CN113447104B - 测量微型水生生物鲜重的方法、微型装置和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种测量微型水生生物鲜重的方法、微型装置和应用，该方法包括：(1)天平垫称量纸去皮调零；(2)取出滤网在下面垫有机滤膜；(3)剪掉枪头尖头，用移液枪吸入大型溞转移到滤网中心，吸入大型溞随带的水会被垫付在滤网下面的滤膜吸出，达到大型溞溞体和水分的分离；(4)取完所有大型溞，用滤膜析出溞体周围剩余水分后，称量截留大型溞的筛网质量；(5)把大型溞倒入水体中，称量此时滤网质量，差值即为大型溞鲜重。本发明缓解测量鲜重时大型溞和周围水分分离过程中面临物理损伤、耗时长，不易重复操作的问题，能快速高效测量微小型水生动物鲜重，为评价其相关毒性效应的毒性指标提供数据支撑。

Description

测量微型水生生物鲜重的方法、微型装置和应用
技术领域
本发明涉及环境与生物技术领域，尤其是涉及一种测量微型水生生物鲜重的方法、微型装置和应用。
背景技术
化学品的污染严重威胁着人体健康和生态环境安全，评价化学品对水生生物的毒理效应对其生态风险评价具有重要意义。
大型溞(Daphnia magna)作为一种模式生物，常被用于研究化学品的生态毒理效应。大型溞属节肢动物门、甲壳动物纲，在世界范围分布广泛，处在水生生态系统食物链的第二级(初级消费者)，在水生生态系统中具有重要地位。大型溞主要以孤雌生殖方式进行繁殖，在实验室容易被培养繁殖；大型溞体型微小且透明，对水环境中有毒物质敏感性高，身体透明可被用于显微镜成像研究。基于以上原因，大型溞作为标准测试生物被广泛应用于有毒化学物质的生态毒理学效应及机制研究。
研究有毒化学物质的生态毒理学效应及机制时，需要测定受试生物因暴露于目标化学物质导致的一些毒性效应指标变化，例如，体内活性氧物种浓度变化，抗氧化物酶(过氧化氢酶，超氧歧化酶，谷胱甘肽氧化物酶，乙酰胆酯酶等)活性变化，脂质过氧化产物含量，DNA损伤标志物8羟基脱氧鸟苷等。在测定上述各项生化指标过程中，我们首先需要测量生物体的湿重，准确的测量受试生物的鲜重对于各项指标的测定结果具有直接影响。大型溞形体微小，身体周围会吸附水分，容易吸附在器皿上，称量过程中大型溞和周围水不易分离、耗时长、容易造成物理损伤等，因此发展一种快速方便测定大型溞等微型水生生物湿重的方法对于评价污染物的毒性效应及作用机理具有重要意义。而目前国内外还没有较为可靠的准确的方法快速称量大型溞鲜重。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种测量微型水生生物鲜重的方法，能够缓解测量鲜重时大型溞和周围水分分离过程中面临物理损伤、耗时长，不易重复操作的问题，能够使大型溞溞体和水分快速有效分离。
本发明的目的之二在于提供一种实现上述测量方法的微型装置。
本发明的目的之三在于提供一种上述测量方法或上述微型装置在评价有毒化学品的生态毒理效应中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种测量微型水生生物鲜重的方法，包括以下步骤：
(a)天平放称量纸去皮调零；
(b)提供微型装置：所述微型装置包括有机滤膜和滤网，所述滤网下垫付有所述有机滤膜；所述滤网呈柱形漏式结构，包括框架主体和安装在所述框架主体底部和侧面的过滤网，所述过滤网的材质为尼龙，所述过滤网的孔径为270-300目；有机滤膜的材质为聚酰胺类高分子聚合物；
(c)吸取待测量的微型水生生物并转移到所述滤网中，吸取微型水生生物所携带的水被垫付在所述滤网下面的所述有机滤膜吸出，使微型水生生物和水分分离，重复操作直至取完所有待测量的微型水生生物；
(d)所述有机滤膜吸出微型水生生物周围的剩余水分后，称量截留有微型水生生物的滤网质量，记为W1g；
