CN103959060A

CN103959060A - 心血管危险事件预测及其用途

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Publication number: CN103959060A
Application number: CN201280058717.0A
Authority: CN
Inventors: R·D·吉尔; S·A·威廉斯; A·A·E·斯图尔特; R·梅勒; T·福尔曼; B·辛格
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Private Placement Protein Body Operation Co ltd
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: CA3074279A1; ES2777002T3; BR112014007214A8; HK1247666A1; AU2013202112B9; BR122019023720A8; BR112014007214B1; US20200166523A1; BR112014007214A2; RU2651708C2; BR122019023720B1; CN114518458A; IN2014CN01970A; CN103959060B; SG10201906900QA; ZA201401778B; IL231387A0; NZ622118A; US20130085079A1; EP2761289A4

Abstract

本公开内容包括用于评估在5年内的心血管(CV)事件危险的生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。在一个方面，本公开内容提供了生物标记，其可以单独或以多种组合使用，以评估在5年内的CV事件危险。在另一个方面，提供了用于评估个体中在5年内的CV事件危险的方法，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少一个生物标记值，其对应于选自表1中提供的生物标记的至少一种生物标记。在进一步方面，提供了用于评估CV危险的方法，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少一个生物标记值，其对应于选自表2中提供的生物标记的至少一种生物标记。在进一步方面，提供了用于评估个体中一般在5年内的CV事件危险的方法，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少一个生物标记值，其对应于选自表3中提供的生物标记的至少一种生物标记。

Description

心血管危险事件预测及其用途

本发明的关联

本申请要求来自于2011年9月30日提交的共同未决的美国申请第61/541,828号的优先权利益，所述美国申请整体引入本文。

技术领域

本申请一般涉及生物标记的检测和评估个体中的未来心血管事件的危险的方法，并且更具体而言，涉及用于就经过5年时期发展心血管(CV)事件危险预测评价个体中的一种或多种生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。此类事件包括但不限于心肌梗塞、中风、充血性心力衰竭或死亡。

背景技术

下述说明书提供了与本申请有关的信息概括，并且并非承认本文提供的信息或参考的出版物中的任何是本申请的现有技术。

心血管疾病是美国的死亡主因。存在原发事件(D’Agostino，R等人，“General Cardiovascular Risk Profile for Use in Primary Care：TheFramingham Heart Study”Circulation117:743-53(2008)；和Ridker，P.等人，“Development and Validation of Improved Algorithms fo rthe Assessment ofGlobal Cardiovascular Risk in Women”JAMA297(6):611-619(2007))和继发事件(Shlipak，M.等人“Biomarkers to Predict Recurrent CardiovascularDisease：The Heart&Soul Study”Am.J.Med.121:50-57(2008))危险的许多现有和重要预测物，所述预测物广泛用于临床实践和治疗试验中。不幸的是，接受者操作特征曲线、危害比和一致性显示现有危险因素和生物标记的性能是适度的(AUC～0.75意指这些因素仅在抛硬币和完全中间)。除改善诊断性能的需要之外，存在个体内对有利(和破坏性)干预和生活方式改变是近期和个人应答的危险产品的需要。常用的Framingham方程具有三个主要问题。首先，它太长时期：它给出10年危险计算，但人不重视未来危险，并且不愿意基于其作出行为和生活方式改变。其次，它对于干预不是非常响应的：它的最重加权的因素是实足年龄，其不能下降。第三，在此处设想的高危群体内，Framingham因素未能充分区分高和低危：高和低四分位数之间的危害比仅为2。

心血管疾病的危险因素广泛用于驱动医学治疗的强度和性质，并且它们的使用已无疑促成在过去二十年内已观察到的心血管发病率和死亡率中的减少。这些因素已常规地组合成算法，但不幸的是，它们不捕获所有危险(心脏病的最常见最初呈现仍是死亡)。事实上，它们可能仅捕获一半危险。～0.76的ROC曲线下面积对于此类危险因素是典型的，并且再次仅为以0.5的抛硬币和以1.0的完全中间。

临床危险评分的新型生物标记的添加已是令人失望的。例如，在3209人中的Framingham研究(Wang等人，“Multiple Biomarkers for the Predictionof First Major Cardiovascular Events and Death”N.Eng.J.Med.355:2631-2637(2006))中，当加入现有危险因素中时，10种生物标记(CRP、BNP、NT-proBNP、醛固酮、肾素、纤维蛋白原、D-二聚体、纤溶酶原激活物抑制剂1型、高半胱氨酸和尿白蛋白与肌酸酐比)未显著改善AUC：事件0-5年的AUC对于年龄、性别和常规危险因素为0.76，并且对于加入混合物中的最佳生物标记组合为0.77。

具有在1-10年窗口内的心血管事件的更高危险患者的早期鉴定是重要的，因为具有升高危险的个体的更积极治疗可以改善结果。因此，最佳管理需要积极干预以减少视为具有更高危险的患者中的心血管事件的危险，而具有心血管事件的更低危险的患者可以是备用的广泛和潜在侵入性治疗，其可能对患者没有有利效应。

用于预测在限定时间段内具有特定疾病状态或状况的危险的生物标记选择涉及首先鉴定用于特定医学应用的标记，所述标记在群体中具有可测量和统计上显著的差异，在所述群体中事件在该时间段过程中已发生或未发生。生物标记可以包括分泌或脱落的分子，其与疾病或状况发展或进展平行，并且响应心血管事件容易地从心血管组织或周围组织和循环细胞扩散到血流内。鉴定的生物标记或生物标记集合一般是临床上验证的，或显示为用于它就其选择的原始预期用途的可靠指示物。生物标记可以包括小分子、肽、蛋白质和核酸。影响生物标记鉴定的关键问题中的一些包括可用数据的过拟合和数据中的偏差。

多种方法已用于鉴定生物标记和诊断或预测具有疾病或状况的危险的尝试中。对于基于蛋白质的标记，这些包括双向电泳、质谱法和免疫测定方法。对于核酸标记，这些包括mRNA表达谱分析、微小RNA谱分析、FISH、基因表达系列分析(SAGE)、大规模基因表达阵列、基因测序和基因分型(SNP或小变体分析)。

双向电泳的效用受限于低检测灵敏度；关于蛋白质溶解度、电荷和疏水性的问题；凝胶再现性；和单个斑点代表多种蛋白质的似然性。对于质谱法，取决于使用的形式，局限性围绕样品加工和分离、对低丰度蛋白质的灵敏度、信噪比考虑、和立即鉴定检测到的蛋白质的无能性。关于生物标记发现的免疫测定方法中的局限性集中于基于抗体的多路测定法测量大量分析物的无能性。可以仅印刷高质量抗体的阵列，并且无需夹心，测量与这些抗体结合的分析物。(这将是使用核酸序列的全基因组通过杂交测量生物体或细胞中的所有DNA或RNA序列的等价形式。杂交实验因为杂交可以是关于同一性的严格测试而起作用。即使非常良好的抗体在选择其结合配偶体以在血液或甚至细胞提取物的背景下起作用也不够严格，因为在这些基质中的蛋白质总体具有非常不同的丰度)。因此，必须使用与生物标记发现的基于免疫测定法的方法不同的方法，将需要使用多路ELISA测定法(即，夹心)以获得足够的严格性来同时测量许多分析物，以决定哪些分析物是真正的生物标记。夹心免疫测定法无法按比例扩大至高含量，并且因此使用严格夹心免疫测定法的生物标记发现使用标准阵列形式是不可能的。最后，抗体试剂具有大量批次可变性和试剂不稳定性的缺点。关于蛋白质生物标记发现的即时平台克服了这个问题。

这些方法中的许多依赖或要求在分析前的一些类型的样品分级。因此，运行足够有力的研究所需的样品制备是非常困难、昂贵和耗时的，所述研究设计为鉴定和发现在一系列明确定义的样品群体中的统计上有关的生物标记。在分级过程中，广泛范围的可变性可以引入多种样品中。例如，潜在标记可以是对于过程不稳定的，标记的浓度可以改变，可以发生不适当的聚集或崩解，并且可以发生非故意的样品污染，并且因此使在早期疾病中预料的微妙变化模糊。

广泛公认使用这些技术的生物标记发现和检测方法具有关于鉴定诊断或预测生物标记的严重局限性。这些局限性包括检测低丰度生物标记的无能性、一致地覆盖蛋白质组的整个动态范围的无能性、样品加工和分级中的不可再现性，以及方法的总体不可再现性和稳固性的缺乏。进一步地，这些研究已将偏差引入数据内，并且无法充分解决样品群体的复杂性，包括在鉴定且验证靶疾病群体内的生物标记所需的分布和随机化方面的适当控制。

尽管旨在发现新型有效生物标记的努力已持续了数十年，但努力在很大程度上是不成功的。关于多种疾病的生物标记通常已在科研实验室中得到鉴定，通常通过在对一些疾病过程进行基础研究时的意外发现。基于发现和少量临床数据，公开了提示新生物标记鉴定的论文。然而，这些提议的生物标记中的大多数仍未证实为真实或有用的生物标记，主要是因为测试的小数目的临床样品仅提供事实上已发现有效生物标记的弱统计证据。即，初始鉴定关于统计学的基本要素是不严格的。在1994年直到2003年中的每一年，科学文献的搜索显示公开了针对生物标记的数千篇参考文献。然而，在该相同时帧过程中，FDA每年批准至多三种新蛋白质生物标记用于诊断用途，并且在几年中，未批准新蛋白质生物标记。

基于失败的生物标记发现努力的历史，已提出进一步促进一般理解的理论：用于诊断、预后或预测发展疾病和状况的危险的生物标记是罕见且难以发现的。基于2D凝胶或质谱法的生物标记研究支持这些概念。非常少的有用的生物标记已通过这些方法加以鉴定。然而，2D凝胶和质谱法测量以大约1nM及更高的浓度存在于血液中的蛋白质，并且这个蛋白质总体很可能最不可能随着疾病或特定状况的发展而改变，这是通常被忽略的。除即时生物标记发现平台外，不存在蛋白质组学生物标记发现平台，其能够精确地测量处于低得多的浓度的蛋白质表达水平。

关于复杂人生物学的生物化学途径了解很多。许多生物化学途径由分泌蛋白质达到顶点或起始，所述分泌蛋白质在病理状态内局部起作用；例如分泌生长因子以刺激病理状态中的其他细胞复制，并且分泌其他因子以避开免疫系统等等。虽然这些分泌蛋白质中的许多以旁分泌形式工作，但一些在机体内远侧操作。具有生物化学途径的基础理解的本领域技术人员将理解许多病理状态特异性蛋白质应当以低于(甚至远低于)2D凝胶和质谱法的检测限的浓度存在于血液中。必须领先于这种相对丰富数目的疾病生物标记鉴定的是蛋白质组学平台，其可以分析其浓度低于可通过2D凝胶或质谱法检测的那些的蛋白质。

如上文讨论的，如果此类事件的倾向可以准确地测定，则心血管事件可以通过积极治疗得到预防。现有多标记测试需要来自个体的多重样品收集或需要样品在多重测定法之间分开。最佳地，改善的测试将仅需要简单的血液、尿或其他样品和单一测定法。相应地，存在关于生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒的需要，其使在5年时期内的心血管事件预测成为可能。

