，即具有生物活性的分生孢子，经过探索性实验选择了等量明胶和阿拉伯胶（简称复合胶）为囊壁；本发明还特别的选择转谷氨酰胺酶代替甲醛作为固化剂，所包裹得到微胶囊不仅包埋率高，且无毒、安全。

上述爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法包括以下步骤：

S1.将爪哇棒孢霉菌纯孢粉与0.05%的吐温80溶液按照质量体积比为1：10（g/mL）的比例混合得到菌悬液；

S2.将菌悬液与10～20%w/v明胶溶液混合后，加入10～20%w/v阿拉伯胶溶液进行复凝聚反应；明胶与阿拉伯胶等质量；

S3.以转谷氨酰胺酶为固化剂进行交联，转谷氨酰胺酶的用量为0.25g/g明胶；过筛、冷冻干燥得到微胶囊。

优选地，S1所述爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与复合胶的质量比为0.5～1.5：10。

优选地，S1所述菌悬液由爪哇棒孢霉菌纯孢粉与0.05%吐温80溶液通过涡旋搅拌配制而成，所述爪哇棒孢霉菌纯孢粉与吐温80溶液的质量体积比为1：10（g/mL）。

优选地，S2所述10～20%w/v明胶溶液由明胶经浸泡溶胀后加热溶解得到；所述10～20%w/v阿拉伯胶溶液由阿拉伯胶加水并水浴加热至80℃，缓慢搅拌溶解得到；制备得到明胶溶液与阿拉伯胶溶液均在40℃下保温备用。

优选地，S2所述复凝聚反应包括以下步骤：

S21.40℃条件下，将10～20%w/v明胶溶液与菌悬液混合，搅拌均匀；反应5min后向上述混合液中加入与明胶等质量的10～20%w/v阿拉伯胶溶液，搅拌均匀，得到含复合胶12～18%w/v的水包油乳液；

S22.将水包油乳液不断搅拌，转速600～800转/min，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液冷却至35～38℃，进行成囊反应，反应时间为12～18min。

优选地，S3所述转谷氨酰胺酶的用量为0.25g/g明胶。

优选地，以转谷氨酰胺酶为固化剂进行交联反应步骤为：复凝聚反应后将其置于冰浴中，继续搅拌至10℃以下，加入转谷氨酰胺酶作为固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH至8～9，继续搅拌20min，观察至有胶囊析出为止，静置待微囊沉降。

作为一种优选方式，上述爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法包括以下步骤：

S1.囊心的制备：将爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与0.05%的吐温80溶液按照质量体积比为1：10（g/mL）的比例混合得到菌悬液；

S2.囊壁的制备：取适量明胶，用蒸馏水浸泡溶胀后，水浴加热溶解形成质量浓度为10～20%w/v的明胶溶液；另取与明胶等量的阿拉伯胶，加蒸馏水，水浴加热至80℃，缓慢搅拌溶解形成质量浓度为10～20%w/v的阿拉伯胶溶液；所述明胶溶液与阿拉伯胶溶液均在40℃下保温备用；

优选地，S1所述爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与S2所述明胶和阿拉伯胶总和的质量比为0.5～1.5：10；

S3.微胶囊制备

40℃条件下，将10～20%w/v明胶溶液与菌悬液混合，缓慢搅拌均匀；反应5min后向上述混合液中加入与明胶等质量的10～20%w/v阿拉伯胶溶液，继续搅拌使之充分混合，得到含复合胶12～18%w/v的水包油乳液；

将水包油乳液不断搅拌，转速600～800转/min，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液冷却至35～38℃，进行成囊反应，反应时间为12～18min；

成囊反应后置于冰浴中，继续搅拌至10℃以下，加入转谷氨酰胺酶作为固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH至8～9，继续搅拌20min，观察至有胶囊析出为止，静置待微囊沉降。

本发明还提供了上述方法制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊。优选地，所述微胶囊的粒径为20～30μm。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明提供了一种爪哇棒孢霉分生孢子微胶囊的制备方法，所述方法使用的原料成本低，且无毒安全，适用于生物防治技术，该方法操作简易，具有潜在和重要的推广应用价值。

本发明还提供了上述方法制备得到的微胶囊，本发明选用特定的物质作为壁材，不仅很好的包裹和保护分生孢子，还可以延长真菌杀虫剂的货架寿命；爪哇棒孢霉菌IsariajavanicusSP053菌株分生孢子微胶囊的孢子萌发率在贮存180天后仍然保持在90%以上。

附图说明

图1为爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊制备流程图；

图2采用不同固化剂所制备得到的微胶囊的成囊率和分生孢子的萌发率；分生孢子短期萌发率是指微胶囊制成后2天内测定的萌发率；长期萌发率是指存储120天以后的萌发率；甲醛（FM）0.3/0.6/1.2mL/g明胶；转谷氨酰胺酶（Tgase）0.13/0.25/0.5g/g明胶；

