CN110915765B - 一种果蝇采食量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果蝇采食量检测方法，其包括以下步骤：(1)将待测果蝇使用第一固体培养基进行培养；(2)待所述果蝇完成第一周期培养后，使用第二固体培养基继续第二周期培养；(3)在完成第二周期培养后对果蝇排泄物进行测定；其中，所述第一固体培养基含有亮蓝染料，第二固体培养基不含染料。本发明可在不伤害果蝇的前提下，准确地、连续地对果蝇长时间多时间点的采食量进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及果蝇采食量检测方法的技术领域。
背景技术
果蝇是生物学研究中常用的模式动物，在遗传学、行为学、营养学和药理学等领域使用极为广泛。对果蝇采食量的测定一直是以果蝇为模式动物的研究中的一项重要实验内容，是营养学、行为学和药物研究中必不可少的指标。
为了测定果蝇的采食量，现有技术中陆续开发了多种方法，其中，被国内外同行采用较多的主流方法包括：毛细管法、染料法、放射性同位素标记法和采食行为观察记录法几种。其中毛细管法通过将液体培养基注入玻璃毛细管，再记录毛细管中液面的下降高度的方式来计算果蝇的采食量，其只适用于液体培养基饲养条件下的果蝇采食量测定，而对使用最为普遍的各类固体培养基则不适用。染料法通过在食物中添加特定非吸收性染料，将进食后的果蝇转入加水的EP管中研磨捣碎，使染料重新溶于水，再进行吸光度测定的方式间接反映果蝇采食量，由于果蝇进食后会在短时间内排除体内染料，因此该方法只能测定果蝇30分钟内的采食量，随机因素大，结果变异性高，同时其还需要杀死果蝇，因此无法测定多个时间点的采食量。同位素标记法通过在培养基中添加特定放射性同位素如32P，其后测定果蝇进食后体内放射性同位素的积累水平的方式来测定采食量，其精确度容易受到培养基营养组成及果蝇性别差异的影响，且同样需要杀死果蝇进行测定，因而也不适用于多时间节点的采食量测定。采食行为观察记录法通过人工观察或计算机电信号记录果蝇一段时间内口器与食物接触的次数的方式来反映果蝇的采食量，其只能记录果蝇进食的次数而无法测定果蝇进食的体积，因而并不是真正意义上的测定采食量的方法。综上所述，可以看出，现有技术中并无任何一种方法能够实现对果蝇的长时间、多时间点采食量，特别是固体培养基采食量的精确测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可对果蝇长时间、多时间点采食量进行精确测定的果蝇采食量检测方法。
为实现上述目的一，本发明提供了如下的技术方案：
一种果蝇采食量检测方法，其包括以下步骤：
(1)将待测果蝇转移至培养装置内，使用第一固体培养基进行培养；
(2)待所述果蝇完成第一周期培养后，将第一固体培养基更换为第二固体培养基，继续第二周期培养；
(3)将完成第二周期培养的果蝇移出所述培养装置，对培养装置内的果蝇排泄物进行测定；
其中，所述第一固体培养基含有亮蓝染料，第二固体培养基不含染料。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一固体培养基可通过在一般固体培养基中加入亮蓝染料的方式获得，第二固体培养基可使用不含染料的一般固体培养基。
根据本发明的一些具体实施方式，所述一般固体培养基可为酵母培养基和/或氨基酸培养基，如一种通过如下过程制得的酵母培养基：量取1升水，倒入锅中煮沸，加入琼脂，搅拌溶解后关火，加入酵母粉与蔗糖，搅拌溶解，待冷却到60℃以下，加入丙酸与尼泊金，混匀分装即可，其刚配好时为液体，冷却后即为固体。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一固体培养基含有0.5-1.5wt％的亮蓝染料。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一固体培养基和所述第二固体培养基的直径为3-6mm。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一固体培养基和所述第二固体培养基的直径为3.5-5.5mm
发明人意外地发现，在使用本发明的检测方法对果蝇采食量进行准确测定时，培养基的接触面积对果蝇排泄物的回收率及测定准确率有影响，在培养基直径为3-6mm，或更优的，培养基直径为3.5-5.5mm时可得到最佳的排泄物回收率和测定准确率。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一周期时长1-48h。
