CN103969319B - 一种水生生物金属硫蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，属于电化学技术领域。所述的检测方法的原理为：溶液中待检测的金属硫蛋白分子，在选择的富集电位下富集到汞电极表面，与支持电解质Pt(NH₃)₂Cl₂发生反应产生H⁺，当电位扫描到-1.48V左右时反应的H⁺被还原，这样就可以在伏安图上产生特征峰及相应的电流。由于本法灵敏性高，检出限低，因此要求的样品量少，同时反应由扩散控制，受竞争吸附影响小，也即是检测受待分析样品中其它蛋白干扰不大，因此适宜使用标准曲线法检测。本发明是一种简单、可靠性好、准确性高、检出限低的检测水生生物内金属硫蛋白的方法。

Description

一种水生生物金属硫蛋白的检测方法

技术领域

本发明公开了一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，具体来说，涉及一种对水生生物内金属硫蛋白进行定性、定量分析的电化学方法。

背景技术

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量的能够被金属诱导产生的特异性蛋白，广泛地存在于生物体内，富含半胱氨酸，不含芳香族氨基酸，极个别的含有组氨酸，在生物体组织中起到解除重金属毒性、贮存和转运必需元素、清除自由基、调控基因表达等诸多作用。

在水环境生态研究中，金属硫蛋白的作用尤其受到人们的重视。这是由于金属硫蛋白的一个显著特点是其基因的转录能被环境金属诱导，转录水平与环境金属浓度直接相关。在正常生理状态下,生物体内存在一定水平的金属硫蛋白以调节必需金属元素，当周围环境中金属含量达到一定的浓度时，能诱导合成新的金属硫蛋白。因此，环境工作者们经常使用金属硫蛋白的含量作为评价水生生物所受重金属毒性的一个重要指标。

目前，检测水生生物内金属硫蛋白的经典方法主要有金属饱和法、电化学法以及分光光度法。金属饱和法灵敏度不高，且易受其它能结合金属的分子干扰，尤其水生生物中易积累环境中物质，因此不能准确定量分析生物中金属硫蛋白含量，特异性较差。分光光度法是以金属硫蛋白中巯基反应为基础，因此为了尽可能减少含巯基的小分子物质产生的干扰，对金属硫蛋白粗提取液的处理较为复杂。在水生生物中检测金属硫蛋白时采用最广泛的电化学方法是差示脉冲极谱法(DPP)，此法不受小分子干扰，不受待检测金属硫蛋白中所结合金属干扰，但检出限较高，且文献表明此法不能准确地定量反映甲壳纲生物中金属硫蛋白[PedersenKL,PedersenSN,KnudsenJ,etal.Quantificationofmetallothioneinbydifferentialpulsepolarographyoverestimatesconcentrationsincrustaceans[J].Environmentalscience&technology,2008,42(22):8426-8432]。因此，一种操作简单可靠、检出限低、应用范围广的定量分析方法在环境监测水生生物内金属硫蛋白时就十分必要了。

发明内容

本发明为了克服现有方法不足，提供一种简单、可靠性好、准确性高、检出限低的检测水生生物内金属硫蛋白的方法。本发明提供的检测方法的原理为：溶液中待检测的金属硫蛋白分子，在选择的富集电位下富集到汞电极表面，与支持电解质Pt(NH₃)₂Cl₂发生反应产生H⁺，当电位扫描到-1.48V左右时反应的H⁺被还原，这样就可以在伏安图上产生特征峰及相应的电流。由于本法灵敏性高，检出限低，因此要求的样品量少，同时反应由扩散控制，受竞争吸附影响小，也即是检测受待分析样品中其它蛋白干扰不大，因此适宜使用标准曲线法检测。

本发明提供的水生生物金属硫蛋白的检测方法，以Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，NH₄Cl+NH₄OH溶液为缓冲体系，使用方波阴极溶出伏安法(SWCVS)检测水生生物内金属硫蛋白，具体步骤如下：

第一步，绘制标准曲线；所述的标准曲线是指作为标准物的金属硫蛋白的电流-浓度曲线。

第二步，准备金属硫蛋白粗提取液：首先对待检测的水生生物进行清洗和称重；然后将所述的水生生物加入到匀浆液中，在冰浴中进行超声破碎，得到组织匀浆液；对所述的组织匀浆液一次离心处理得到一次上清液；一次上清液于99℃下恒温水浴5min，接着二次离心处理得到二次上清液；所述的二次上清液即为金属硫蛋白粗提取液。

第三步，采用SWCVS检测方法，检测金属硫蛋白粗提取液中金属硫蛋白浓度。

第四步，根据所述的金属硫蛋白粗提取液中金属硫蛋白的浓度以及大型溞湿重，换算得到待检测的水生生物中的金属硫蛋白的浓度。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

