CN115088732A - 一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法 - Google Patents

一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法，包含以下质量百分比原料：促生菌微胶囊5～10％、壳聚糖1～2.5％、羟丙基甲基纤维素0.2～0.5％、明胶1～4％、交联剂0.1～0.5％和甘油1.5～2.5％，其制备方法包括以下步骤：(1)解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌促生菌株活化；(2)制备三株菌的种子液；(3)制备三株菌混合菌泥；(4)制备促生菌微胶囊粉剂；(5)复配制备含促生菌微胶囊的种衣剂。本发明包裹在作物种子表面，可有效地提高了种子发芽率、幼苗株高、幼苗鲜重，促进了根系的生长，增加了作物的产量，也可提高作物的对环境胁迫的耐受性，包括耐旱、耐寒、耐重金属、耐盐碱等，同时提高了作物抗病害能力。

Description

一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法
本发明涉及农业生产技术领域，特别是涉及一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法。
背景技术
种子包衣是一项促进农业增产丰收的高新技术，用种衣剂包过的种子播种后，能迅速吸水膨胀。随着种子内胚胎的逐渐发育以及幼苗的不断生长，种衣剂将含有的各种有效成分缓慢地释放，被种子幼苗逐步吸收到体内，从而达到防治苗期病虫害、促进生长发育、提高作物产量的目的。
植物益生菌种衣剂是以促生微生物为有效成分的一种新型种衣剂，含有对作物有益的微生物菌或菌群，如固氮菌、溶磷菌、解钾等，其目的一方面基于拮抗原理，利用有益菌抵抗有害病菌侵害和繁殖，达到抗病的目的；另一方面，基于促生微生物分泌物，对根际土壤进行物质转化，促进作物生长。芽孢杆菌属是促进作物生长的根际细菌中的重要成员之一，其所需营养成分简单、生长繁殖速度快、适应性及抗逆性极强，利于大量培养，可以在多种植物组织中被分离，筛选分离，芽孢杆菌能够分泌多种蛋白类和激素类活性物质，天然无毒害，并具有抗病抑菌、提高作物抗性、促进作物生长及改良土壤的作用。
现有含植物益生菌的种衣剂存在的主要问题有：(1)针对性不足，缺少特定作物的精准性包衣剂，微生物防治效果一般；(2)促生微生物活性易受外界环境影响，当施用土壤中微生物活性很低或失去活性；(3)包衣技术单一，一般都是均一型包衣，膜结构不稳定易脱落，导致活性成分损失，降低种衣剂防治效果。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂及其制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂，包括有含有根际促生菌微胶囊的种衣剂，所述含有根际促生菌微胶囊的种衣剂包含促生菌微胶囊、壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、明胶、交联剂和甘油；
所述的促生菌微胶囊的平均直径为10～200μm，所述的交联剂为硼酸、柠檬酸的一种或两种；
所述的壳聚糖的平均分子量为100kDa～10000kDa，脱乙酰度为80％～95％，所述的羟丙基甲基纤维素的平均分子量为10kDa～30kDa；
所述的促生菌微胶囊包含促生菌、明胶、保护剂、乳化剂、羧甲基纤维素和固化剂；
所述的乳化剂为蔗糖酯，所述的固化剂为谷氨酰胺转氨酶；
所述的保护剂为海藻糖；
所述的谷氨酰胺转氨酶为食品级固体粉末，其酶活力为100～1000U/g。
还包括有一种用于制备含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂的制备方法，包含以下步骤：
步骤(1)、菌株活化：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)分别划线接种于固体活化培养基，25～35℃，活化培养24～36小时后，得到活化菌，备用；
步骤(2)、种子液制备：将步骤(1)中活化后的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别接种于种子培养基，25～35℃，150～200转/分钟摇床振荡培养18～36小时后，得到三株菌种子液，备用。
步骤(3)、发酵液制备：将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别按体积接种量2.0～4.0％共同接种于发酵培养基，25～35℃，150～200转/分钟搅拌发酵；在发酵过程中，持续通入无菌空气量1.5～3.0vvmin培养18～36小时后，得到根际促生菌发酵液；6000～10000转/分钟离心10～20分钟收集菌泥，备用；