发明内容

本申请包括用于预测在5年时期内具有心血管(CV)事件的危险的生物标记、方法、试剂、装置、系统和试剂盒。本申请的生物标记使用基于SOMA聚体的多路测定法进行鉴定，所述基于SOMA聚体的多路测定法在实施例1和2中详细描述。通过使用本文描述的基于SOMA聚体的生物标记鉴定方法，本申请描述了令人惊讶的大量可用于预测CV事件的CV事件生物标记。用于发现与CV事件的危险相关的生物标记的样品群体来自Heart&Soul研究，检查具有预存CV疾病的群体中的冠状动脉疾病进展的前瞻性队列研究，所述预存CV疾病包括先前的心肌梗塞、在1根或多根冠状血管中大于50％狭窄的证据、通过跑步机的运动诱发的缺血或核测试或先前冠状动脉血运重建术。参加者从San Francisco Bay Area召募。研究群体的CV事件类型和时间显示于表4中。在鉴定这些CV事件生物标记中，从超过900份个别样品中测量超过1000种蛋白质，其中一些处于低飞摩尔范围中的浓度。这比用2D凝胶和/或质谱法完成的生物标记发现实验低约四个数量级。

虽然所述CV事件生物标记中的某些可单独用于预测具有CV事件的危险，但本文描述了用于分组多个CV事件生物标记子集的方法，所述多个CV事件生物标记子集可用作生物标记组。一旦个别生物标记或生物标记子集已得到鉴定，就可以使用任何测定法平台或形式完成个体中的CV事件危险的预测，所述测定法平台或形式能够测量生物样品中的所选一种或多种生物标记水平中的差异。

然而，仅通过使用本文描述的基于SOMA聚体的生物标记鉴定方法能够鉴定本文公开的CV事件标记，在所述鉴定方法中，从先前已诊断为在5年时帧内具有或不具有CV事件的大量个体中个别筛查超过1000个分开的潜在生物标记值。这种发现方法与来自组织样品、条件培养基或裂解细胞的生物标记发现形成鲜明对比，因为它查询不需要转变为人病理状态的更患者相关的系统。此外，这种基于血液的测量形式在临床上明显更适用。

因此，在本申请的一个方面，提供了用于单独或以多种组合使用的一种或多种生物标记，以预测在5年时帧内CV事件出现的危险。示例性实施方案包括如上所述的表1，第7列，“公共名称”中提供的生物标记，其使用如实施例1中一般描述和实施例2中更具体描述的基于SOMA聚体的多路测定法进行鉴定。表1中提供的标记可用于预测在5年时帧内具有CV事件的危险。来自表2和表3的生物标记分别证实来自表1的155种生物标记减少至执行相同任务的更小数目，伴随更少技术复杂性和成本；然而，具有相似功效的其他组合可以由表1汇集。

虽然所述CV事件危险生物标记中的某些可单独用于预测在5年时帧内CV事件的危险，但本文还描述了用于分组多个CV事件危险生物标记子集的方法，所述多个CV事件危险生物标记子集各自可用作两种或更多种生物标记的组。因此，本申请的多个实施方案提供了包含N种生物标记的组合，其中N是至少两种生物标记。在其他实施方案中，N选择为来自2-155种生物标记的任何数目。

在另外其他实施方案中，N选择为来自2-7、2-10、2-15、2-20、2-25、2-30、2-35、2-40、2-45、2-50、2-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括2-155。在其他实施方案中，N选择为来自3-7、3-10、3-15、3-20、3-25、3-30、3-35、3-40、3-45、3-50、3-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括3-155。在其他实施方案中，N选择为来自4-7、4-10、4-15、4-20、4-25、4-30、4-35、4-40、4-45、4-50、4-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括4-155。在其他实施方案中，N选择为来自5-7、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括5-155。在其他实施方案中，N选择为来自6-10、6-15、6-20、6-25、6-30、6-35、6-40、6-45、6-50、6-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括6-155。在其他实施方案中，N选择为来自7-10、7-15、7-20、7-25、7-30、7-35、7-40、7-45、7-50、7-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括7-155。在其他实施方案中，N选择为来自8-10、8-15、8-20、8-25、8-30、8-35、8-40、8-45、8-50、8-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括8-155。在其他实施方案中，N选择为来自9-15、9-20、9-25、9-30、9-35、9-40、9-45、9-50、9-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括9-155。在其他实施方案中，N选择为来自10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55的任何数目，或关于该范围上限的连续增量5，直到且包括10-155。应当理解N可以选择为包含类似或更高级别的范围。

如上文讨论的，如果此类事件的倾向可以准确地测定，则心血管事件可以通过积极治疗得到避免。现有技术多标记测试需要来自个体的多重样品收集或需要样品在多重测定法之间分开。提供仅需要在单一测定法中测量的单一生物样品，而不是不同分析物类型(脂质、蛋白质、代谢产物)或分析物组的多重样品的预后测定法将是优选的。对单一样品测试的中心利益是在使用方面的简单性，因为具有多重样品收集的测试对于施用是更复杂的，并且这形成采用的障碍。另外的优点衍生自对于多重蛋白质在单一测定法中运行单一样品。由于一起校准多重测定法结果，单一测定法应减轻不需要的变化。形成本申请基础的测试是此类“单一样品、单一测定法”测试。这种单一样品和单一测定法的组合是这种心血管事件危险测试的新型特征，其解决收集多重样品的逻辑复杂性，以及将样品分成多个等分试样用于多重独立分析程序中涉及的问题和生物危害。

心血管疾病已知涉及多重生物过程和组织。与心血管疾病相关的生物系统和过程的众所周知例子是炎症、血栓形成、疾病相关血管生成、血小板活化、巨噬细胞活化、肝急性应答、细胞外基质重塑和肾功能。这些过程可以根据性别、绝经状态和年龄，以及根据凝固状态和血管功能进行观察。因为这些系统部分通过基于蛋白质的发信号系统通讯，并且多重蛋白质可以在单一血样中进行测量，所以本发明提供了集中于来自涉及心血管疾病的特定生物系统和过程的蛋白质的单一样品、单一测定法基于多重蛋白质的测试。

如本文讨论的，测量心血管事件的危险的中心功能之一是使得能够评价响应治疗和行为改变例如饮食和运动的过程。目前危险预测方法例如Framingham方程，包括明确关联的临床协变量分析，最大的此类因素是对象的年龄。这使得Framingham方程对于监控个体危险中的改变用处不大，尽管它对于群体可以是准确的。该CV事件危险测试的新型特点在于它不需要年龄作为预后模型的部分。本发明基于下述前提：在老化生物学内，存在可变且因此更好地用于评价危险的偶然因素。本发明基于下述信念：年龄自身不是疾病中的偶然因素，并且年龄充当潜在生物学的替代物或代理物。虽然年龄事实上是CV事件的预后，但它不能用于评价个别改善，并且可能年龄的效应通过生物功能介导。这种效应可以通过测量有关生物学进行测定。在本发明中，靶向的蛋白质涉及疾病的生物学。因此，本发明捕获以年龄和CV事件的危险之间关联反映的生物信息。事实上，将年龄因素加入我们基于蛋白质的危险模型中不改善预测事件中的表现。

鉴定来自涉及心血管疾病的多重过程的蛋白质的策略需要选择这样的参数，所述参数提供呈现多种事件或症状的广泛范围/多样的CV疾病患者。由于心血管疾病的事件是异质的，涉及两类主要事件：血栓形成和CHF相关事件。一些呈现事件可能缺乏特定诊断信息(例如死在家中)。考虑到这些CV疾病特征，本发明测试通过对来自广泛范围事件的血样测量涉及与CV疾病相关的生物过程的蛋白质得到开发。该策略导致来自涉及疾病的多重过程的信息的包括(例如血管生成、血小板活化、巨噬细胞活化、肝急性应答、其他淋巴细胞炎症、细胞外基质重塑和肾功能)。为了开发用于CV疾病的基于多重蛋白质的预后单一样品测试，所选研究群体是来自“Heart&Soul”研究的高危对象组。通过选择具有高比率CV事件的这个对象集合，能够比在一般群体(在其内事件是罕见的)中已可能的更准确地测定与蛋白质测量相关的危险。关于该高危组的主题测试开发允许鉴定由于普通生物学可以一般化的蛋白质生物标记组合。因此，本发明测试和生物标记很可能有效超出比匹配“Heart&Soul”研究的入围标准的那些个体更大的群体中的事件预测。

如上所述，CV疾病涉及血液凝固系统、炎性白血细胞和血小板活化。由于样品制备中导致血小板和白血细胞仅部分从血浆样品向下旋转的普通错误，来自这些系统在体内活化的信号可以是模糊的。如果这些细胞并未完全向下旋转，则它们可以在样品运送且测定时通过冻融进行裂解。在主题生物标记的鉴定过程期间，显而易见的是在至少一些情况下，照常规制备的样品在冻融后含有全细胞和血小板。在后续蛋白质组学测定法过程中，任何全细胞均将裂解且干扰血小板和单核细胞的体内活化疾病过程特有的蛋白质。因此，在本发明的一个实施方案中，在测定法之前进行在解冻后再旋转样品的另外步骤。该另外旋转步骤可以去除血小板和单核细胞，其否则将阻止鉴定与血小板和单核细胞活化相关的生物标记。去除样品的不溶性和细胞组分的另外步骤(通过旋转或过滤)，代表被认为在现有技术中未描述的心血管事件危险测试的进步。

虽然存在来自参考文献的特定蛋白质，所述蛋白质已知对于CV事件是预后的，例如载脂蛋白B、载脂蛋白A-1、BNP和CRP，并且具有与CV疾病的已知关联，但仍不明确的是由于由多重蛋白质测量代表的常见生物信息，可以组合蛋白质测量的特定集合，以在预测性能方面最佳进行。在CV疾病过程中观察到改变的蛋白质组合如何无法提供最佳预测性能的具体例子涉及在尿中排泄的许多小血清蛋白质，其如通过肾小球滤过率(GFR)测量的与肾功能相关。如由低GFR指示的，弱肾功能与心血管危险有关。因此，与低GFR相关的许多小蛋白质看起来与CV疾病有关，但并非独立地。在主题测试的开发过程中，作出针对估计GFR的蛋白质测量的校准，以便测定哪些蛋白质提供超出GFR的另外预后价值。

GFR的测量在预测CV事件的危险中是明确有用的。然而，GFR的临床测量涉及经过24小时的尿收集，其不满足“单一样品、单一测定法”测试的主题标准。其他GFR估计值较不繁琐；然而，为了满足“单一样品”预后测试的目标，本发明潜在的策略寻求使用蛋白质测量自身提供GFR信息用于危险分析。例如，在表3的十标记模型中，由于其与GFR的关联，蛋白质ESAM强烈预测CV事件危险。在校准蛋白质ESAM的测量以去除与估计GFR的关联后，ESAM不再预测危险。在“单一样品、单一测定法”中传递与GFR有关的生物信号的蛋白质例如ESAM这种用途代表用于CV事件预后的新型进展。

表3生物标记的鉴定涉及可以一起在CV事件预后中工作的蛋白质的选择。研究例如Wang，T.等人，(2006)N.Eng.J.Med.355:2631-9已显示生物标记组合通常未能提供超过简单危险计算的另外性能，所述简单危险计算使用普通临床信息例如年龄和脂质水平。为了避免生物标记的专门组合，本发明提供了统计分析程序，其中就其个别预后力量以及关键的蛋白质一起协同工作以改善组合的预后价值的能力两者筛查蛋白质。多重独立生物过程在本文提供的表3十标记蛋白质模型中表示。

在一个实施方案中，本发明包含用于评估群体中的5年时间段内的未来心血管(CV)事件危险的方法。该方法包括在来自群体个体的生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一，其中个体的CV事件危险基于生物标记值进行评估，并且其中N＝2-155。在另一个实施方案中，生物标记选自表2和N＝2-46。在另一个实施方案中，生物标记选自表3和N＝2-10。