发明人意外地发现，相对于现有技术，本发明不仅可准确测定短时采食量，同时可准确测定长时间的采食量。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一周期时长为12-24h。该实施方式在准确测定长时间采食量时，可进一步避免补充食物带来的麻烦。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第二周期时长为0.5-5h。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第二周期时长为2.5-3.5h。
根据本发明的一些具体实施方式，所述第一周期时长为23-25h，所述第二周期时长为2.5-3.5h。
根据本发明的一些具体实施方式，所述测定的过程包括：向所述培养装置内加入溶剂，待果蝇排泄物全部溶解后，测试所得溶液吸光度，并与标准吸光度曲线进行对比，得出溶液中排泄物浓度，计算出采食量。
根据本发明的一些具体实施方式，所述溶剂为水，如蒸馏水、去离子水等。
根据本发明的一些具体实施方式，所述溶剂为1wt％的PBST溶液。
根据本发明的一些具体实施方式，所述培养装置包括具有通气孔的、上端开放的培养管，与培养管适配的、具有插入孔的管盖，和至少2个可通过所述插入孔延伸至所述培养管管体内的放置器，所述放置器具有可覆盖或镶嵌于所述插入孔的器盖和可容纳固体培养基的器体，所述器体为下端开放的圆筒状，其内径为3-6mm。
上述方案中所述适配是指的所述管盖可通过插入、覆盖、包裹等多种方式完成与所述培养管的配合以使得培养管的开放式上端得到闭合。
上述方案中所述覆盖通常是指的在所述器盖的面积大于或等于所述插入孔面积时出现的情形。
上述方案中所述镶嵌通常是指的所述器盖的面积等于或略小于所述插入孔面积时出现的情形。
根据本发明的一些具体实施方式，所述管体内径为20-30mm。
根据本发明的一些具体实施方式，所述管体长度为100-150mm。
根据本发明的一些优选实施方式，所述通气孔孔径为0.1-0.5mm。
根据本发明的一些具体实施方式，所述培养管为含有柱状管体的透明部件。
根据本发明的一些具体实施方式，所述管盖及所述放置器均为透明部件。
根据本发明的一些具体实施方式，所述培养管、管盖及放置器均为透明塑料材料。
本发明可在不伤害果蝇的情况下，对果蝇的长时间、多时间点采食量进行精确地测定，可对同一实验样本果蝇在不同日龄段的采食量进行连续的测定。同时本发明的培养装置、所用培养基及培养方法均简单易得，可控性高，稳定性好，成本低廉。
附图说明
图1为实施例1所用培养装置的立体结构示意图(仅做结构示意图，具体尺寸以说明书文字为准)；
图2为实施例1所用培养装置的各部件端面结构示意图(仅做结构示意，在图1的基础上比例进行了放大，具体尺寸以说明书文字为准)；
图3为实施例3中标准吸光度曲线；
图4为实施例4中标准吸光度曲线；
图5为实施例5中标准吸光度曲线；
图6为实施例6中饲养时间与所测得果蝇的采食量的统计图。
图7为对比例1中最大培养基直径对应的培养装置示意图；
图8为对比例1不同培养基直径与果蝇采食量的对比统计图；
图9为对比例2中不同培养基直径与果蝇排泄物收集量的对比统计图；
图10为对比例3中不同培养基直径与果蝇体内同位素含量的对比统计图；
图11为对比例3中不同培养基直径与果蝇排泄物同位素含量的对比统计图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但需要理解的是，所述实施例和附图仅用于对本发明进行示例性的描述，而并不能对本发明的保护范围构成任何限制。所有包含在本发明的发明宗旨范围内的合理的变换和组合均落入本发明的保护范围。
以下各实施例使用如下的培养基：
第一固体培养基：在一般固体培养基中加入1wt％的亮蓝染料。
其配制过程为：取10mL热的一般固体培养基，加入到15mL离心管中，其后加入100mg亮蓝染料粉末，摇匀至染料完全溶解于培养基中，将该含染料的培养基加入到放置器3的器体302中，待其冷却后即可使用，该培养基中染料浓度为10mg/mL。
第二固体培养基：一般固体培养基。
以下各实施例采用如下的方法进行采食量测定：
将完成所述第一周期及第二周期培养的果蝇移出培养管1，其后使用胶带封住管盖上的插入孔201和管壁上的通气孔101，向培养管1内加入1-10mL溶剂盖上管盖，颠倒摇晃使管壁和盖子内部的染料完全溶于溶剂中，最后，吸取100μL溶液于透明酶标板，利用酶标仪在630nm波长条件下测定溶液吸光度，另取亮蓝染料使用蒸馏水配制为标准品溶液，进行梯度稀释，在相同的仪器与条件下测试其在不同浓度下的吸光度，绘制为标准吸光度曲线，通过排泄物溶液吸光度与标准曲线吸光度的对比，获得排泄物中染料浓度，进而再计算出采食量。