(e)将截留有微型水生生物的滤网倾倒到水中，触碰底部，使微型水生生物倒入水中，称量滤网质量，记为W2g，则(W1-W2)g为此次微型水生生物鲜重；或者，
在步骤(a)天平放称量纸去皮调零后放滤网，称量滤网质量，记为W2g，则(W1-W2)g为此次微型水生生物鲜重；
(f)待微型水生生物恢复游泳能力后，按照上述方法重新操作，多次称量得到微型水生生物鲜重的平均值。
进一步的，所述框架主体底部的所述过滤网的直径为20-22mm；
所述滤网的高度为12-14mm。
进一步的，所述框架主体底部的所述过滤网为可拆卸结构。
进一步的，所述有机滤膜的直径为20.5-22.5mm。
进一步的，所述滤网带有把手，所述把手的长度为10-11mm；所述滤网的上层横截面的直径为28-29mm。
进一步的，步骤(c)吸取待测量的微型水生生物并转移到所述滤网中，包括：
剪掉1mL枪头尖头，吸入口直径大于微型水生生物的体长，用1mL量程移液枪吸入微型水生生物然后转移到滤网中心；微型水生生物和水分的吸入量为500μL；重复操作直到取完所有待测量的微型水生生物。
进一步的，所述微型水生生物包括大型溞、斑马鱼、丰年虾。
第二方面，本发明提供了一种实现测量微型水生生物鲜重的方法的微型装置，包括有机滤膜和滤网，所述滤网下垫付有所述有机滤膜；所述滤网呈柱形漏式结构，包括框架主体和安装在所述框架主体底部和侧面的过滤网，所述过滤网的材质为尼龙，所述过滤网的孔径为270-300目。
进一步的，所述框架主体底部的所述过滤网的直径为20-22mm；
所述滤网的高度为12-14mm；
所述滤网带有把手，所述把手的长度为10-11mm；所述滤网的开口处上层横截面的直径为28-29mm；
所述有机滤膜的直径为20.5-22.5mm。
第三方面，本发明提供了一种上述测量微型水生生物鲜重的方法或上述微型装置在评价有毒化学品的生态毒理效应中的应用。
本发明提供的测量微型水生生物鲜重的方法、微型装置和应用至少具有如下有益效果：
本发明通过滤网和有机滤膜的配合，实现了微型水生生物体和水分快速有效分离，有机滤膜能够快速吸水能提高生物体和周围水分分离的效率，且该有机滤膜不易残留组分(如动物纤维)到滤网上。
该方法过程能够在1min内快速分离，并且对微型水生生物体(例如大型溞)物理损伤小，称量过后的微型水生生物，置入水中又可以快速恢复生机。
本发明的尼龙滤网可以快速风干，滤网和有机滤膜可以重复利用，达到节能环保效果。
本发明提出的制备滤网组合有机滤膜在测量微型水生生物鲜重的方法和装置可应用到生态毒理学研究中环境污染物的毒性效应评价。应用范围广，可以快速高效测量以溞类为代表的微小型水生动物(例如大型溞Daphnia magna)的鲜重，为评价其相关毒性效应的毒性指标提供数据支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明滤网的俯视图；
图2为本发明滤网的侧视图；
图3为本发明大型溞湿重测定的操作流程；
图4为应用实施例2不同生长周期大型溞的蛋白浓度；
图5为应用实施例3大型溞体重随喂养时间的变化。
图标：1-框架主体；2-过滤网；3-把手。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种测量微型水生生物鲜重(湿重)的方法，如图3所示，包括以下步骤：
S1：天平放称量纸去皮调零；
天平垫一张称量纸后去皮调零，放入滤网并称重(记为W2)。垫称量纸是为了防止天平托盘有其他物质吸附到滤网底部。
S2：取出称重的滤网，在滤网下面垫一张有机滤膜；
如图1-图2所示，滤网呈柱形漏式结构，上端开口，包括框架主体1和安装在框架主体1底部和侧面的过滤网2，框架主体1上部形成环形结构，框架主体1侧面形成若干筋条，筋条与筋条之间的侧面安装侧面过滤网2，若干筋条下端连接环形结构，下端环形结构安装底部过滤网2。过滤网2的材质为尼龙，过滤网2的孔径为270-300目(例如280目、290目)。