步骤(4)、微胶囊制备：将0.5～2.0质量份的菌泥分散于0.5％～2％的明胶水溶液中，并加入0.1～0.5质量份的海藻糖和2.5～3.5质量份的蔗糖酯，用5％乙酸溶液调节体系pH值至3.5～4.5；喷雾加入0.5～2.0％羧甲基纤维素溶液，2500×g均质5分钟形成乳液，40～60℃恒温10～30分钟，用3％NaOH调节体系pH值至5.5～6.5，添加1～5质量份的谷氨酰胺转氨酶，经30～50℃恒温固化反应30～90分钟形成微胶囊溶剂，经喷雾干燥得到促生菌微胶囊粉剂。
步骤(5)、种衣剂制备：在1％乙酸溶液中分别添加1～2.5质量份的壳聚糖、0.2～0.5质量份的羟丙基甲基纤维素、1.0～4.0质量份的明胶、0.1～0.5质量份的交联剂，在40～60℃恒温交联反应30～60分钟，然后加入5～10质量份步骤(4)中所述的促生菌微胶囊粉剂和1.5～2.5质量份的甘油，搅拌均匀，得到含促生菌微胶囊的种衣剂。
进一步的，所述的固体活化培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、其余为蒸馏水。
进一步的，所述的种子培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、其余为蒸馏水。
进一步的，所述的发酵培养基包括：红糖50g/L、清蛋白10g/L乳、酵母浸粉20g/L、其余为蒸馏水。
进一步的，所述的微生物为解淀粉芽孢杆菌的菌体、地衣芽孢杆菌的菌体和多粘类芽孢杆菌的菌体的混合液时，所述微生物的总活菌浓度为1.0～5.0×109CFU/mL。
进一步的，所述的明胶与羧甲基纤维素质量比为1:0.8～1.2。
进一步的，所述的喷雾干燥的条件为进风温度为130～150℃，出风温度为60～70℃。
所述的含有促生菌微胶囊的种衣剂的使用方法是：在种子播种前，用种衣剂对种子包衣，种衣剂与种子重量比为1：50～200，搅拌均匀，阴干后播种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过复配对植物生长促进作用明显的促生菌微胶囊，包裹在作物种子表面，有效地提高了种子发芽率、幼苗株高、幼苗鲜重，促进了根系的生长，增加了作物的产量，也可提高作物的对环境胁迫的耐受性，包括耐旱、耐寒、耐重金属、耐盐碱等，同时提高了作物抗病害能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明下列实施例所用的菌株具体种类如下：
所用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC1.8805、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.7677和多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCC1.15984。
实施例1：
一种含有根际促生菌微胶囊的种衣剂包含促生菌微胶囊、壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、明胶、交联剂和甘油。
还包括一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂的制备方法，包含以下步骤：
步骤(1)、菌株活化：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)分别划线接种于固体活化培养基，30℃，活化培养36小时后，得到活化菌，备用；
步骤(2)、种子液制备：将步骤(1)中活化后的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别接种于种子培养基，30℃，180转/分钟摇床振荡培养36小时后，得到三株菌种子液，备用；
步骤(3)、发酵液制备：将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别按体积接种量3.0％共同接种于发酵培养基，30℃，180转/分钟搅拌发酵；在发酵过程中，持续通入无菌空气量2.5vvmin培养36小时后，得到根际促生菌发酵液；10000转/分钟离心10分钟收集菌泥，备用；
步骤(4)、微胶囊制备：将2.0质量份的菌泥分散于2％的明胶水溶液中，并加入0.5质量份的海藻糖和2质量份的蔗糖酯，用5％乙酸溶液调节体系pH值至4.0；喷雾加入2.0％羧甲基纤维素溶液，2500×g均质5分钟形成乳液，40℃恒温30分钟，用3％NaOH调节体系pH值至5.0，添加3质量份的谷氨酰胺转氨酶，经40℃恒温固化反应60分钟形成微胶囊溶剂，经喷雾干燥得到促生菌微胶囊粉剂；
步骤(5)、种衣剂制备：在1％乙酸溶液中分别添加2.0质量份的壳聚糖、0.4质量份的羟丙基甲基纤维素、3.0质量份的明胶、0.2质量份的硼酸，在50℃恒温交联反应60分钟，然后加入10质量份步骤(4)中所述的促生菌微胶囊粉剂和2.0质量份的甘油，搅拌均匀，得到含促生菌微胶囊的种衣剂。