在一个实施方案中，群体选择是这样的，从而使得群体表征为不具有心血管疾病的既往史。在可替代方案中，群体可以这样选择，从而使得它表征为具有心血管疾病的既往史。

既往史可以包含先前心肌梗塞、在1根或多根冠状血管中大于50％狭窄的证据、通过跑步机的运动诱发的缺血或核测试或先前冠状动脉血运重建术。

进一步地，群体可以这样选择，从而使得它的特征在于遗传危险因素，包含突变、单核苷酸多态性和插入/缺失。此类遗传危险因素可以用于补足危险评估。

CV事件危险的评估可以在动态范围上进行测量，所述动态范围响应在一段时间内响应干预的改变，所述干预包含治疗剂、营养程序、补充物、生活方式改变、戒烟程序和疾病管理方案。

与经过5年时期的CV事件危险评估有关的前述方法可以基于其生物标记值，用于将个体分配到增加或减少疾病管理程序内。取决于所述生物标记值，该方法还可以用于将个体分层为与健康保险范围有关的不同危险带。另外，取决于生物标记值，它可以用于评估CV事件危险，以便将个体分层为与健康保险范围有关的不同危险带。另外，取决于生物标记值，它可以用于就伙伴关系(partnership)评价潜在候选物。

进一步地，用于CV事件危险预测的前述方法可以用于：基于生物标记值，预测群体的医学资源消耗；使用个体的生物标记值作为CV治疗剂的临床试验的入围标准；基于所述生物标记值，预测临床试验结果的功效；使用生物标记值用于CV治疗剂或任何治疗试剂的心血管安全监督；使用生物标记值作为CV治疗剂功效的替代终点；和/或基于生物标记值，监控对任何干预、饮食或治疗方案的顺应性。关于CV治疗剂或任何治疗试剂的CV安全监督，此类监督在用于CV治疗剂和几乎每一种长期使用的非心血管药物的大型、费用大的需要3期CV安全研究中是重要的。

用于评估CV事件危险的主题方法还可以用于基于所述生物标记值选择或提交用于其他诊断程序的个体。另外，主题方法可以用于基于生物标记值选择CV治疗剂。

在用于评估CV事件危险的主题方法中，生物标记值可以通过进行体外测定法进行检测。体外测定法可以涉及对应于生物标记各自的至少一种捕获试剂，并且进一步可以包括来自SOMA聚体、抗体和核酸探针的至少一种捕获试剂。在优选实施方案中，捕获试剂是SOMA聚体。

在另一个实施方案中，体外测定法可以选自免疫测定法、基于SOMA聚体的测定法、组织学或细胞学测定法、和mRNA表达水平测定法。

在主题方法中，生物样品可以是全血、血浆、血清、尿等等。在优选实施方案中，生物样品是血清、血浆或尿。

另外，它提供了在主题方法中个体可以是哺乳动物，且特别是人。

在主题方法的可替代实施方案中，N＝3–10；N＝3–15；N＝2–10；N＝4–10；或N＝5–10。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于评估心血管(CV)事件危险的计算机执行方法。该方法可以包括：在计算机上检索关于个体的生物标记信息，其中该生物标记信息包含各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值；用计算机进行生物标记值各自的分类；并且基于多个分类指示所述个体的CV事件危险评估的结果，并且其中N＝2-155。在该方法的可替代实施方案中，生物标记可以选自表2(其中N＝2-46)或表3(其中N＝2-10)。

个体的CV事件危险评估的结果可以在计算机显示器上展示。

在另一个实施方案中，本发明包含用于评估CV事件危险的计算机程序产品。该计算机程序产品可以包括收录可由计算装置或系统的处理器执行的程序代码的计算机可读介质，其中该程序代码包含：检索归于来自个体的生物样品的数据的代码，其中该数据包含各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值，其中该生物标记在生物样品中检测到；和执行分类方法的代码，所述分类方法根据所述生物标记值指示个体的CV事件危险评估的结果。当生物标记选自表1，第7列时，N＝2–155。在其他实施方案中，生物标记可以选自表2(其中N＝2-46)或表3(其中N＝2-10)。

分类方法可以使用连续评分或测量或危险度量。分类方法还可以使用两个或更多个类别。

本发明进一步包含用于就CV事件危险评估筛查个体的方法。该方法包括在来自个体的生物样品中检测各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值，其中个体基于所述生物标记值就CV事件的危险进行评估，并且其中N＝2–155。在其他实施方案中，生物标记可以分别选自表2(其中N＝2-46)或表3(其中N＝2-10)。

在主题方法中，生物标记值的检测可以在体外测定法中完成。此类体外测定法可以包括对应于生物标记各自的至少一种捕获试剂，并且进一步可以包括从SOMA聚体、抗体和核酸探针中选择至少一种捕获试剂。优选地，至少一种捕获试剂是SOMA聚体。体外测定法可以选自免疫测定法、基于SOMA聚体的测定法、组织学或细胞学测定法、和mRNA表达水平测定法。

生物样品可以选自全血、血浆、血清、尿等等。优选地，生物样品是血清、血浆或尿。在主题方法中，个体可以是哺乳动物，且优选是人。

在本发明的实施方案之一中，提供了基于所述生物标记值和对应于所述个体的至少一项另外的生物医学信息，就CV事件危险评估个体。至少一项另外的生物医学信息可以包括但不限于下述中的任何：(a)对应于心血管危险因素存在的信息，包括先前的心肌梗塞、在1根或多根冠状血管中大于50％狭窄的证据、通过跑步机的运动诱发的缺血或核测试或先前冠状动脉血运重建术中的一种或多种；(b)对应于所述个体的物理描述词的信息；(c)对应于所述个体的重量中的改变的信息；(d)对应于所述个体的种族性的信息；(e)对应于所述个体的性别的信息；(f)对应于所述个体的吸烟史的信息；(g)对应于所述个体的饮酒史的信息；(h)对应于所述个体的职业史的信息；(i)对应于所述个体的心血管疾病或其他循环系统状况的家族史的信息；(j)对应于所述个体中至少一种遗传标记的存在或不存在的信息，所述遗传标记与所述个体或所述个体的家族成员中的心血管疾病的更高危险关联；(k)对应于所述个体的临床症状的信息；(l)对应于其他实验室测试的信息；(m)对应于所述个体的基因表达值的信息，(n)对应于所述个体的已知心血管危险因素例如高饱和脂肪、高盐的饮食消费的信息；(o)对应于所述个体的成像研究的信息，包括心电图、超声心动图、内膜-中膜厚度的颈动脉超声、流量介导的舒张、脉搏波速度、踝-臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、通过CT的冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影术、MRI成像及其他成像模式；和(p)关于用药的信息。

本发明进一步包含用于评估在五年时间段内的未来CV事件危险的生物标记组，其中该组包含选自表1的生物标记的N种生物标记，其中N＝2–155。在可替代实施方案中，生物标记选自表2，其中N＝2-46，或选自表3，其中N＝2-10。

在另一个方面，本发明包含通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险，用于筛查群体中的个体的方法，通过在来自个体的生物样品中检测血管生成素2的生物标记值，并且基于血管生成素生物标记值测定未来CV事件的危险。生物标记值可以表示为测量评分或进入多个分类之一内的分类。

在使用血管生成素2的筛查方法的变化中，本发明还包含在测定步骤前向方法中添加包括提供关于个体的他汀使用的信息的步骤。因此，未来CV事件危险的测定基于血管生成素2生物标记值和他汀信息。

血管生成素2令人惊讶地可用于关于他汀预后个体的次级心血管事件。他汀在现有技术中报道不仅减少次级心血管事件的危险，还引起血管生成素2中的增加。这种血管生成素2中的增加将预期否定其作为生物标记的用途。出乎意料地，血管生成素2已证实它是用于预测高危个体中的次级心血管事件的良好标记。

检测血管生成素2生物标记值的方法可以包括下述进一步步骤：在生物样品中检测MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT生物标记中的一种或多种或其组合的生物标记值。该方法可以另外涉及在生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表3的生物标记的N种生物标记，其中N＝2-10。

在另一个方面，本发明提供了通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险，用于筛查群体中的个体的生物标记组。该组包括至少血管生成素2生物标记。这个组可以进一步包括MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT生物标记中的一种或多种或其任何组合。另外，该组可以包括选自本发明3的一种或多种生物标记，其中N＝2-10。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过评估在5年时期内的未来CV事件危险筛查个体的方法，其中评估包括血管生成事件或充血性心力衰竭(CHF)事件的区别预后。该方法包括：在来自群体个体的生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于用于血栓形成事件预后的GPVI生物标记和用于CHF事件预后的MATN2生物标记。该方法可以涉及在生物样品中检测关于N种生物标记的生物标记值的进一步步骤，所述N种生物标记选自表3中阐述的生物标记，其中N＝3-10。血栓形成事件可以包括心肌梗塞(MI)、短暂性脑缺血发作(TIA)、中风、急性冠脉综合征和需要冠状动脉重建术中的任何。

进一步提供的是通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险用于筛查群体中的个体的生物标记组，其中该组包含GPVI生物标记和MATN2生物标记。该组可以另外包括选自表3中阐述的生物标记的N种生物标记中的至少一种。

用于CV疾病的多个治疗类别是可获得的，反映涉及的生物系统的多样性。例如，抗血栓形成、血小板抑制剂、脂质代谢、电解质和液体平衡用药和β阻滞剂已用于治疗CV疾病。为了指导治疗，不仅鉴定总体危险，还区分由生物学指示的事件类别是有用的。使用MATN2和GPVI的前述方法允许区分血栓形成事件和CHF事件的可能事件类别。GPVI对于血栓形成事件的发展更特异性，并且MATN2对于CHF事件更特异性。GPVI对于血栓形成事件的特异性在图8A和8B中得到证实。MATN2对于CHF预后的特异性在图9A和9B中得到证实。这些差异可以按照有关生物过程加以解释。这种基于多重蛋白质的测试因此可以给患者提供区分发展CHF的危险相对于血栓形成事件危险的信息。这是本发明的显著和重要的特点，其被认为在现有技术中未得到描述。

除基于单独的蛋白质测量提供CV事件预后之外，主题方法还提供了衍生自考虑到单一信息的更完全了解，所述单一信息例如性别、用药、其他标记例如LDL胆固醇、HDL胆固醇、总胆固醇及其他状况例如糖尿病。此类模型可以基于此处引入的现有表3十蛋白质模型进行构建。

本文进一步提供的是通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险，用于筛查群体中的个体的试剂盒。该试剂盒包括下述组分：表1中阐述的生物标记中的至少一种；至少一种相应的捕获试剂，其中相应捕获试剂各自对于所选生物标记是特异性的；和信号生成材料，所述材料对于所选相应生物标记和/或相应捕获试剂是特异性的，其中每种信号在每种捕获试剂与相应生物标记结合后活化。

在另一个方面，试剂盒可以包含选自下述的一种或多种生物标记：血管生成素2生物标记；血管生成素2生物标记和选自下述的任何生物标记：MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT及其任何组合；选自GPVI生物标记、MATN2生物标记及其任何组合的生物标记；选自表3中阐述的生物标记的N种生物标记，其中N＝2-10；及其任何组合。

试剂盒的捕获试剂可以是SOMA聚体、抗体和核酸探针中的任何一种或多种或其组合。试剂盒还可以包括说明书或者一种或多种软件或计算机程序产品，用于将由其获得生物样品的个体分类为具有或不具有增加的CV事件危险。