1、相比于传统的DPP法，本发明提供的检测方法检出限降低了一个数量级，使用标准兔肝蛋白做标准曲线显示，在金属硫蛋白浓度0～5ng/mL时曲线拥有良好的线性关系，将此法应用到大型溞内时也说明此浓度区间内适用于水生生物内金属硫蛋白的检测；

2、优化了金属硫蛋白的吸附电位及检测温度。本发明将金属硫蛋白的吸附电位定为-0.06V，研究表明该电位下对金属硫蛋白的吸附效果较强，且伏安曲线特征峰明显。在大型溞内检测金属硫蛋白时结果亦显示此电位下能有效减少干扰物质干扰，相比DPP提高了准确性。选择室温(20℃)作为检测条件，结果显示此温度下检测水生生物内金属硫蛋白结果更加接近真实值。

3、操作简便。相比于Ag饱和法、免疫法等，此法操作简便，非常适宜于环境监测时的定性定量工作。

附图说明

图1不同浓度的兔肝金属硫蛋白得到的伏安曲线；

图2将兔肝金属硫蛋白作为标准物绘制的标准曲线；

图3使用标准曲线法测量兔肝金属硫蛋白含量；

图4测定不同暴露铜浓度下大型溞内金属硫蛋白含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

本发明提供一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，以大型溞为例，采用的技术方案是：以Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，NH₄Cl+NH₄OH溶液为缓冲体系，使用方波阴极溶出伏安法(SWCVS)检测大型溞内金属硫蛋白，具体步骤如下：

第一步，标准曲线I-C(电流-浓度)的绘制：

使用瑞士万通797VA极谱仪作为三电极测试系统，汞电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，玻碳电极为对电极。电解池中加入10ml的1MNH₄Cl+NH₄OH(pH＝10.0)溶液作为缓冲体系，10μM的Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，选择SW(方波)模式，多次(至少四次)加入兔肝金属硫蛋白作为标准物，检测电流值，并绘制伏安曲线。

参见附图1，在缓冲体系中加入标准兔肝金属硫蛋白的浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、5ng/mL，得到的伏安曲线图，每个浓度处又重复测量了三次以增加曲线的精度。可以看到在图1中，位于-1.48V处产生了一个非常明显的特征峰，即使在加入金属硫蛋白浓度只有1ng/mL时，依然产生了200nA以上的峰电流值，显示了此法检出限低，灵敏度高，能在极低浓度金属硫蛋白下检测到波形，同时高电流值又减小了系统误差对测量的影响，增加了测量结果的准确性。

图2为根据图1绘制的标准曲线，所述的标准曲线为兔肝金属硫蛋白浓度和电流值的关系曲线。标准曲线显示了金属硫蛋白浓度为0～5ng/mL时浓度与电流拥有良好的线性关系，相关系数为0.99986。因此实际测定水生生物样品时，要保证检测的电流值在1μA以下才能根据标准曲线得到准确的结果。

当金属硫蛋白浓度为0～5ng/mL内，标准曲线中的金属硫蛋白浓度和电流值呈良好的线性关系，因此需保证绘制的标准曲线位于此浓度区间内。电化学参数如下：初始通5min氮气以除去溶液中溶解氧影响，富集电位选择为-0.06V，富集时间60s，扫描电位区间为-1.2V～-1.7V，扫描电位增幅为3mV，方波振幅50mV，频率50Hz，然后于室温(20℃)或者不低于室温下进行电流测定。

第二步，制备金属硫蛋白粗提取液：

取出10只活大型溞，用超纯水清洗后用滤纸吸干表面的水分，放入2ml预先称重的离心管中称重，得到这10只活大型溞的湿重W，接着加入1.0mlTris-HCl预冷的匀浆液(0.25mo1/L蔗糖，0.lmol/LTris-HCl，pH＝8.6缓冲液)，所述匀浆液的量保证可以保存活体大型溞的蛋白活性即可(一般每1mL匀浆液加入10-30只大型溞效果较佳)。在冰浴中用超声波细胞破碎机对所述的含有活大型溞的匀浆液进行破碎，制成组织匀浆液，然后对组织匀浆液进行一次离心处理，一次离心处理条件为在16000g，4℃下离心30min，取出上清液(也称一次上清液)，将一次上清液在99℃恒温水浴下加热5min去除不耐热的干扰蛋白，再对一次上清液进行二次离心处理，二次离心处理的条件为15000g，4℃下离心20min，取二次离心处理后的二次上清液作为金属硫蛋白粗提取液。

第三步，使用SWCVS检测大型溞内金属硫蛋白：

使用瑞士万通797VA极谱仪作为三电极测试系统，汞电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，玻碳电极为对电极。电解池中加入0.1mL金属硫蛋白粗提取液，10ml的1MNH₄Cl+NH₄OH(pH＝10.0)溶液作为缓冲体系，10μM的Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，选择SW模式，初始通5min氮气以除去溶液中溶解氧影响，富集电位选择为-0.06V，富集时间60s，扫描电位区间为-1.2V～-1.7V，扫描电位增幅为3mV，振幅50mV，频率50Hz，然后于室温(20℃)或者不低于室温条件下进行测定得到伏安曲线，再根据伏安曲线上的峰电流值，在第一步中绘制的标准曲线得到对应的金属硫蛋白的浓度C1。