作为优选的，所述的固体活化培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的种子培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的发酵培养基包括：红糖50g/L、清蛋白10g/L乳、酵母浸粉20g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的微生物为解淀粉芽孢杆菌的菌体、地衣芽孢杆菌的菌体和多粘类芽孢杆菌的菌体的混合液时，所述微生物的总活菌浓度为2.5×109CFU/mL。
作为优选的，所述的明胶与羧甲基纤维素质量比为1:1。
作为优选的，所述的喷雾干燥的条件为进风温度为150℃，出风温度为70℃。
所述的含有促生菌微胶囊的种衣剂的使用方法是：在大麦种子播种前，用种衣剂对大麦种子包衣，种衣剂与大麦种子重量比为1:100，搅拌均匀，阴干后播种。
实施例2(含有未胶囊化的植物根际促生菌的种衣剂)：
一种含有根际促生菌的种衣剂包含促生菌、壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、明胶、交联剂和甘油。
还包括一种用于制备含有植物根际促生菌的种衣剂的制备方法，包含以下步骤：
步骤(1)、菌株活化：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)分别划线接种于固体活化培养基，30℃，活化培养36小时后，得到活化菌，备用。
步骤(2)、种子液制备：将步骤(1)中活化后的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别接种于种子培养基，30℃，180转/分钟摇床振荡培养36小时后，得到三株菌种子液，备用。
步骤(3)、发酵液制备：将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别按体积接种量3.0％共同接种于发酵培养基，30℃，180转/分钟搅拌发酵；在发酵过程中，持续通入无菌空气量2.5vvmin培养36小时后，得到根际促生菌发酵液；10000转/分钟离心10分钟收集菌泥，备用；
步骤(4)、种衣剂制备：在1％乙酸溶液中分别添加2.0质量份的壳聚糖、0.4质量份的羟丙基甲基纤维素、3.0质量份的明胶、0.2质量份的硼酸，在50℃恒温交联反应60分钟，然后加入2质量份步骤(3)中所述的促生菌菌泥，2.0质量份的甘油，搅拌均匀，得到含促生菌微胶囊的种衣剂。
作为优选的，所述的固体活化培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的种子培养基包括：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的发酵培养基包括：红糖50g/L、清蛋白10g/L乳、酵母浸粉20g/L、其余为蒸馏水。
作为优选的，所述的微生物为解淀粉芽孢杆菌的菌体、地衣芽孢杆菌的菌体和多粘类芽孢杆菌的菌体的混合液时，所述微生物的总活菌浓度为2.5×109CFU/mL。
本发明使用方法是：在大麦种子播种前，用种衣剂对大麦种子包衣，种衣剂与大麦种子重量比为1:100，搅拌均匀，阴干后播种。
实施例3(不含有植物根际促生菌的种衣剂)：
所述复合种衣剂包含壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、明胶、交联剂和甘油。
所述的复合种衣剂的制备方法，包含以下步骤：
在1％乙酸溶液中分别添加2.0质量份的壳聚糖、0.4质量份的羟丙基甲基纤维素、3.0质量份的明胶、0.2质量份的谷氨酰胺转氨酶，在50℃恒温交联反应60分钟，然后加入2.0质量份的甘油，搅拌均匀，得到复合种衣剂。
所述的含有复合种衣剂的使用方法是：在大麦种子播种前，用种衣剂对大麦种子包衣，种衣剂与大麦种子重量比为1:100，搅拌均匀，阴干后播种。
含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂应用效果试验：
(1)选择籽粒饱满一致的大麦种子(垦啤七号)，使用上述实施例1中的种衣剂进行包衣，以未包衣的处理作为空白对照(CK1)，以实施例2和实施例3中的种衣剂对照。种植于某科研基地，小区面积50m2，重复三次试验，随机排列。试验地土质为沙壤土，肥力一般。
(2)在大麦种子发芽期间调查发芽势、发芽率、发芽指数。发芽势＝(前三天正常发芽的种子数/供试的种子数×100％)，发芽率＝(正常发芽的种子数/供试的种子数×100％)，发芽指数Gt＝ΣGt/Dt(Gt为发芽试验终期内每日发芽数，Dt为发芽天数)。
表1 不同种衣剂对大麦种子发芽的影响
Figure BDA0003711640520000081