在另一个实施方案中，本发明包括包含表1，第7列，表2或表3的生物标记的分类器。

附图说明

图1A是用于预测生物样品中的CV事件的示例性方法的流程图。图1B是使用朴素贝叶斯分类方法，用于预测生物样品中的CV事件的示例性方法的流程图。

图2A显示用于在6个月内具有事件的病例和不具有CV事件的对照亚组的主成分分析。具有事件的病例沿垂直轴与对照部分分开。

图2B显示用于在6个月内具有事件的病例和不具有CV事件的对照亚组的DSGA分析。具有事件的病例沿水平轴与对照部分分开。

图3提供用于研究群体的危险评分分析。该评分通过使用表3中的十种蛋白质测量的对数，构建简单Cox比例风险模型进行计算。基于该评分，将群体分成五分位数。图3中的卡普兰迈耶曲线证实这些五分位数如何区分经历心血管事件或不同事件类型的死亡的个体比例。

图3A显示研究群体的所有死亡和心血管事件的卡普兰迈耶曲线，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图3B显示CV事件病例的卡普兰迈耶曲线：未分类的死亡、无已知直接原因例如MI或CHF(充血性心力衰竭)的死亡，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图3C显示CV事件病例的卡普兰迈耶曲线：偶发CHF，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图3D显示CV事件病例的卡普兰迈耶曲线：慢性CHF患者(具有以往CHF诊断的患者)的CHF复发，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图3E显示CV事件病例的卡普兰迈耶曲线：血栓形成事件(MI+中风)，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图3F显示CV事件病例的卡普兰迈耶曲线：所有CHF，其中群体基于表3蛋白质评分分成五分位数。

图4举例说明用于与本文描述的多种计算机执行方法一起使用的示例性计算机系统。

图5是依照一个实施方案，关于指示CV事件危险评估的方法的流程图。

图6是依照一个实施方案，关于评估CV事件危险的方法的流程图。

图7举例说明可以用于检测生物样品中的一种或多种CV事件生物标记的示例性适体测定法。

图8显示基于表3中的十种蛋白质之一GPVI的卡普兰迈耶曲线，证实该蛋白质区分血栓形成和CHF事件。将群体分成GPVI的四分位数。图8A显示最高GPVI四分位数对于血栓形成心血管事件是预后的。图8B显示GPVI的四分位数对预报CHF事件具有很少或无区分能力。

图9显示基于表3中的十种蛋白质之一MATN2的卡普兰迈耶曲线，证实该蛋白质区分血栓形成和CHF事件。将群体分成MATN2的四分位数。图9A显示MATN2四分位数对于血栓形成心血管事件不是预后的。图9B显示来自最高MATN2四分位数的个体具有更高比率的CHF事件。

图10显示采取他汀用药的所有538个对象的卡普兰迈耶曲线，显示与不在血管生成素2的第4个四分位数中的对象相比较，在血管生成素2的群体分布的第4个四分位数中的个体以增加的比率患有心血管事件。因此，尽管用他汀治疗的效应，血管生成素2是CV事件危险的有用生物标记。

图11显示采取他汀用药的所有538个对象的卡普兰迈耶曲线，显示CHRDL1与用他汀治疗的个体中的心血管事件的无事件存活相关。因此，尽管用他汀治疗的效应，CHRDL1是CV事件危险的有用生物标记。

具体实施方式

现在详细参考本发明的代表性实施方案。虽然本发明与例举的实施方案结合描述，但应当理解本发明并不预期限制于这些实施方案。相反，本发明预期涵盖所有替代方案、修饰和等价物，其可以包括在如由权利要求定义的本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到与本文描述的那些相似或等价的许多方法和材料，其可以用于本发明的实践中并且在本发明实践的范围内。本发明决不限于所述方法和材料。

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管现在描述了优选方法、装置和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实践或测试中。

本申请中引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请指示本申请所属一个或多个领域的技术水平。本文引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请在此引入作为参考，其程度与每个个别出版物、公开专利文件或专利申请特别并个别指出引入作为参考相同。

如本申请包括所附权利要求中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，并且可与“至少一个/种”和“一个或多个/一种或多种”互换使用。因此，提及“SOMA聚体”包括SOMA聚体混合物，提及“探针”包括探针混合物等等。

如本文使用的，术语“约”代表无关紧要的数值修饰或变化，从而使得数值与其有关的项目的基本功能未改变。

如本文使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化，预期涵盖非排他性包括，从而使得包含、包括或含有元件或元件列表的过程、方法、过程限定的产物(product-by-process)或物质组合物不包括仅这些元件，而是可以包括未明确列出或者此类过程、方法、过程产物或物质组合物固有的其他元件。

本申请包括用于预测在限定时间段例如5年内的CV事件危险的生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

“心血管事件”意指循环系统的任何部分的失败或功能失常。在一个实施方案中，“心血管事件”意指中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、心肌梗塞(MI)、可归于循环系统的功能失常的猝死和/或心力衰竭。在另一个实施方案中，“心血管事件”意指前述功能失常和/或不稳定型心绞痛、需要支架或血管成形术等等中的任何。

心血管事件包括“充血性心力衰竭”或“CHF”和“血栓形成事件”。血栓形成事件包括MI、短暂性脑缺血发作(TIA)、中风、急性冠脉综合征和需要冠状动脉血运重建术。

在一个方面，提供了用于单独或以多种组合使用的一种或多种生物标记，以评估在5年时间段内的未来CV事件危险，其中CV事件定义为心肌梗塞、中风、死亡和充血性心力衰竭。血栓形成事件(图3e)由组合的心肌梗塞和中风组成。如下文详细描述的，示例性实施方案包括表1，第7列中提供的生物标记，其使用实施例1中一般描述和实施例2中更具体描述的基于SOMA聚体的多路测定法进行鉴定。

表1，第7列阐述得自分析数百份在初始抽血(时间点1)后的来自患者(所述患者具有在6个月–10年时帧内的CV事件(事件阳性))的个体血样，以及数百份来自在该时帧内不具有CV事件(事件阴性)的个体对照血样的发现。潜在生物标记在个别样品而不是合并的事件阳性和事件阴性血样中进行测量；这允许与CV事件的存在和不存在相关的表型中的个体和组变异的更佳理解。因为对每份样品进行超过1000次蛋白质测量，并且个别测量来自事件阳性和事件阴性群体各自的数百份样品，所以表1，第7列中报告的生物标记起因于罕见的大型数据集的分析。测量使用本文部分“生物标记的分类和危险评分的计算”中所述的方法进行分析。表1，第7列列出了在抽取血样后，发现可用于根据其在0-5年时期内显示出未来CV事件的倾向来分层个体群体的155种生物标记。图3A-3F中的卡普兰-迈耶曲线显示在通过此类生物标记的小子集测定的评分五分后，事件危险的强依赖性，如表3中列出的。

虽然所述CV事件生物标记中的某些可单独用于评估CV事件的危险，但本文还描述了用于分组多个CV事件生物标记子集的方法，其中每个分组或子集选择可用作三种或更多种生物标记的组，在本文中可互换地被称为“生物标记组”和“组”。因此，本申请的多个实施方案提供了包含N种生物标记的组合，其中N是至少两种生物标记。在其他实施方案中，N选自2-155种生物标记。

在一个实施方案中，可用于生物标记子集或组的生物标记数目基于关于生物标记值的特定组合的灵敏度和特异性值。术语“灵敏度”和“特异性”在本文中关于基于在其生物样品中检测到的一个或多个生物标记值，将个体正确分类为在5年内具有CV事件危险增加或不具有在相同时间段内具有CV事件危险增加的能力使用。“灵敏度”指示一种或多种生物标记关于正确分类具有CV事件危险增加的个体的性能。“特异性”指示一种或多种生物标记关于正确分类不具有CV事件危险增加的个体的性能。例如，关于用于测试事件阴性样品和事件阳性样品集合的标记组的85％特异性和90％灵敏度指示：85％的对照样品由组正确分类为事件阴性样品，并且90％事件阳性样品由组正确分类为事件阳性样品。

在可替代方法中，评分可以在连续范围上得到报道，具有高、中或低危CV事件的阈值，其中阈值基于临床发现进行测定。

本文鉴定的CV事件危险生物标记代表非常大量的关于生物标记子集或组的选择，所述生物标记可以用于预测CV事件的危险。此类生物标记的所需数目的选择依赖所选生物标记的具体组合。重要的是记住用于预测CV事件危险的生物标记组还可以包括在表1，第7列中未发现的生物标记，并且在表1，第7列中未发现的另外生物标记的包括可以减少在选自表1，第7列的特定子集或组中的生物标记数目。如果另外的生物医学信息与生物标记值结合使用，以确定关于给定测定法的可接受的阈值，则还可以减少在子集或组中使用的来自表1，第7列的生物标记数目。

可以影响待用于生物标记子集或组中的生物标记数目的另一种因素是用于从个体中获得生物样品的程序，所述个体待就CV事件的危险进行评价。在小心控制的样品获得环境中，满足所需灵敏度和特异性值和/或阈值必需的生物标记数目将低于其中在样品收集、处理和贮存中可以存在更多变化的情况。在发现表1中阐述的生物标记列表中，多个样品收集场所用于收集数据用于分类器训练。这提供了对样品收集、处理和贮存中的变化更不敏感的更强大的生物标记，但如果训练数据均在非常相似的条件下获得，则还可以要求子集或组中的生物标记数目更大。

本申请的一个方面一般可以关于图1A和1B进行描述。生物样品得自一个或多个目的个体。随后测定生物样品，以检测一种或多种(N)目的生物标记的存在，并且测定关于所述N种生物标记(图1B中被称为标记RFU)各自的生物标记值。一旦已检测到生物标记并指定生物标记值，就如本文详细描述的对每种标记进行评分或分类。随后合并标记评分，以提供总诊断评分，其指示样品由其获得的个体具有高、中或低危CV事件，特别当在连续范围上报告时。

“生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文中可互换使用，以指得自或另外衍生自个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆和血清)、干血点(例如得自婴儿)、痰、泪、粘液、鼻洗涤物、鼻抽吸物、呼吸物(breath)、尿、精液、唾液、腹膜洗涤物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、胸膜液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物和脑脊髓液。这还包括实验上分离的前述全部的级分。例如，血样可以分级成血清、血浆或含有特定类型血细胞例如红血细胞或白血细胞(白细胞)的级分。需要时，样品可以是来自个体的样品组合，例如组织和流体样品的组合。术语“生物样品”还包括例如含有匀浆化固体材料的材料，例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查。术语“生物样品”还包括衍生自组织培养或细胞培养的材料。可以采用用于获得生物样品的任何合适方法；示例性方法包括例如放血、拭子(例如颊拭子)和细针抽吸活组织检查程序。对细针抽吸敏感的示例性组织包括淋巴结、肺、肺洗涤物、BAL(支气管肺泡灌洗液)、甲状腺、乳房、胰腺和肝。还可以例如通过显微解剖(例如激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱洗涤、涂片(例如PAP涂片)或导管灌洗收集样品。得自或衍生自个体的“生物样品”包括任何此类样品，其已在得自个体后以任何合适方式进行加工。

进一步地，应认识到生物样品可以通过从许多个体获得生物样品且合并其或合并每个个体的生物样品的等分试样而获得。合并样品可以作为来自单个个体的样品进行处理，并且如果在合并样品中确定CV事件的危险增加或降低，则可以再测试每份个体生物样品，以测定哪个或哪些个体具有CV事件的危险增加或降低。

如上所述，生物样品可以是尿。尿样品提供超过血样或血清样品的某些优点。通过静脉穿刺收集血样或血浆样品比希望的更复杂，可以递送可变体积，对于患者可以是麻烦的，并且涉及一些(小)感染危险。另外，静脉切开术需要技术人员。收集尿样品的简单性可以导致主题方法的更广泛应用。