上述测定方法中，加入的溶剂如蒸馏水的体积可根据培养基的种类进行调整，如使用纯化学培养基(如：100N50S)时，果蝇采食量较大，可加入5-10mL蒸馏水；使用酵母培养基(如1SY，10％酵母+5％蔗糖)时，果蝇采食量较小，可加入3mL蒸馏水；使用更高浓度的酵母培养基(如2SY，20％酵母+5％蔗糖)，可加入1-2mL蒸馏水。同一批测定过程各处理组及各个培养管中加入的蒸馏水体积必须一样。
实施例1
如附图1所示的培养装置，其包括一个外径W1为28.5mm、内径N1为26mm，长度为130mm的圆底透明塑料果蝇培养管1，培养管1上部有多个周向分布的、直径为0.5mm的通气孔101，以供果蝇呼吸；一个内径N2为23.5mm，外径W2为25-26mm的顶部带插入孔201的透明塑料大盖子，即管盖2；管盖2通过其延伸部分插入培养管1内实现对培养管1的闭合，一个放置器3，放置器3包括一体成型的透明塑料小盖子、即器盖301和内径N3为5.5mm、外径W3为7mm的下端开放的柱形器体302，器体302的外径W3与管盖2顶部插入孔201的直径相同，因此可以通过插入孔201插入到管盖2中。管盖2延伸部分的外径与培养管1的内径一致，因此可以插入到培养管1中，进而组成一个完整的采食量测定装置。
实施例2
使用如实施例1所述的培养装置，对果蝇进行采食量检测，过程如下：
(1)预先准备两种固体培养基，即含有1％亮蓝染料的第一培养基和不含染料的第二培养基，两种培养基分别填充入两个装置器3的器体302内；
(2)将待测果蝇转移到果蝇培养管1中，盖上管盖2，并将装有第一培养基的装置器3插入到管盖2内；
(3)待果蝇进食24小时后，培养管1的管壁上可见到大量含有亮蓝染料的果蝇排泄物；
(4)将装有第一培养基的装置器3更换为装有第二培养基的装置器3，使果蝇进食不含染料的培养基3小时，从而排出体内残余的蓝色染料，进而可收集24小时内果蝇全部排泄物；
(5)3h后取出装置器3，并将果蝇从培养管1中转出，通过上述采食量测定方法进行采食量测定。
实施例3
使用如实施例2所述的检测过程，其中待测果蝇为每个培养管中10只，标准吸光曲线的制作包括：
取100mg亮蓝染料溶于10mL蒸馏水中配置成母液。取1mL母液到1.5mL的EP管中(记为1号)，在此EP管中取500uL溶液到另一个EP管中(记为2号)，同时再在2号管中加入500uL蒸馏水，混匀。从2号管中取500uL溶液到3号管中，再在3号管中加入500uL蒸馏水，混匀。如此循环，梯度稀释染料溶液。从而使每个管子对应的亮蓝染料浓度如下：
| 管号 | 12 | 11 | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 |
| 浓度(mg/mL) | 0.00488 | 0.00976 | 0.0195 | 0.0391 | 0.0781 | 0.156 | 0.313 | 0.625 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 |
将各浓度的溶液各取100uL加入到酶标板中，以蒸馏水做空白，在630nm处测定吸光值，结果如下表所示(已减去空白)；
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，根据浓度与吸光度制作的标准吸光曲线如附图3所示，所得标准曲线方程为：Y＝0.0281X，R2＝0.9995；
排泄物溶液使用了5mL蒸馏水，测得吸光度为1.2，根据与标准吸光曲线的对比可知排泄物中染料浓度为0.0281×1.2＝0.03372(mg/ml)。
则排泄物溶液中总的染料含量即为0.03372×5＝0.1686(mg)。
已知食物中染料浓度为10mg/mL，那么培养管中所有果蝇的总采食量即为0.1686÷10＝0.01686(mL)＝16.86(μL)。
一个培养管中共有10只果蝇，平均每只果蝇的采食量即为：16.86÷10＝1.686(uL)；平均每只果蝇每小时的采食量：1.686÷24＝0.07025(uL)。
实施例4
使用如实施例2所述的检测过程，其中待测果蝇为每个培养管中10只，标准吸光曲线的制作包括：
称取39mg带有1wt％染料的第一固体培养基溶于0.2mL的溶剂水中，用研磨棒磨碎，后再加入一定的9.8mL的溶剂，定量至10mL。用过滤头过滤上述液体。将过滤好的溶液加入200uL于酶标板中，从孔中吸取100uL溶液于另一孔，加入100uL溶剂混匀后再吸取100uL到下一孔，再加入100uL溶剂混匀后吸取100uL至下一孔，如此等级稀释6次，最后在第8孔加入100uL溶剂作为空白。同时将待测的排泄物溶液加100uL于酶标板中，在波长630nm处读取吸光值。减去空白吸光度后，标准吸光曲线浓度与对应的吸光值见下表：