采用270-300目的尼龙过滤网制备成漏斗状的滤网用于微型水生生物的溞体和水分分离。选择尼龙材料作为过滤网是因为其对大型溞毒性伤害小。此外270-300目的过滤网孔径(约为48-53μm)远小于刚出生的大型溞新生幼溞的体长(150-250μm)，因此能够很好截留大型溞在滤网上，并且不易造成损伤。当大型溞溞体和水分分离完全时，尼龙材料可以方便大型溞被倾倒取出置入器皿中。
优选地，上部环形结构设有把手3。
优选地，底部过滤网2为可拆卸结构。该滤网装置底部过滤网材料设计为可以拆卸更换，可以避免材料多次使用造成残留对实验造成误差。尼龙材料可以拆卸更换，使用过的尼龙材料可以清洗多次重复使用，设计原则有利于环保节能。
在一种优选的实施方式中，滤网的设计尺寸参数：底部过滤网直径为20-22mm,孔径为48-53μm；滤网高度为12-14mm；上层横截面(上部环形结构)直径为28-29mm；把手长度为10-11mm。
滤网的底层滤网材料直径设计10.5mm，适宜一次性最多称量10-12只大型溞的湿重。如果需要一次性称量更多数量的大型溞应尽量避免大型溞堆积在一起不利于溞体和水分的分离或者重新设计装置加大底部滤网材料的直径。
垫付在滤网下端的选择为有机微孔滤膜，有机溶剂微孔滤膜为聚酰胺类高分子聚合物在特殊工艺条件(将膜材料用一定配比的硝酸添加剂混合溶剂进行充分溶解，经静止脱泡后，以0.4mm间隙流延成平板膜，膜的外观呈不透明乳白色)下制成的一种耐各种有机溶剂的筛网型精密滤材。使用该有机滤膜可以通过吸附作用吸附大型溞周身的水分，水分分离效率高。相比于其他材料如玻璃纤维素滤膜、混纤膜、棉花、其他吸水纸，该有机滤膜不易残留其他物质粘附在滤网底部。使用的有机滤膜直径优选为20mm。
S3：吸取待测量的微型水生生物并转移到所述滤网中，吸取微型水生生物所携带的水被垫付在所述滤网下面的所述有机滤膜吸出，使微型水生生物和水分分离，重复操作直至取完所有待测量的微型水生生物；
微型水生生物包括但不限于大型溞，还可以测量如斑马鱼、丰年虾等水生生物的鲜重。
在一种具体的实施方式中，S3具体包括：剪掉1mL枪头尖头，吸入口直径大于大型溞的体长。用1mL量程移液枪吸入大型溞然后小心翼翼转移到筛网中心处。溞体和水分的吸入量为500μL。吸入大型溞随带的水会被垫付在筛网下面的滤膜吸出，从而达到大型溞溞体和水分的分离(图3)。然后重复该操作直到需要取完所有需要称量的大型溞。尽量避免溞体在筛网上面堆积，不利于溞体周围水分的去除。
S4：所述有机滤膜吸出微型水生生物周围的剩余水分后，称量截留有微型水生生物的滤网质量(即将称量纸和滤网一起放上天平)，记为W1g；
S5：将截留有微型水生生物的滤网倾倒到水中，触碰底部，使微型水生生物倒入水中，称量滤网质量，记为W2g，则(W1-W2)g为此次微型水生生物鲜重；
S6：待微型水生生物恢复游泳能力后，按照上述方法重新操作，多次称量测定微型水生生物的平均鲜重。
需要注意的是，滤网质量W2可以在S1步进行测量，也可以在S5步进行测量，任选一种方式即可。
根据本发明的第二个方面，提供了一种实现测量微型水生生物鲜重的方法的微型装置，包括有机滤膜和滤网，滤网垫付有有机滤膜；滤网呈柱形漏式结构，包括框架主体1和安装在框架主体1底部和侧面的过滤网2，过滤网的材质为尼龙，过滤网的孔径为270-300目。
优选地，上部环形结构设有把手3。
优选地，底部过滤网2为可拆卸结构。
在一种优选的实施方式中，滤网的设计尺寸参数：底部过滤网直径为20-22mm(例如21mm),孔径为48-53μm(例如50μm)；滤网高度为12-14mm(例如13mm)；上层横截面(上部环形结构)直径为28-29mm；把手长度(所在圆直径)为10-11mm。
在一种优选的实施方式中，有机滤膜的直径为20.5-22.5mm(例如21.5mm)。
关于滤网和有机滤膜的描述与第一方面中的对应描述相同，在此不再赘述。