为了测定使用尿作为样品的适合性，来自健康对象的此类样品就每种蛋白质的质与量进行评价，并且该信息与CV危险预后中的表1-3生物标记的质量组合。因为尿是血浆的超滤液，所以尿中排泄的特定蛋白质的数量与血液中的蛋白质浓度成比例。如果表1-3中任一个的质量生物标记在尿中可以足够数量获得，则它们适合于用于就CV事件危险评估筛查个体的方法中。已在尿中发现的预测CV事件的生物标记包括显示强信号的ESAM、MMP7和GP6。这些生物标记很小，并且通过肾自由过滤到尿内。另外，PSA-ACT和纤溶酶原已发现证实在尿中的个体间可变性。这指示尿中的这些生物标记的定量也可以用于就CV事件危险筛查个体的方法中。因此，这五种蛋白质提供了简单的基于尿的测试，以用于就CV事件危险筛查个体的主题方法中。

为了本说明书的目的，短语“归于来自个体的生物样品的数据”意指以一些形式的数据衍生自个体的生物样品或使用个体的生物样品生成。数据可以例如通过从一个测量系统中的单位转变为另一个测量系统中的单位，在已生成后在一定程度上再格式化、修正或数学上改变；但是，数据应理解为已衍生自生物样品或使用生物样品生成。

“靶”、“靶分子”和“分析物”在本文中可互换使用，以指可以存在于生物样品中的任何目的分子。“目的分子”包括特定分子的任何较小变化，例如在蛋白质的情况下，例如在氨基酸序列、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰例如与标记组分缀合中的较小变化，所述标记组分基本上不改变分子的特性。“靶分子”、“靶”或“分析物”是一类分子或多分子结构的拷贝或者分子或多分子结构种类的集合。“靶分子”、“靶”和“分析物”指超过一个此类分子集合。示例性靶分子包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、亲和体、抗体模拟物、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢产物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养素、生长因子、细胞、组织和前述任何的任何片段或部分。

如本文使用的，“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸间断。该术语还包含已天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。在该定义内还包括的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以是单链或相关链。在该定义内还包括的是前蛋白和完整的成熟蛋白质；衍生自成熟蛋白质的肽或多肽；蛋白质的片段；剪接变体；重组形式的蛋白质；具有氨基酸修饰、缺失或置换的蛋白质变体；循环产物；和翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。

如本文使用的，“标记”和“生物标记”可互换使用，以指这样的靶分子，其指示个体中的正常或异常过程或者个体中的疾病或其他状况，或是个体中的正常或异常过程或者个体中的疾病或其他状况的征兆。更具体而言，“标记”或“生物标记”是与特定生理学状态或过程的存在相关的解剖学、生理学、生物化学或分子参数，无论是正常的还是异常的，并且如果是异常的，则无论是慢性还是急性的。生物标记是可通过多种方法包括实验室测定法和医学成像检测和测量的。当生物标记是蛋白质时，还能够使用相应基因的表达作为生物样品中的相应蛋白质生物标记、或编码生物标记的基因的甲基化状态或控制生物标记表达的蛋白质的量或存在或不存在的替代量度。

如本文使用的，“生物标记值”、“值”、“生物标记水平”和“水平”可互换使用，以指这样的测量，其使用用于检测生物样品中的生物标记的任何分析方法作出，并且指示生物样品中的生物标记、关于生物样品中的生物标记或对应于生物样品中的生物标记的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平的比例等等。“值”或“水平”的确切性质取决于用于检测生物标记的特定分析方法的具体设计和组分。

当生物标记指示个体中的异常过程或疾病或其他状况，或者是个体中的异常过程或疾病或其他状况的征兆时，生物标记一般描述为与生物标记(其指示个体中的正常过程或者疾病或其他状况的不存在，或者是个体中的正常过程或者疾病或其他状况的不存在的征兆)的表达水平或值相比较是过表达或表达不足的。“上调”、“上调的”、“过表达”、“过表达的”及其任何变化可互换使用，以指生物样品中的生物标记值或水平大于通常在来自健康或正常个体的相似生物样品中检测到的生物标记值或水平(或值或水平范围)。该术语还可以指生物样品中的生物标记值或水平大于可以在特定疾病的不同阶段时检测到的生物标记值或水平(或值或水平范围)。

“下调”、“下调的”、“表达不足”、“表达不足的”及其任何变化可互换使用，以指生物样品中的生物标记值或水平小于通常在来自健康或正常个体的相似生物样品中检测到的生物标记值或水平(或值或水平范围)。该术语还可以指生物样品中的生物标记值或水平小于可以在特定疾病的不同阶段时检测到的生物标记值或水平(或值或水平范围)。

进一步地，与生物标记(其指示个体中的正常过程或者疾病或其他状况的不存在，或者是个体中的正常过程或者疾病或其他状况的不存在的征兆)的“正常”表达水平或值相比较，过表达或表达不足的生物标记还可以被称为“差异表达的”或者具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标记的“差异表达”还可以被称为与生物标记的“正常”表达水平的变化。

术语“差异基因表达”和“差异表达”可互换使用，以指相对于其在正常或对照对象中的表达，其表达在患有特定疾病或状况的对象中被激活至更高或更低水平的基因(或其相应蛋白质表达产物)。该术语还包括其表达在相同疾病或状况的不同阶段时被激活至更高或更低水平的基因(或相应蛋白质表达产物)。还应当理解差异表达的基因可以在核酸水平或蛋白质水平上进行激活或抑制，或可以实施可变剪接，以导致不同的多肽产物。此类差异可以通过多种改变加以证明，所述改变包括多肽的mRNA水平、表面表达、分泌或其他分隔。差异基因表达可以包括在两种或更多种基因或其基因产物之间的表达比较；或在两种或更多种基因或其基因产物之间的表达比例的比较；或甚至相同基因的两种差异加工产物的比较，其在正常对象和患有疾病的对象之间不同；或在相同疾病的多个阶段之间不同。差异表达包括在例如正常和患病细胞中，或在已经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中，在基因或其表达产物中的瞬时或细胞表达模式中的定量以及定性差异两者。

如本文使用的，“个体”指测试对象或患者。个体可以是哺乳动物或非哺乳动物。在多个实施方案中，个体是哺乳动物。哺乳动物个体可以是人或非人。在多个实施方案中，个体是人。健康或正常个体是其中目的疾病或状况(包括例如心血管事件，例如心肌梗塞、中风和充血性心力衰竭)无法通过常规诊断方法检测的个体。

“诊断”及其变化指基于与个体有关的一种或多种体征、症状、数据或其他信息，该个体的健康状态或状况的检测、测定或识别。个体的健康状态可以诊断为健康/正常(即，疾病或状况的不存在的诊断)或诊断为有病/异常(即，疾病或状况的存在的诊断，或疾病或状况的特征的评价)。关于特定疾病或状况的术语“诊断”等包含疾病的初始检测；疾病的表征或分类；疾病进展、缓解或复发的检测；和在给个体施用治疗或疗法后，疾病应答的检测。CV事件危险的预测包括区分具有CV事件危险增加的个体与不具有CV事件危险增加的个体。

“预后”及其变化指具有疾病或状况的个体中的疾病或状况的未来过程的预测(例如预测患者存活)，并且此类术语包含在给个体施用治疗或疗法后，疾病或状况应答的评估。

“评估”及其变化包含“诊断”和“预后”，并且还包含关于不具有疾病的个体中的疾病或状况的未来过程的测定或预测，以及关于疾病或状况将在明显已治愈疾病或已解决状况的个体中复发的危险的测定或预测。术语“评估”还包含评价个体对治疗的应答，例如预测个体是否可能有利地响应治疗剂或不太可能响应治疗剂(或例如将经历毒性或其他不希望有的副作用)，选择用于施用于个体的治疗剂，或者监控或测定个体对已施用于个体的疗法的应答。因此，“评估”CV事件危险可以包括例如下述的任何：预测个体中的未来CV事件危险；预测在明显没有CV问题的个体中的CV事件危险；或者测定或预测个体对CV治疗的应答，或基于衍生自个体的生物样品的生物标记值的测定，选择CV治疗以施用于个体。CV事件危险的评估可以包括实施方案例如在连续规模上评价CV事件的危险，或在扩大分类中分类CV事件的危险。危险的分类包括例如分类成两个或更多个分类，例如“无升高的CV事件危险”和“升高的CV事件危险”。CV事件危险的评估是对于限定时期；此类时期可以是例如5年。

如本文使用的，“另外的生物医学信息”指除使用本文描述的生物标记中的任何外，个体的一种或多种评估，所述生物标记与CV危险或更具体而言CV事件危险相关。“另外的生物医学信息”包括下述中的任何：个体的物理描述词，包括个体的高度和/或重量；个体的年龄；个体的性别；重量中的改变；个体的种族性；职业史；心血管疾病(或其他循环系统病症)的家族史；与个体或家族成员中的心血管疾病(或其他循环系统病症)的更高危险关联的一种或多种遗传标记的存在；颈动脉内膜厚度中的改变；临床症状例如胸痛、重量增加或减轻；基因表达值；个体的物理描述词，包括通过放射学成像观察到的物理描述词；吸烟状态；饮酒史；职业史；饮食习惯–盐、饱和脂肪和胆固醇摄取；咖啡因消费；和成像信息例如心电图、超声心动图、内膜-中膜厚度的颈动脉超声、流量介导的舒张、脉搏波速度、踝-臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、通过CT的冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影术、MRI成像及其他成像模式；和个体的用药。与单独的生物标记测试或评估单独的另外生物医学信息(例如单独的颈动脉内膜厚度成像)的任何特定项目相比较，与任何另外的生物医学信息评估组合的生物标记水平测试，包括其他实验室测试(例如HDL、LDL测试、CRP水平、Nt-proBNP测试、血清白蛋白测试、肌酸测试)，可以例如改善用于预测CV事件的灵敏度、特异性和/或AUC。另外的生物医学信息可以使用本领域已知的常规技术得自个体，例如通过使用常规患者问卷或健康史问卷来自个体自身等，或来自医学从业者等。与单独测试的生物标记或评估单独的另外生物医学信息的任何特定项目(例如单独的CT成像)相比较，与任何另外的生物医学信息评估组合的生物标记水平的测试可以例如改善用于预测CV事件(或其他心血管相关用途)的灵敏度、特异性和/或阈值。

如本文使用的，关于生物标记值的“检测”或“测定”包括观察和记录对应于生物标记值的信号所需的仪器和生成该信号所需的一种或多种材料两者的使用。在多个实施方案中，生物标记值使用任何合适方法进行检测，所述方法包括荧光、化学发光、表面等离子体共振、表面声波、质谱法、红外光谱法、拉曼光谱法、原子力显微镜检查、扫描隧道显微镜检查、电化学检测方法、核磁共振、量子点等等。

“固体载体”在本文中指具有分子可以直接或间接、通过共价或非共价键与之附着的表面的任何基底。“固体载体”可以具有多种物理形式，其可以包括例如膜；芯片(例如蛋白质芯片)；载玻片(例如玻璃载玻片或盖玻片)；柱；空心、固体、半固体、含孔或腔的颗粒，例如珠；凝胶；纤维包括纤维光学材料；矩阵；和样品容器；示例性样品容器包括能够容纳样品的样品孔、管、毛细管、小瓶和任何其他器皿、凹槽或凹口。样品容器可以包含在多样品平台上，例如微量滴定板、载玻片、微粒体装置等等。载体可以由天然或合成材料、有机或无机材料组成。捕获试剂附着在其上的固体载体的组成一般取决于附着方法(例如共价附着)。其他示例性容器包括在其内可以发生测定法和相关操作的小滴和微粒体控制的或散装的油/含水乳状液。合适的固体载体包括例如塑料、树脂、多糖、二氧化硅或硅基材料、功能化玻璃、经修饰的硅、碳、金属、无机玻璃、膜、尼龙、天然纤维(例如丝、羊毛和棉花)、聚合物等等。组成固体载体的材料可以包括用于附着捕获试剂的反应基团，例如羧基、氨基或羟基。聚合物固体载体可以包括例如聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol tetraphthalate)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡胶、苯乙烯丁二烯橡胶、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚碳酸酯和聚甲基戊烯。可以使用的合适的固体载体颗粒包括例如编码颗粒，例如型编码颗粒、磁性颗粒和玻璃颗粒。