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，根据浓度与吸光度制作的标准吸光曲线如附图4标准曲线方程为：Y＝2.6117X，R2＝0.9996。
待测的排泄物溶液使用5mL蒸馏水溶解，在630nm处测定的吸光度为1.21，代入上面的公式，计算得到其浓度为：Y＝2.6177×1.21＝3.167417(mg/mL)。
通过换算得到每只果蝇每天的采食量为：3.167417×5÷10＝1.583709mg。
每小时每只果蝇的采食量为：1.583709÷24＝0.065988mg。
实施例5
在实施例4所示的采食量检测中，使用1wt％PBST溶液作为溶剂制作标准吸光曲线，得到的标准吸光曲线中浓度与对应的吸光值见下表：
标准吸光曲线如附图5所示，标准曲线方程为：Y＝2.5514X，R2＝0.9991。
待测的排泄物溶液使用5mL的1wt％PBST溶液溶解，在630nm处测定的吸光度为1.22。代入上面的公式，计算得到其浓度为Y＝2.5514×1.22＝3.112708(mg/mL)。
通过换算得到每只果蝇每天的采食量为：3.112708×5÷10＝1.556354(mg)。
每小时每只果蝇的采食量为：1.556354÷24＝0.064848(mg)。
通过与实施例4对比可知，使用溶剂水与溶剂1％PBST得到的结果分别为0.065988mg和0.064848mg，结果差异在误差允许范围内，说明两者结果一致，均可在实际检测中使用。
注：根据水的体积与质量之间的换算，1uL＝1mg。
实施例6
采用与实施例1相同结构、但器体302的内径为3.5mm或5.5mm的培养装置对果蝇进行如实施例2所述的方法的培养，对果蝇在不同时间长度内的累积采食量进行了测定，结果发现，随着饲养时间的延长，果蝇的采食量呈正比增加，如附图6所示，说明本方法可以对果蝇长时间内的采食量进行连续、准确的测定。
对比例1
采用与附图1结构相同，但器体302内径为2-23.5mm的多组对比装置。其中器体内径为23.5mm的培养装置，因器体内径与管盖2内径相同，因此以管盖2直接作为器体302，即形成如附图7所示的装置。
采用如实施例2所示的培养过程在多组对比装置中进行相同条件下的果蝇培养，并对每个装置中的果蝇采食量进行测定，得到如附图8所示的管盖内径(即培养基直径)与采食量的统计对比图，从图中可以观察到，培养基直径较小时，实际测得的果蝇采食量高于培养基直径较大测得的采食量，发明人进一步研究发现，这并非因为果蝇在表面积较小的培养基上采食量更多，而是因为培养基的表面积大小会影响果蝇的采食便利性及果蝇排泄物在培养基表面的积累量，即会间接影响果蝇排泄物在培养管管壁上的累计量，导致通过管壁排泄物收集进行采食量计算出现一定偏差。当培养基表面积较小时，积累在培养基表面的排泄物较少，从而分布于管壁上的排泄物就更多，因而可以大幅度提高排泄物的回收率，提高采食量测定的精度。
从多次重复考察中可以发现，如附图8所示，当器体内径为3.5mm时所测得的采食量最高，其与实际采食量最接近，测定精确性最高。
对比例2
通过如下的过程对果蝇采食量进行测定：
(1)预先将果蝇在含亮蓝染料的固体培养基上饲养12小时，使果蝇体内积累的染料达到饱和；
(2)通过以下两个过程对饲养后的果蝇分成两组进行处理：
A.将其中一组果蝇转移到1.5ml的EP管中，加水后用电动匀浆器匀浆，使果蝇体内的亮蓝染料完全释放溶于水中。随后过滤除去杂质，测定溶液的吸光度，从而计算出果蝇体内的染料含量，进而能够反映果蝇体内食物的体积；
B.将另一组果蝇转移至如附图1所示的培养装置中，培养装置中的器体302内径为3.5mm或5.5mm，填充有不含染料的固体培养基，待果蝇在该培养装置中培养3h后，转出果蝇，在培养管中加水溶解排泄物染料，进行吸光度测定。
经过上述处理及测定后，结果显示，直接匀浆果蝇收集到的染料量与带3.5mm或5.5mm培养基的采食量测定管中收集到的排泄物染料量一致。
若进一步增加培养基表面积(即器体302内径)，收集到的染料量会随之降低。结果如附图9所示。
对比例3