具体地，一种优选的实施例，如图1所示，把手R1＝6mm，框架上部有机滤膜框架外边缘半径R2＝14.25mm，框架上部有机滤膜框架内边缘半径R3＝12.5mm，框架底部有机滤膜框架外半径R4＝11.25，框架底部支撑框架内半径R5＝10.5mm。
本发明方法和装置通过滤网和有机滤膜的配合，实现了微型水生生物体和水分快速有效分离，有机滤膜能够快速吸水能提高生物体和周围水分分离的效率，且该有机滤膜不易残留组分(如动物纤维)到滤网上。该方法过程能够在1min内快速分离，并且对微型水生生物体(例如大型溞)物理损伤小，称量过后的微型水生生物，置入水中又可以快速恢复生机。本发明的尼龙滤网可以快速风干，滤网和有机滤膜可以重复利用，达到节能环保效果。
根据本发明的第三个方面，提供了一种上述测量微型水生生物鲜重的方法或上述微型装置在评价有毒化学品的生态毒理效应中的应用。
本发明方法和装置应用范围广，可以快速高效测量以溞类为代表的微小型水生动物(例如大型溞Daphnia magna)的鲜重，为评价其相关毒性效应的毒性指标提供数据支撑。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
应用实施例1大型溞含水率测定
大型溞身体具有外表体壳，当体表的水吸干之后，大型溞形如一颗颗小水珠。采用冷冻干燥的方法我们把大型溞干燥，测定了其干重，然后计算出了大型溞的含水率，如表1所示。
表1大型溞的湿重、干重及含水率测定
Figure BDA0003134481530000091
应用实施例2不同培养周期大型溞蛋白含量
在测定各种酶活性的过程中，测定蛋白含量是关键的一步。蛋白质分子具有-NH3 +基团，当棕红色的考马斯亮蓝显色剂加入蛋白标准液或含有未知浓度蛋白样品时，考马斯亮蓝染料上的阴离子与蛋白-NH3 +结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。本实验测定不同生长周期：新生婴儿期(溞龄，Neonates：0-1天)、青少年期(Juveniles，5天)、成年期(Adults,21天)大型溞的蛋白浓度。按照本发明方法测定大型溞湿重，然后根据考马斯亮蓝方法测定蛋白含量，最终计算出大型溞蛋白浓度单位为mg protein/g，如图4所示。
应用实施例3不同喂食方法对大型溞生长发育的影响
采用该技术方案，设计实验研究了不同喂食方法对大型溞生长发育的影响。实验分为两组，每组实验选择同批次生长良好的大型溞幼溞50只，培养于1000mL烧杯中，培养用水为曝气后的自来水，培养条件：温度：25℃；湿度：50％RH；光强；3000lux；光暗周期比：16:8。培养的前五天，A组喂食1mL绿藻，B组喂食1mL绿藻+0.5mL酵母菌(0.0050g溶于10mL超纯水)，每天早上喂一次。观察其生长趋势；后5天后，调整喂食方案，A组喂2mL绿藻，B组喂2mL绿藻+0.5mL酵母菌。
在培养过程中，每天定时(18:00)称量大型溞的体重。为了评估A组和B组不同喂食方法的差异性，每组随机抽取5只溞称量体重。按照本发明，用胶头吸管逐一把抽取5只溞轻放到滤网上，并保持一定间距，避免溞体堆积在滤网上。然后待有机滤膜吸干大型溞体表的水分，迅速称量大型溞的湿重。称量结束后，把大型溞倒入水体中待其复苏。每组实验组按照上述方法抽样3次，测量3次。持续测量10天大型溞体重增长情况(表2)。图5为大型溞体重(湿重，g)随喂养时间的变化。
表2.不同喂养方式对大型溞体重增长影响(A:喂食绿藻；B:喂食绿藻+酵母菌，单位，g)
Figure BDA0003134481530000101
/>
Figure BDA0003134481530000111