生物标记的示例性用途

在多个示例性实施方案中，通过经由任何数目的分析方法包括本文描述的分析方法中的任何，检测对应于存在于个体的循环例如血清或血浆中的一种或多种生物标记的一种或多种生物标记值，提供了用于评估个体中的CV事件危险的方法。与不具有CV事件危险增加的个体相比较，这些生物标记例如在具有CV事件危险增加的个体中是差异表达的。在个体中生物标记的差异表达的检测可以例如用于允许预测在5年时帧内的CV事件危险。

除测试生物标记水平作为独立诊断测试之外，生物标记水平还可以与SNP或者其他遗传病变或可变性的测定结合完成，所述其他遗传病变或可变性指示疾病或状况敏感性的危险增加(参见例如，Amos等人，NatureGenetics40，616-622(2009))。

除测试生物标记水平作为独立诊断测试之外，生物标记水平还可以与放射学筛查结合使用。生物标记水平还可以与有关症状或基因测试结合使用。在已评估CV事件的危险后，本文描述的生物标记中的任何的检测可用于指导个体的适当临床护理，包括在已测定CV事件危险后，高危个体中的渐增到更积极水平的护理。除与有关症状或危险因素结合测试生物标记水平之外，关于生物标记的信息也可以与其他类型的数据结合进行评估，所述数据特别是指示个体的心血管事件危险的数据(例如患者临床史、症状、心血管疾病的家族史、吸烟或饮酒史、危险因素例如一种或多种遗传标记的存在、和/或其他生物标记的状态等)。这些多种数据可以通过自动方法例如计算机程序/软件进行评价，其可以在计算机或其他仪器/装置中收录。

除与高危个体中的放射学筛查结合测试生物标记水平(例如与冠状动脉造影照片上检测到的阻塞结合评价生物标记水平)之外，关于生物标记的信息还可以与其他类型的数据结合评估，所述其他类型的数据特别是指示个体关于具有CV事件的危险的数据(例如患者临床史、症状、心血管疾病的家族史、危险因素例如个体是否是吸烟者、严重酗酒者和/或其他生物标记的状态等)。这些多种数据可以通过自动化方法例如计算机程序/软件进行评估，所述自动化方法可以在计算机或其他器械/装置中收录。

生物标记的测试还可以与临床实践中目前使用的指南和心血管危险算法结合。例如，Framingham危险评分使用下述危险因素以导致危险得分：血管张力、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇水平、受损的葡萄糖水平、吸烟、收缩压和糖尿病。高危患者的频率随着年龄增加，并且男性包含比女性更大比例的高危患者。

所述生物标记中的任何还可以用于成像测试中。例如，显像剂可以与所述生物标记中的任何偶联，其可以在其他用途中用于预测心血管事件的危险，监控对治疗干预的应答，在临床试验中选择靶群体。

生物标记和生物标记值的检测和测定

关于本文描述的生物标记的生物标记值可以使用多种已知分析方法中的任何进行检测。在一个实施方案中，生物标记值使用捕获试剂进行检测。如本文使用的，“捕获剂”或“捕获试剂”指能够与生物标记特异性结合的分子。在多个实施方案中，捕获试剂可以暴露于溶液中的生物标记，或可以暴露于生物标记，而捕获试剂固定在固体载体上。在其他实施方案中，捕获试剂含有与固体载体上的次要特点反应的特点。在这些实施方案中，捕获试剂可以暴露于溶液中的生物标记，并且随后在捕获试剂上的特点可以与固体载体上的次要特点结合使用，以将生物标记固定在固体载体上。捕获试剂基于待进行的分析类型加以选择。捕获试剂包括但不限于SOMA聚体、抗体、adnectins、锚蛋白、其他抗体模拟物和其他蛋白质支架、自身抗体、嵌合体、小分子、F(ab″)₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米抗体、印迹聚合物、高亲合性多聚体(Avimers)、拟肽、激素受体、细胞因子受体和合成受体、以及这些的修饰和片段。

在一些实施方案中，使用生物标记/捕获试剂复合物检测生物标记值。

在其他实施方案中，生物标记值衍生自生物标记/捕获试剂复合物，并且间接地例如由于反应进行检测，所述反应是生物标记/捕获试剂相互作用后续，但依赖生物标记/捕获试剂复合物的形成。

在一些实施方案中，生物标记值直接由生物样品中的生物标记进行检测。

在一个实施方案中，生物标记使用多路形式进行检测，所述多路形式允许生物样品中的两种或更多种生物标记的同时检测。在多路形式的一个实施方案中，捕获试剂直接或间接地、共价或非共价地固定在固体载体上的不连续位置中。在另一个实施方案中，多路形式使用不连续的固体载体，其中每个固体载体具有与该固体载体相关的独特捕获试剂，例如量子点。在另一个实施方案中，个别装置用于检测在生物样品中待检测的多重生物标记中的每一种。个别装置可以被构造成允许生物样品中的每种生物标记同时进行加工。例如，微量滴定板可以这样使用，从而使得板中的每个孔用于独特地分析在生物样品中待检测的多重生物标记之一。

在前述实施方案的一个或多个中，荧光标签可以用于标记生物标记/捕获复合物的组分，以使得能够检测生物标记值。在多个实施方案中，荧光标记可以使用已知技术缀合至对于本文描述的生物标记中的任何特异性的捕获试剂，并且荧光标记随后可以用于检测相应生物标记值。合适的荧光标记包括稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Qdot605、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红及其他此类化合物。

在一个实施方案中，荧光标记是荧光染料分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包括至少一个取代吲哚鎓环系统，其中在吲哚鎓环的3-碳上的取代基含有化学反应基团或缀合物质。在一些实施方案中，染料分子包括AlexFluor分子，例如AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680或AlexaFluor700。在其他实施方案中，染料分子包括第一类和第二类染料分子，例如两种不同的AlexaFluor分子。在其他实施方案中，染料分子包括第一类和第二类染料分子，并且两种染料分子具有不同发射光谱。

荧光可以用与广泛范围的测定法形式相容的多种仪器进行测量。例如，分光荧光计已设计为分析微量滴定板、显微镜载玻片、印刷阵列、比色杯等。参见Principles of Fluorescence Spectroscopy，通过J.R.Lakowicz，Springer Science+Business Media，Inc.，2004。参见Bioluminescence&Chemiluminescence：Progress&Current Applications；Philip E.Stanley和Larry J.Kricka编辑，World Scientific Publishing Company，2002年1月。

在前述实施方案的一个或多个中，化学发光标签可以任选用于标记生物标记/捕获复合物的组分，以使得能够检测生物标记值。合适的化学发光材料包括草酰氯、罗丹明6G、Ru(bipy)32+、TMAE(四(二甲氨基)乙烯)、连苯三酚(1,2,3-三羟基苯)、光泽精、过氧草酸酯、芳基草酸酯、吖啶酯、二氧杂环丁烷及其他中的任何。

在另外其他实施方案中，检测方法包括酶/底物组合，其生成对应于生物标记值的可检测信号。通常，酶催化生色底物的化学改变，所述化学改变可以使用多种技术进行测量，所述技术包括分光光度法、荧光和化学发光。合适的酶包括例如萤光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

在另外其他实施方案中，检测方法可以是生成可测量信号的荧光、化学发光、放射性核素或酶/底物组合的组合。多模态发信号在生物标记测定法形式中可以具有独特且有利的特征。

更具体而言，关于本文描述的生物标记的生物标记值可以使用已知的分析方法进行检测，所述分析方法包括单路SOMA聚体测定法、多路SOMA聚体测定法、单路或多路免疫测定法、mRNA表达谱、miRNA表达谱、质谱分析、组织学/细胞学方法等，如在下文详细描述的。

使用基于SOMA聚体的测定法来测定生物标记值

针对检测和定量生物样品及其他样品中生理学上有意义的分子的测定法是科学研究和卫生保健领域中的重要工具。一类此类测定法涉及使用包括固定在固体载体上的一种或多种适体的微阵列。适体各自能够以高特异性方式和非常高的亲和力与靶分子结合。参见例如名称为“Nucleic AcidLigands”的美国专利号5,475,096；还参见例如美国专利号6,242,246、美国专利号6,458,543和美国专利号6,503,715，所述专利各自的名称为“NucleicAcid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦使微阵列与样品接触，适体就与样品中存在的其各自的靶分子结合，从而使得能够测定对应于生物标记的生物标记值。

如本文使用的，“适体”指对靶分子具有特异性结合亲和力的核酸。认识到亲和相互作用是程度的问题；然而，在这个背景下，适体对其靶的“特异性结合亲和力”意指适体一般以比其结合测试样品中的其他组分的亲和力高得多的程度结合其靶。“适体”是一类核酸分子或核酸分子种类的拷贝集合，所述核酸分子具有特定的核苷酸序列。适体可包含任何合适数目的核苷酸，包括任何数目的化学修饰的核苷酸。“适体”指超过一个此类分子集合。不同的适体可以具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA或化学修饰的核酸，并且可以是单链的、双链的或含有双链区，并且可以包含较高级别的结构。适体也可以是光适体，其中在适体中包括光反应性或化学反应性官能团，以允许其与其相应靶共价连接。本文公开的适体方法中的任何可以包括使用特异性结合相同靶分子的两种或更多种适体。如下文进一步描述的，适体可以包含标签。如果适体包括标签，则该适体的所有拷贝均无需具有相同的标签。此外，如果不同适体各自包括标签，则这些不同适体可以具有相同标签或不同标签。

适体可以使用任何已知方法包括SELEX过程进行鉴定。一旦鉴定，就可以依照任何已知方法制备或合成适体，所述已知方法包括化学合成方法和酶促合成方法。

如本文使用的，“SOMA聚体”或缓慢解离速率修饰的适体指具有改善的解离速率特征的适体。可以使用名称为“Method for Generating Aptamerswith Improved Off-Rates”的美国公开号2009/0004667中所述的改善SELEX方法生成SOMA聚体。

术语“SELEX”和“SELEX过程”在本文可互换使用，一般指下述的组合：(1)以期望方式与靶分子相互作用，例如以高亲和力与蛋白质结合的适体的选择，(2)所选核酸的扩增。SELEX过程可以用于鉴定对特定靶或生物标记具有高亲和力的适体。

SELEX一般包括制备核酸的候选混合物，使候选混合物与所选靶分子结合以形成亲和复合物，分离亲和复合物与未结合的候选核酸，使核酸与亲和复合物分开并分离，纯化核酸，并鉴定特异性适体序列。该过程可以包括多次循环以进一步改进所选适体的亲和力。该过程可以包括在该过程中的一个或多个点处的扩增步骤。参见例如名称为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096。SELEX过程可以用于生成共价结合其靶的适体，以及非共价结合其靶的适体。参见例如名称为“Systematic Evolution ofNucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX”的美国专利号5,705,337。