Figure BDA0003711640520000091
注：数值为测量的平均值±标准差(n＝3)，不同字母代表统计学差异(P＜0.05)。
(3)生长14天的幼苗每个处理选择20株幼苗，测定幼苗株高、根长和幼苗鲜重。
表2 不同种衣剂对大麦幼苗生长的影响
Figure BDA0003711640520000092
注：数值为测量的平均值±标准差(n＝3)，不同字母代表统计学差异(P＜0.05)。
表3 不同种衣剂对大麦产量的影响
Figure BDA0003711640520000093
注：数值为测量的平均值±标准差(n＝3)，不同字母代表统计学差异(P＜0.05)。
由结果可知，本发明通过复配对植物生长促进作用明显的促生菌微胶囊，包裹在大麦种子表面，有效地提高了大麦种子发芽率、幼苗株高、幼苗鲜重，促进了根系的生长，增加了大麦产量13.76％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂，其特征在于：包括有含有根际促生菌微胶囊的种衣剂，所述含有根际促生菌微胶囊的种衣剂包含促生菌微胶囊、壳聚糖、羟丙基甲基纤维素、明胶、交联剂和甘油，所述促生菌微胶囊的平均直径为10～200μm，所述的交联剂为硼酸、柠檬酸的一种或两种，所述壳聚糖的平均分子量为100kDa～10000kDa，脱乙酰度为80％～95％，所述羟丙基甲基纤维素的平均分子量为10kDa～30kDa，所述促生菌微胶囊包含促生菌、明胶、保护剂、乳化剂、羧甲基纤维素和固化剂，所述乳化剂为蔗糖酯，所述固化剂为谷氨酰胺转氨酶，所述保护剂为海藻糖，所述的谷氨酰胺转氨酶为食品级固体粉末，其酶活力为100～1000U/g。
2.一种用于制备权利要求1所述的含有植物根际促生菌微胶囊的种衣剂的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤(1)、菌株活化：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别划线接种于固体活化培养基，25～35℃，活化培养24～36小时后，得到活化菌，备用；
步骤(2)、种子液制备：将步骤(1)中活化后的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别接种于种子培养基，25～35℃，150～200转/分钟摇床振荡培养18～36小时后，得到三株菌种子液，备用；
步骤(3)、发酵液制备：将步骤(2)制备的解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌分别按体积接种量2.0～4.0％共同接种于发酵培养基，25～35℃，150～200转/分钟搅拌发酵；在发酵过程中，持续通入无菌空气量1.5～3.0vvmin培养18～36小时后，得到根际促生菌发酵液；6000～10000转/分钟离心10～20分钟收集菌泥，备用；
步骤(4)、微胶囊制备：将0.5～2.0质量份的菌泥分散于0.5％～2％的明胶水溶液中，并加入0.1～0.5质量份的海藻糖和2.5～3.5质量份的蔗糖酯，用5％乙酸溶液调节体系pH值至3.5～4.5；喷雾加入0.5～2.0％羧甲基纤维素溶液，2500×g均质5分钟形成乳液，40～60℃恒温10～30分钟，用3％NaOH调节体系pH值至5.5～6.5，添加1～5质量份的谷氨酰胺转氨酶，经30～50℃恒温固化反应30～90分钟形成微胶囊溶剂，经喷雾干燥得到促生菌微胶囊粉剂。
步骤(5)、种衣剂制备：在1％乙酸溶液中分别添加1～2.5质量份的壳聚糖、0.2～0.5质量份的羟丙基甲基纤维素、1.0～4.0质量份的明胶、0.1～0.5质量份的交联剂，在40～60℃恒温交联反应30～60分钟，然后加入5～10质量份步骤(4)中所述的促生菌微胶囊粉剂和1.5～2.5质量份的甘油，搅拌均匀，得到含促生菌微胶囊的种衣剂。
3.根据权利要求2所述的用于制备含有促生菌微胶囊的种衣剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述微生物为解淀粉芽孢杆菌的菌体、地衣芽孢杆菌的菌体和多粘类芽孢杆菌的菌体的混合液时，所述微生物的总活菌浓度为1.0～5.0×109CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的用于制备含有促生菌微胶囊的种衣剂制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的明胶与羧甲基纤维素质量比为1:0.8～1.2。
5.根据权利要求2所述的用于制备含有促生菌微胶囊的种衣剂制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述喷雾干燥的条件为进风温度为130～150℃，出风温度为60～70℃。
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