图3为爪哇棒孢霉菌（Isariajavanicus）SP053菌株分生孢子微胶囊扫描电镜照片；其中，图B为图A的放大图；

图4为爪哇棒孢霉菌（Isariajavanicus）SP053菌株分生孢子微胶囊的分生孢子萌发率与贮存时间的关系；

图5为爪哇棒孢霉菌（Isariajavanicus）SP053菌株分生孢子微胶囊对紫外光的耐受能力。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料；本发明不应限制于实施例范围。

实施例110%（纯孢粉/复合胶W/W）爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备

图1为爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂的制备流程图，具体包括如下步骤：

S1.囊心的制备：取爪哇棒孢霉菌SP053菌株的纯孢粉1g，加10mL0.05%的吐温80溶液，涡旋搅拌，配制菌悬液，备用。

S2.囊壁的制备：取明胶5g，加蒸馏水35mL浸泡溶胀后，加热溶解成溶液；取阿拉伯胶5克，加蒸馏水35mL加热至80℃左右溶解成溶液；两溶液均40℃保温备用。

S3.微胶囊制备：在40℃水浴条件下，将明胶溶液与囊心材料混合，轻轻搅拌均匀。5min后向混合液加入与明胶等质量的阿拉伯胶溶液形成复合胶，所述复合胶的浓度为12.5%，继续搅拌充分混合均匀，形成水包油乳液，在700转/min速度下不断搅拌下，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液自然冷却至35℃，继续搅拌15min进行复凝聚化成囊反应。然后，冰浴条件下，继续搅拌使温度降至10℃以下，加入1.25g转谷氨酰胺酶，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH8～9，继续搅拌20min左右至胶囊析出为止，静置待微囊沉降。将固化后的微胶囊用蒸馏水进行洗涤，过筛（320目），收集，冷冻干燥后等到分生孢子微胶囊剂。

实施例25%（纯孢粉/复合胶W/W）爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备

图1为爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂的制备流程图，具体包括如下步骤：

S1.囊心的制备：取爪哇棒孢霉菌SP053菌株的纯孢粉0.5g，加5mL0.05%的吐温80溶液，涡旋搅拌，配制菌悬液，备用。

S2.囊壁的制备：取明胶5g，加蒸馏水35mL浸泡溶胀后，加热溶解成溶液；取阿拉伯胶5g，加蒸馏水35mL加热至80℃左右溶解成溶液；两溶液均40℃保温备用。

S3.微胶囊制备：在40℃水浴条件下，将明胶溶液与囊心材料混合，轻轻搅拌均匀。5min后向混合液加入与明胶溶液等量的阿拉伯胶溶液形成复合胶，所述复合胶的浓度为13.3%，继续搅拌充分混合均匀，形成水包油乳液，在600转/min速度下不断搅拌下，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液自然冷却至35℃，进行复凝聚化成囊反应15min。然后，冰浴条件下，继续搅拌至温度降至10℃以下，加入1.25g转谷氨酰胺酶，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH8～9，继续搅拌20min左右至胶囊析出为止，静置待微囊沉降。将固化后的微胶囊用蒸馏水进行洗涤，过筛（320目），收集，冷冻干燥后等到分生孢子微胶囊。

对比例1爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备

按照实施例1所述方法制备爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂，唯一不同的就是所选用的固化剂为甲醛。

结果如图2所示，当选用的固化剂为甲醛（FM）时，所制备得到的微胶囊的成囊率及分生孢子萌发率均明显低于选用转谷氨酰胺酶（Tgase）为固化剂所制备得到的微胶囊的成囊率和分生孢子萌发率；同时，所选用的转谷氨酰胺酶以0.25g/g明胶最佳。

对比例2正交设计爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备

按照实施例1所述方法制备爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂，采用正交试验设计考察菌胶比（分生孢子与复合胶的质量比）、pH值、复合胶量、反应温度、反应时间、搅拌转速对包埋率的影响，确定影响因子的最优组合，结果表明，在设定的处理条理下，除了菌胶比对包埋率影响显著外，其他因子都没有显著影响（表1，表2）。因此，最佳的成囊反应条件是：菌胶比（w/w）为5～10%，复合胶用量（w/v）12～18%、反应体系的pH值3.6～4.0、反应时间12～18min、反应温度35～38℃及搅拌转速600～800rpm，此条件下制备得到的微胶囊的包埋率达90%以上。

表1复凝聚反应微胶囊化正交优化设计结果

表2正交试验的方差分析

实施例3分生孢子微胶囊性能测定

将实施例1和实施例2制备得到的微胶囊干粉制样后，进行扫描电镜观察，结果表明，微胶囊外形均呈球形，大小均匀，表面光滑、直径相差不大，平均粒径为20～30μm（图3）。

分生孢子萌发率的检测：取实施例1和实施例2制备得到的分生孢子微胶囊5～10mg，加入0.05%吐温80水溶液100mL，振荡破壁，3层纱布过滤后，得到分生孢子悬浮液，在25℃下培养一定时间，检查萌发率。结果如图4所示，所述分生孢子微胶囊在贮存180天后，分生孢子萌发率仍然保持在90%以上，而常规分生孢子的萌发率降低到10%以下。