SELEX过程可以用于鉴定含有经修饰的核苷酸的高亲和力适体，所述经修饰的核苷酸对适体赋予改善的特征，例如改善的体内稳定性或改善的递送特征。此类修饰的例子包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX过程鉴定的含有经修饰的核苷酸的适体在名称为“High AffinityNucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的美国专利号5,660,985中描述，所述专利描述了含有在嘧啶的5'-和2'-位置处经化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。参见上文，美国专利号5,580,737描述了高特异性适体，其含有由2'-氨基(2'-NH₂)、2'氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的一个或多个核苷酸。还参见名称为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公开2009/0098549，其描述了具有扩展的物理和化学性质的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

SELEX还可以用于鉴定具有期望的解离速率特征的适体。参见名称为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利申请公开2009/0004667，其描述了用于生成可以与靶分子结合的适体的改善SELEX方法。如上所述，这些缓慢离解速率适体被称为“SOMA聚体”。描述了用于生成与其各自的靶分子具有较慢离解速率的适体或SOMA聚体和光适体或SOMA聚体的方法。该方法涉及使候选混合物与靶分子接触，允许核酸-靶复合物的形成发生，并进行缓慢解离速率富集过程，其中具有快速离解速率的核酸-靶复合物离解并不再形成，而具有缓慢离解速率的复合物将保持完整。另外，该方法包括在产生候选核酸混合物中使用经修饰的核苷酸，以生成具有改善的解离速率性能的适体或SOMA聚体。

这种测定法的变化采用包括光反应性官能团的适体，所述光反应性官能团使适体能够与其靶分子共价结合或“光交联”。参见例如名称为“NucleicAcid Ligand Diagnostic Biochip”的美国专利号6,544,776。这些光反应性适体也被称为光适体。参见例如美国专利号5,763,177、美国专利号6,001,577和美国专利号6,291,184，所述专利各自名称为“Systematic Evolution ofNucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Pho-toselection of NucleicAcid Ligands and Solution SELEX”；还参见例如名称为“Photoselection ofNucleic Acid Ligands”的美国专利号6,458,539。在使微阵列与样品接触并使光适体具有与其靶分子结合的机会后，将光适体光激活并洗涤固体载体以去除任何非特异性结合的分子。可以使用严格洗涤条件，因为由于光适体上一个或多个光激活的官能团产生的共价键，与光适体结合的靶分子一般未被去除。以这种方式，测定法使得能够检测对应于测试样品中生物标记的生物标记值。

在这两种测定法形式中，适体或SOMA聚体在与样品接触前固定在固体载体上。然而，在某些情况下，在与样品接触前的适体或SOMA聚体固定可能不提供最佳测定法。例如，适体或SOMA聚体的预固定可以导致适体或SOMA聚体与靶分子在固体载体表面上的无效混合，可能导致过长的反应时间和因此延长的温育期以允许适体或SOMA聚体与其靶分子的有效结合。进一步地，当光适体或光SOMA聚体用于测定法中并且取决于用作固体载体的材料时，该固体载体可能趋于散射或吸收用于实现光适体或光SOMA聚体与其靶分子之间的共价键形成的光。此外，取决于采用的方法，与其适体或光SOMA聚体结合的靶分子的检测可能具有不精确的缺点，因为固体载体的表面也可能暴露于使用的任何标记剂且受使用的任何标记剂的影响。最后，在固体载体上的适体或SOMA聚体固定一般涉及在适体或SOMA聚体暴露于样品前的适体或SOMA聚体制备步骤(即固定)，并且这个制备步骤可能影响适体或SOMA聚体的活性或功能性。

还已描述了SOMA聚体测定法，其允许SOMA聚体在溶液中捕获其靶，并且随后采用设计为在检测前去除SOMA聚体-靶混合物中的特定组分的分离步骤(参见名称为“Multiplexed Analyses of Test Samples”的美国专利申请公开2009/0042206)。通过检测且定量核酸(即SOMA聚体)，所述SOMA聚体测定方法使得能够检测和定量测试样品中的非核酸靶(例如蛋白质靶)。所述方法产生核酸替代物(即SOMA聚体)用于检测且定量非核酸靶，因此允许广泛多样的核酸技术包括扩增应用于更广泛范围的所需靶包括蛋白质靶。

可以构建SOMA聚体以促进从SOMA聚体生物标记复合物(或光SOMA聚体生物标记共价复合物)中分离测定法组分，并允许分离SOMA聚体用于检测和/或定量。在一个实施方案中，这些构建体可以包含SOMA聚体序列中可切割或可释放的元件。在其他实施方案中，可以将另外的官能性引入SOMA聚体内，所述另外的官能性例如标记或可检测的组分、间隔组分或特异性结合标签或固定元件。例如，SOMA聚体可以包括经由可切割部分与SOMA聚体连接的标签、标记、分离标记的间隔组分和可切割部分。在一个实施方案中，可切割元件是光可切割接头。光可切割接头可以附着至生物素部分和间隔区段，可以包括NHS基团用于胺的衍生化，并且可以用于将生物素基团引入SOMA聚体，从而允许SOMA聚体在测定方法中以后释放。

用在溶液中所有测定法组分进行的均质测定法在检测信号前不需要分离样品与试剂。这些方法是快速且易于使用的。这些方法基于与其特异性靶反应的分子捕获或结合试剂生成信号。对于CV事件预测，分子捕获试剂将是SOMA聚体或抗体等等，并且特异性靶将是表1，第7列的CV事件生物标记。

在一个实施方案中，用于信号生成的方法利用由于荧光团标记的捕获试剂与其特异性生物标记靶的相互作用的各向异性信号改变。当标记的捕获试剂与其靶反应时，增加的分子量促使附着至复合物的荧光团的旋转运动变得慢得多，改变各向异性值。通过监控各向异性改变，结合事件可以用于定量测量溶液中的生物标记。其他方法包括荧光偏振测定法、分子信标方法、时间分辨荧光猝灭、化学发光、荧光共振能量转移等等。

可以用于检测对应于生物样品中的生物标记的生物标记值的基于溶液的示例性SOMA聚体测定法包括下述步骤：(a)通过使生物样品与SOMA聚体接触来制备混合物，所述SOMA聚体包括第一标签并对生物标记具有特异性亲和力，其中当生物标记存在于样品中时，形成SOMA聚体亲和复合物；(b)使混合物暴露于包括第一捕获元件的第一固体载体，并且允许第一标签与第一捕获元件结合；(c)去除未与第一固体载体结合的混合物的任何组分；(d)使第二标签附着至SOMA聚体亲和复合物的生物标记组分；(e)从第一固体载体释放SOMA聚体亲和复合物；(f)使释放的SOMA聚体亲和复合物暴露于包括第二捕获元件的第二固体载体，并且允许第二标签与第二捕获元件结合；(g)通过分隔未复合的SOMA聚体与SOMA聚体亲和复合物，从混合物中去除任何未复合的SOMA聚体；(h)从固体载体中洗脱SOMA聚体；和(i)通过检测SOMA聚体亲和复合物的SOMA聚体组分来检测生物标记。

通过检测SOMA聚体亲和复合物的SOMA聚体组分，本领域已知的任何方法均可用于检测生物标记值。许多不同的检测方法可以用于检测亲和复合物的SOMA聚体组分，例如杂交测定法、质谱法或QPCR。在一些实施方案中，核酸测序方法可以用于检测SOMA聚体亲和复合物的SOMA聚体组分，并且从而检测生物标记值。简言之，可以对测试样品实施任何种类的核酸测序方法，以鉴定且定量测试样品中存在的一种或多种SOMA聚体的一个或多个序列。在一些实施方案中，序列包括整个SOMA聚体分子或分子的任何部分，其可以用于独特鉴定分子。在其他实施方案中，鉴定测序是加入SOMA聚体的特异性序列；此类序列通常被称为“标签”、“条形码”或“邮编码”。在一些实施方案中，测序方法包括酶促步骤，以扩增SOMA聚体序列或将含有对任何位置的化学修饰的任何种类的核酸(包括RNA和DNA)转换为适合于测序的任何其他种类的核酸。

在一些实施方案中，测序方法包括一个或多个克隆步骤。在其他实施方案中，测序方法包括直接测序方法而无需克隆。

在一些实施方案中，测序方法包括使用特异性引物的定向方法，所述特异性引物靶向测试样品中的一种或多种SOMA聚体。在其他实施方案中，测序方法包括靶向测试样品中的所有SOMA聚体的鸟枪法。

在一些实施方案中，测序方法包括酶促步骤以扩增靶向用于测序的分子。在其他实施方案中，测序方法直接测序单一分子。可以用于检测对应于生物样品中的生物标记的生物标记值的基于核酸测序的示例性方法包括下述步骤：(a)使用酶促步骤，将含有经化学修饰的核苷酸的SOMA聚体混合物转换为未经修饰的核酸；(b)用大量平行测序平台，例如454SequencingSystem(454Life Sciences/Roche)、Illumina Sequencing System(Illumina)、ABI SOLiD Sequencing System(Applied Biosystems)、HeliScope SingleMolecule Sequencer(Helicos Biosciences)、或Pacific Biosciences Real TimeSingle-Molecule Sequencing System(Pacific BioSciences)或Polonator GSequencing System(Dover Systems)，鸟枪测序所得到的未经修饰的核酸；和(c)通过特异性序列和序列计数鉴定且定量混合物中存在的SOMA聚体。

使用免疫测定法来测定生物标记值

免疫测定方法基于抗体与其相应靶或分析物的反应，并且可以根据特定测定法形式检测样品中的分析物。为了改善基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度，由于其特异性表位识别而通常使用单克隆抗体。多克隆抗体由于其与单克隆抗体相比较增加的对于靶的亲和力也已成功地用于多种免疫测定法中。免疫测定法已设计为与广泛范围的生物样品基质一起使用。免疫测定法形式已设计为提供定性、半定量和定量结果。

定量结果通过使用由待检测的已知浓度的特定分析物产生的标准曲线来生成。将来自未知样品的应答或信号标绘到标准曲线上，并确定该未知样品中对应于靶的量或值。

已设计了众多免疫测定法形式。ELISA或EIA可以定量检测分析物。这种方法依赖标记对分析物或抗体的附着，并且标记组分直接或间接地包括酶。ELISA测试可以格式化用于分析物的直接、间接、竞争性或夹心检测。其他方法依赖标记，例如放射性同位素(I¹²⁵)或荧光。另外的技术包括例如凝集反应、浊度测定法、比浊法、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、血清学、Luminex测定法及其他(参见ImmunoAssay：A Practical Guide，由Brian Law编辑，由Taylor&Francis，Ltd.出版，2005版)。

示例性测定法形式包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法、荧光、化学发光和荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨的-FRET(TR-FRET)免疫测定法。用于检测生物标记的程序的例子包括生物标记免疫沉淀，随后为允许大小和肽水平区分的定量方法，例如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱等等。

检测和/或定量可检测标记或信号生成材料的方法取决于标记的性质。由合适的酶催化的反应产物(其中可检测标记是酶；参见上文)可以是但不限于荧光、发光或放射性的，或者它们可以吸收可见光或紫外光。适合于检测此类可检测标记的检测器的例子包括但不限于x线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、发光计和密度计。

可以以允许反应的任何适当制备、加工和分析的任何形式来进行检测方法中的任何。这可以例如在多孔测定板(如96孔或384孔)中，或者使用任何合适的阵列或微阵列。可以人工或机器化制备关于多种试剂的原液，并且使用能够检测可检测标记的商购可得的分析软件、机器人和检测仪器，可以机器化完成所有后续移液、稀释、混合、分配、洗涤、温育、样品读取、数据收集和分析。