研究结果表明，在持续培养过程中，无论采取哪种喂食方式大型溞的体重呈现一个波动性增长，不是持续性增长(图5)。添加酵母菌会导致大型溞体重增长更快。相比于只采用绿藻喂养，采用绿藻+酵母菌混合喂养的方式会使大型溞体重增加的速率加快。在喂养到达10天时，A组大型溞体重增长率平均达到153.1％，而B组大型溞体重增长率达到246.7％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种测量微型水生生物鲜重的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)天平放称量纸去皮调零；
(b)提供微型装置：所述微型装置包括有机滤膜和滤网，所述滤网下垫付有所述有机滤膜；所述滤网呈柱形漏式结构，包括框架主体和安装在所述框架主体底部和侧面的过滤网，所述过滤网的材质为尼龙，所述过滤网的孔径为270-300目；有机滤膜的材质为聚酰胺类高分子聚合物；
(c)吸取待测量的微型水生生物并转移到所述滤网中，吸取微型水生生物所携带的水被垫付在所述滤网下面的所述有机滤膜吸出，使微型水生生物和水分分离，重复操作直至取完所有待测量的微型水生生物；
(d)所述有机滤膜吸出微型水生生物周围的剩余水分后，称量截留有微型水生生物的滤网质量，记为W1 g；
(e)将截留有微型水生生物的滤网倾倒到水中，触碰底部，使微型水生生物倒入水中，称量滤网质量，记为W2 g，则(W1-W2)g为此次微型水生生物鲜重；或者，
在步骤(a)天平放称量纸去皮调零后放滤网，称量滤网质量，记为W2 g，则(W1-W2)g为此次微型水生生物鲜重；
(f)待微型水生生物恢复游泳能力后，按照上述方法重新操作，多次称量得到微型水生生物鲜重的平均值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述框架主体底部的所述过滤网的直径为20-22mm；
所述滤网的高度为12-14mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述框架主体底部的所述过滤网为可拆卸结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机滤膜的直径为20.5-22.5mm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述滤网带有把手，所述把手的长度为10-11mm；所述滤网的上层横截面的直径为28-29mm。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)吸取待测量的微型水生生物并转移到所述滤网中，包括：
剪掉1mL枪头尖头，吸入口直径大于微型水生生物的体长，用1mL量程移液枪吸入微型水生生物然后转移到滤网中心；微型水生生物和水分的吸入量为500μL；重复操作直到取完所有待测量的微型水生生物。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述微型水生生物包括大型溞、斑马鱼、丰年虾。
8.一种实现权利要求1-7任一项所述的测量微型水生生物鲜重的方法的微型装置，其特征在于，包括有机滤膜和滤网，所述滤网下垫付有所述有机滤膜；所述滤网呈柱形漏式结构，包括框架主体和安装在所述框架主体底部和侧面的过滤网，所述过滤网的材质为尼龙，所述过滤网的孔径为270-300目。
9.根据权利要求8所述的微型装置，其特征在于，所述框架主体底部的所述过滤网的直径为20-22mm；
所述滤网的高度为12-14mm；
所述滤网带有把手，所述把手的长度为10-11mm；所述滤网的上层横截面的直径为28-29mm；
所述有机滤膜的直径为20.5-22.5mm。
10.一种权利要求1-7任一项所述的测量微型水生生物鲜重的方法或权利要求8或9所述的微型装置在评价有毒化学品的生态毒理效应中的应用。
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