检测实施例1和实施例2所制备得到的分生孢子微胶囊抗紫外线的能力，结果如图5所示，紫外光（30W，距20厘米）照射微胶囊2小时后，孢子萌发率不受影响，而未经胶囊化的对照的分生孢子经紫外光照射2小时的孢子悬浮液萌发率显著降低。

实施例4分子孢子微胶囊生物活性和实验室防虫试验

将实施例2所制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂用于处理小菜蛾2龄幼虫，检测其生物活性和防治害虫的效果。结果如表3所示，处理小菜蛾2龄幼虫96h后，测得LC₅₀为1.04μg/mL，说明所制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊在相对低剂量情况下，就能够导致小菜蛾死亡。另外，通过测定爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊处理小菜蛾48h、72h和96h后所得到的LC₅₀值可知，在处理96h后所述微胶囊的生物活性要远高于处理48h后所述微胶囊的生物活性，可见，本发明所制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂需要在一定时间才能更好发挥生物活性。

表3分生孢子微胶囊对小菜蛾2龄幼虫的室内生物测定结果

注：同列后标有相同字母者表示在5%水平差异不显著(DMRT法)。

实施例5分子孢子微胶囊生物活性和田间防虫试验

将实施例1所制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊剂用于处理小菜蛾2龄幼虫，检测其生物活性和防治害虫的效果。结果如表4所示，将分生孢子微胶囊剂稀释1000倍，在施药后2天，5天，8天对小菜蛾的防效分别为79.33%，84.00%，84.37%，对照药剂1.8%阿维菌素EC稀释2000倍液在施药后2天，5天，8天的防效为81.01%，84.68%，78.70%；即说明实施例1制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊1000倍液对小菜蛾的防治效果好于对照药剂1.8%阿维菌素EC2000倍液的效果。

表410%分生孢子微胶囊对小菜蛾的田间小区试验结果

Claims (3)

1.一种爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与0.05%的吐温80溶液按照质量体积比为1：10（g/mL）的比例混合得到菌悬液；

S2.将菌悬液与10～20%w/v明胶溶液混合后，加入10～20%w/v阿拉伯胶溶液进行复凝聚反应；明胶与阿拉伯胶等质量；

S3.以转谷氨酰胺酶为固化剂进行交联，转谷氨酰胺酶的用量为0.25g/g明胶；过筛、冷冻干燥得到粒径20～30μm微胶囊；

所述爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与明胶和阿拉伯胶总和的质量比为0.5～1.5：10；

步骤S2所述复凝聚反应包括以下步骤：

S21.40℃条件下，将10～20%w/v明胶溶液与菌悬液混合，搅拌均匀；反应5min后向上述混合液中加入与明胶等质量的10～20%w/v阿拉伯胶溶液，搅拌均匀，得到水包油乳液；

S22.将水包油乳液不断搅拌，转速600～800转/min，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液冷却至35～38℃，进行成囊反应，反应时间为12～18min；

步骤S3所述以转谷氨酰胺酶为固化剂进行交联反应步骤为：复凝聚反应后将其置于冰浴中，继续搅拌至10℃以下，加入转谷氨酰胺酶作为固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH值至8～9，继续搅拌20min，观察至有胶囊析出为止，静置待微囊沉降；

步骤S1所述爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与明胶的质量分别为1g和5g或者0.5g和5g。

2.根据权利要求1所述爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.囊心的制备：将爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与0.05%的吐温80溶液按照质量体积比为1：10（g/mL）的比例混合得到菌悬液；

S2.囊材的准备：取适量明胶，用蒸馏水浸泡溶胀后，水浴加热溶解形成质量浓度为10～20%w/v的明胶溶液；另取与明胶等量的阿拉伯胶，加蒸馏水，水浴加热至80℃，缓慢搅拌溶解形成质量浓度为10～20%w/v的阿拉伯胶溶液；所述明胶溶液与阿拉伯胶溶液均在40℃下保温备用；

步骤S1所述爪哇棒孢霉菌分生孢子纯粉与S2所述明胶和阿拉伯胶总和的质量比为0.5～1.5：10；

S3.微胶囊制备

40℃条件下，将10～20%w/v明胶溶液与菌悬液混合，缓慢搅拌均匀；反应5min后向上述混合液中加入与明胶等质量的10～20%w/v阿拉伯胶溶液，继续搅拌使之充分混合，得到水包油乳液；

将水包油乳液不断搅拌，转速600～800转/min，滴加10%醋酸调节pH值至3.6～4.0，溶液冷却至35～38℃，进行成囊反应，反应时间为12～18min；

成囊反应后置于冰浴中，继续搅拌至10℃以下，加入转谷氨酰胺酶作为固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH值至8～9，继续搅拌20min，观察至有胶囊析出为止，静置待微囊沉降。

3.权利要求1至2任一项所述方法制备得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微胶囊。