使用直径为3.5-23.5mm的混有同位素32P的多组与实施例1相同的培养基对果蝇分别进行相同条件的培养，通过常规的32P同位素标记的方法测定了不同表面积大小培养基上果蝇的采食量，其结果如附图10及附图11所示。其中附图10展示了培养基直径与测得的采食量的对比，可以看出，直径5.5mm的培养基上果蝇的采食量与直径23.5mm培养基上的采食量大致相当，直径3.5mm培养基上果蝇的采食量仅略微低于23.5mm培养基上的采食量，说明降低培养基表面积对果蝇的真实采食量影响并不明显。而在如附图11所示的排泄物中32P含量的测定发现，在使用直径为5.5mm和3.5mm的培养基时，通过排泄物收集到的32P远高于使用直径为23.5mm的培养基，说明使用表面积相对较小的培养基回收排泄物更为高效。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种果蝇采食量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将待测果蝇转移至培养装置内，使用第一固体培养基进行培养；
(2)待所述果蝇完成第一周期培养后，将第一固体培养基更换为第二固体培养基，继续第二周期培养；
(3)将完成第二周期培养的果蝇移出所述培养装置，对培养装置内的果蝇排泄物进行测定，所述测定的过程包括：向所述培养装置内加入溶剂，待果蝇排泄物全部溶解后，测试所得溶液吸光度，并与标准吸光度曲线进行对比，得出溶液中排泄物浓度，计算出采食量；
其中，所述第一固体培养基含有亮蓝染料，第二固体培养基不含染料。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述第一固体培养基含有0.5-1.5wt％的亮蓝染料。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述第一固体培养基和所述第二固体培养基的直径为3-6mm。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述第一 固体培养基和所述第二固体培养基的直径为3.5-5.5mm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述第一周期时长1-48h。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述第一周期时长12-24h。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述第二周期时长为0.5-5h。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述第二周期时长为2.5-3.5h。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述第一周期时长为23-25h，所述第二周期时长为2.5-3.5h。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述溶剂为水或1wt％PBST溶液。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述培养装置包括具有通气孔的、上端开放的培养管，与培养管适配的、具有插入孔的管盖，和至少2个可通过所述插入孔延伸至所述培养管管体内的放置器，所述放置器具有可覆盖或镶嵌于所述插入孔的器盖和可容纳固体培养基的器体，所述器体为下端开放的圆筒状，其内径为3-6mm。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：所述培养管为含有柱状管体的透明部件。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：所述通气孔孔径为0.1-0.5mm。
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| CN103293119A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-09-11 | 淮海工学院 | 一种快速检测食品中的苋菜红和亮蓝含量的方法 |
| CN207948637U (zh) * | 2018-02-08 | 2018-10-12 | 四川农业大学 | 多单元组合式果蝇采食量精确测定的果蝇饲养装置 |
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| Title |
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| 橘小实蝇个体食量测定;杜迎刚 等;《福建农林大学学报（自然科学版）》;20080331;第37卷(第2期);122-126 * |
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