第四步，根据所述的金属硫蛋白粗提取液中金属硫蛋白的浓度C1以及大型溞湿重W，换算得到待检测大型溞中的金属硫蛋白的浓度C2：

C2(ng/g)＝C1(ng/mL)×VmL/W(g)

V为匀浆液的体积。

采用本发明提供的检测方法测定1μg/mL浓度的兔肝金属硫蛋白。参见附图3，图3为使用标准曲线法测量已知浓度的兔肝金属硫蛋白浓度。如图3，检测值为0.97μg/mL，与真实值1μg/mL非常接近，显示了绘制的标准曲线准确性高，多次检测显示使用标准曲线法检测回收率都在95％以上。

采用本发明提供的检测方法测定自然条件下大型溞内金属硫蛋白的含量，经计算得到大型溞内金属硫蛋白含量为44μg/g，与现有技术中的Ag饱和法测量的值非常接近。而以往采用DPP法检测得到的值往往在1000μg/g以上，由此可见SWCSV法相比于DPP增大了检测结果的准确性。

本发明中还测定了不同暴露铜浓度下大型溞内金属硫蛋白的含量。

参见附图4，在暴露铜浓度在10μg/L时大型溞内金属硫蛋白含量相比于空白变化不大，而在暴露铜浓度为30μg/L时金属硫蛋白的浓度有了较大的提高。这也是与以往的认知是一致的，在自然条件下大型溞体内存在一定数量金属硫蛋白，在铜浓度较低，对大型溞毒性不大时，生物体内并不合成新的金属硫蛋白，而在铜浓度较高时，大型溞会合成蛋白用于重金属解毒。因此可见，本法准确反映了大型溞内金属硫蛋白的真实变化。

Claims (6)

1.一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：

第一步，绘制标准金属硫蛋白浓度-电流曲线；所述标准金属硫蛋白浓度为0～5ng/mL；

第二步，准备金属硫蛋白粗提取液：首先对待检测的水生生物进行清洗和称重；然后将所述的水生生物加入到匀浆液中，在冰浴中进行超声破碎，得到组织匀浆液；对所述的组织匀浆液一次离心处理得到一次上清液；二次离心处理一次上清液得到二次上清液；所述的二次上清液即为金属硫蛋白粗提取液；

第三步，采用方波阴极溶出伏安法，检测金属硫蛋白粗提取液中金属硫蛋白浓度，具体为：

使用瑞士万通797VA极谱仪作为三电极测试系统，汞电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，玻碳电极为对电极；电解池中加入0.1mL金属硫蛋白粗提取液，10ml的1MNH₄Cl+NH₄OH溶液作为缓冲体系，10μM的Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，选择SW模式，初始通5min氮气以除去溶液中溶解氧影响，富集电位选择为-0.06V，富集时间60s，扫描电位区间为-1.2V～-1.7V，扫描电位增幅为3mV，振幅50mV，频率50Hz，然后于室温或者不低于室温条件下进行测定得到伏安曲线，再根据伏安曲线上的峰电流值，在第一步中绘制的标准曲线得到对应的金属硫蛋白的浓度；

第四步，根据所述的金属硫蛋白粗提取液中金属硫蛋白的浓度以及大型溞湿重，换算得到待检测的水生生物中的金属硫蛋白的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：第一步具体步骤如下：

使用瑞士万通797VA极谱仪作为三电极测试系统，汞电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，玻碳电极为对电极，电解池中加入10ml的1MNH₄Cl+NH₄OH溶液作为缓冲体系，10μM的Pt(NH₃)₂Cl₂为支持电解质，选择SW方波模式，多次加入兔肝金属硫蛋白作为标准物，电化学参数如下：初始通5min氮气以除去溶液中溶解氧影响，富集电位选择为-0.06V，富集时间60s，扫描电位区间为-1.2V～-1.7V，扫描电位增幅为3mV，方波振幅50mV，频率50Hz，然后于室温或者不低于室温下进行电流测定，并绘制伏安曲线。

3.根据权利要求1所述的一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：所述匀浆液为0.25mo1/L蔗糖，0.lmol/LTris-HCl，pH＝8.6缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：所述一次离心处理条件为在16000g，4℃下离心30min。

5.根据权利要求1所述的一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：将一次上清液在99℃恒温水浴下加热5min去除不耐热的干扰蛋白，再对一次上清液进行二次离心处理，二次离心处理的条件为15000g，4℃下转速离心20min，取二次离心处理后的二次上清液作为金属硫蛋白粗提取液。

6.根据权利要求1～5中任意一项权利要求所述的一种水生生物金属硫蛋白的检测方法，其特征在于：所述的水生生物为大型溞。