使用基因表达谱分析来测定生物标记值

测量生物样品中的mRNA可以用作检测生物样品中的相应蛋白质水平的替代。因此，本文所述的生物标记或生物标记组中的任何还可以通过检测适当的RNA来检测。

mRNA表达水平通过逆转录定量聚合酶链式反应(RT-PCR随后为qPCR)进行测量。RT-PCR用于由mRNA产生cDNA。cDNA可以用于qPCR测定法中，随着DNA扩增过程进展而产生荧光。通过与标准曲线比较，qPCR可以产生绝对测量，例如每细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、Invader测定法以及与毛细管电泳组合的RT-PCR均已用于测量样品中的mRNA表达水平。参见Gene Expression Profiling：Methods and Protocols，Richard A.Shimkets，编辑，Humana Press，2004。

miRNA分子是非编码但可以调节基因表达的小RNA。适合于测量mRNA表达水平的方法中的任何均可用于相应的miRNA。最近，许多实验室已研究了miRNA作为疾病的生物标记的用途。许多疾病涉及广泛的转录调节，并且miRNA可能发现作为生物标记的作用并不令人惊讶。与蛋白质水平和疾病之间的关联相比较，miRNA浓度和疾病之间的关联通常更不明确，然而，miRNA生物标记的价值可能是重要的。当然，与在疾病期间差异表达的任何RNA一样，体外诊断产品开发所面临的问题包括下述要求：miRNA在患病细胞中存活并易于提取用于分析，或者miRNA被释放进入血液或其他基质内，在其中它们必须存活足够久以进行测量。蛋白质生物标记具有类似的要求，尽管许多潜在的蛋白质生物标记以旁分泌形式在疾病期间在病理状态和功能部位处有意地分泌。许多潜在的蛋白质生物标记设计为在其内合成那些蛋白质的细胞外起作用。

使用体内分子成像技术检测分子标记

所述生物标记中的任何(参见表1，第7列)还可以用于分子成像测试中。例如，显像剂可以与所述生物标记中的任何偶联，其可以在其他用途中用于预测在5年内的心血管事件的危险，监控对治疗干预的应答，在临床试验中选择靶群体。

体内成像技术提供了用于测定个体体内特定疾病或状况状态的非侵入性方法。例如，机体的整个部分或甚至整个机体均可以作为三维图像观察，从而提供关于机体内形态和结构的有价值的信息。此类技术可以与本文所述的生物标记检测组合，以提供关于心血管状态的信息。

体内分子成像技术的使用由于技术中的多种进展而扩大。这些进展包括开发新造影剂或标记，例如放射性标记和/或荧光标记，其可以在体内提供强信号；以及开发强大的新成像技术，其可以从机体外部检测且分析这些信号，具有足够的灵敏度和精确度以提供有用的信息。造影剂可以在适当的成像系统中显现，从而提供造影剂定位于其中的一个或多个机体部分的图像。造影剂可以与下述结合或相关：例如捕获试剂例如SOMA聚体或抗体，和/或肽或蛋白质、或寡核苷酸(例如用于基因表达的检测)或复合物，所述复合物含有这些中的任何连同一种或多种大分子和/或其他微粒形式。

造影剂还可以是可用于成像的放射性原子的特点。对于闪烁研究的合适放射性原子包括锝-99m或碘-123。其他可容易检测的部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，例如碘-123、再次碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。此类标记是本领域众所周知的，并且可以由本领域普通技术人员容易地选择。

标准成像技术包括但不限于磁共振成像、计算机断层摄影术扫描(冠状动脉钙化评分)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、计算机断层摄影术等等。对于诊断性体内成像，可用的检测仪器类型是在选择给定造影剂中的主要因素，例如用于靶(蛋白质、mRNA等等)的给定放射性核素和特定生物标记。所选的放射性核素通常具有可由给定类型的仪器检测的衰变类型。另外，当选择用于体内诊断的放射性核素时，其半衰期应足够长以使得能够在由靶组织的最大摄取时检测，但也应足够短，以使宿主的有害辐射降到最低。

示例性成像技术包括但不限于PET和SPECT，其为其中放射性核素全身(synthetically)或局部地施用于个体的成像技术。在一段时间内测量放射性示踪剂的随后摄取，并用于获得关于靶向组织和生物标记的信息。由于采用的特定同位素的高能(γ-射线)发射以及用于检测其的仪器的灵敏度和复杂性，可以由机体外部推断放射性的二维分布。

PET中常用的正电子发射核素包括例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18。通过电子捕获和/或γ-发射衰变的同位素用于SPECT中，并且包括例如碘-123和锝-99m。用锝-99m标记氨基酸的示例性方法是在螯合前体的存在下的高锝酸盐离子还原，以形成不稳定的锝-99m-前体络合物，其依次又与双官能修饰的趋化肽的金属结合基团反应，以形成锝-99m-趋化肽缀合物。

抗体频繁用于此类体内成像诊断方法。用于体内诊断的抗体的制备和用途是本领域众所周知的。特异性结合表1，第7列中的生物标记中的任何的标记抗体可以注射到怀疑具有CV事件危险增加的个体内，所述标记抗体可根据使用的特定生物标记检测，用于诊断或评估个体的疾病状态或状况的目的。如先前描述的，使用的标记依照待使用的成像模式加以选择。标记的定位允许测定组织损伤或与CV事件的危险相关的其他适应症。器官或组织内的标记量也允许测定该器官或组织中由于CV事件危险的CV事件生物标记的涉及。

类似地，SOMA聚体可以用于此类体内成像诊断方法。例如，用于鉴定表1，第7列中所述的特定生物标记的SOMA聚体(并且因此特异性结合该特定生物标记)可以适当地进行标记，并注射到怀疑具有CV事件的个体内，所述SOMA聚体可根据特定生物标记检测，用于诊断或评估个体中的组织损伤、粥样硬化斑块、炎症应答的组分及与CV事件危险相关的其他因素水平的目的。如先前描述的，使用的标记依照待使用的成像模式加以选择。标记的定位允许测定导致危险增加的过程部位。器官或组织内的标记量也允许测定该器官或组织中病理过程的浸润。与其他显像剂相比较，SOMA聚体定向的显像剂可以具有关于组织渗透、组织分布、动力学、消除、效力和选择性的独特且有利的特征。

此类技术也可以任选地用标记的寡核苷酸进行，例如用于通过用反义寡核苷酸成像检测基因表达。这些方法用于原位杂交，例如用荧光分子或放射性核素作为标记。用于检测基因表达的其他方法包括例如检测报道基因的活性。

另一种一般类型的成像技术是光学成像，其中对象内的荧光信号通过对于所述对象外部的光学装置进行检测。这些信号可以是由于实际的荧光和/或生物发光。光学检测装置的灵敏度中的改善已增加光学成像用于体内诊断测定法的有用性。

体内分子生物标记成像的用途是渐增的，包括用于临床试验，例如在关于新疾病或状况疗法的试验中更快速地测量临床功效，和/或避免对于诸如多发性硬化的那些疾病的延长安慰剂治疗，其中此类延长治疗可能被认为在伦理上是有问题的。

关于其他技术的综述，参见N.Blow，Nature Methods，6，465-469，2009。

使用质谱方法测定生物标记值

多种质谱仪配置可以用于检测生物标记值。几个类型的质谱仪是可获得的或可以用多种配置产生。一般而言，质谱仪具有下述主要部件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统以及仪器控制系统和数据系统。样品入口、离子源和质量分析器中的差异一般限定仪器的类型及其能力。例如，入口可以是毛细管柱液相色谱源，或可以是例如在基质辅助激光解吸中使用的直接探针或载物台(stage)。常用的离子源是例如电喷雾包括纳米喷雾和微喷雾，或基质辅助激光解吸。常用的质量分析器包括四极滤质器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。另外的质谱方法是本领域众所周知的(参见Burlingame等人Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，New York(2000))。

蛋白质生物标记和生物标记值可以通过下述中的任何进行检测且测量：电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱分析法(SELDI-TOF-MS)、在硅上的解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、被称为ultraflex III TOF/TOF的串联飞行时间(TOF/TOF)技术、大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)N、大气压光电离质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)N、四极质谱法、傅里叶变换质谱法(FTMS)、定量质谱法和离子阱质谱法。

样品制备策略用于在蛋白质生物标记的质谱表和测定生物标记值前标记且富集样品。标记方法包括但不限于用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)和在细胞培养中用氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)。在质谱分析前用于就候选生物标记蛋白质选择性富集样品的捕获试剂包括但不限于SOMA聚体、抗体、核酸探针、嵌合物、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体-结合受体、亲和体、纳米抗体、锚蛋白、结构域抗体、可变抗体支架(例如双抗体等)、印迹聚合物、高亲合性多聚体、肽模拟物、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成受体以及这些的修饰和片段。

使用邻位连接测定法来测定生物标记值

邻位连接测定法可以用于测定生物标记值。简言之，使测试样品与一对亲和探针接触，所述一对亲和探针可以是一对抗体或一对SOMA聚体，其中该对的每个成员由寡核苷酸延伸。关于所述一对亲和探针的靶可以是在一种蛋白质上的两个不同决定簇(determinates)或在两种不同蛋白质各自上的一个决定簇，所述两种不同蛋白质可以作为同或异多聚复合物存在。当探针与靶决定簇结合时，寡核苷酸延伸的游离端达到足够靠近以一起杂交。寡核苷酸延伸的杂交通过常见的连接寡核苷酸得到促进，当寡核苷酸延伸放置足够接近时，所述连接寡核苷酸作用于使它们桥接在一起。一旦探针的寡核苷酸延伸杂交，延伸的端就通过酶促DNA连接而连接在一起。

每种寡核苷酸延伸包含用于PCR扩增的引物位点。一旦寡核苷酸延伸连接在一起，寡核苷酸就形成连续DNA序列，其通过PCR扩增揭示关于靶蛋白质的同一性和量的信息，以及关于蛋白质-蛋白质相互作用的信息，其中靶决定簇在两种不同蛋白质上。邻位连接可以通过使用实时PCR提供用于实时蛋白质浓度和相互作用信息的高灵敏度和特异性的测定法。不结合目的决定簇的探针不具有达到接近的相应的寡核苷酸延伸，并且不进行连接或PCR扩增，导致不产生信号。

前述测定法使得能够检测可用于预测CV事件危险的方法中的生物标记值，其中该方法包括在来自个体的生物样品中检测至少N个生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表1，第7列中提供的生物标记的生物标记，其中如下文详细描述的，使用生物标记值的分类法指示个体是否具有在5年时间段内发生的CV事件危险升高。虽然所述CV事件生物标记中的某些可单独用于预测CV事件危险，但本文还描述了用于分组多个CV事件生物标记子集的方法，所述多个NSCLC生物标记子集各自可用作三种或更多种生物标记的组。因此，本申请的多个实施方案提供了包含N种生物标记的组合，其中N是至少三种生物标记。在其他实施方案中，N选择为来自2-155种生物标记的任何数目。应当理解N可以选择为来自上述范围中的任何以及相似但更高级别的范围的任何数目。依照本文描述的方法中的任何，生物标记值可以个别检测且分类，或它们可以共同检测且分类，如例如在多路测定法形式中。

关于给定诊断或预后测试的生物标记“标志”含有标记的集合，每个标记在所目的群体中具有不同水平。在这个背景下，不同水平可以指关于两个或更多个组中个体的标记水平的不同平均值，或者两个或更多个组中的不同方差，或者这两者的组合。对于最简单形式的诊断测试，这些标记可以用于将来自个体的未知样品指定到两组之一内，CV事件危险增加或不增加。将样品指定到两个或更多个组之一内称为分类，并且用于实现这种指定的程序称为分类器或分类方法。分类方法也可以被称为评分方法。存在可以用于从生物标记值的集合构建诊断分类器的许多分类方法。一般而言，分类方法最容易使用监督学习技术进行，其中使用得自希望区分的两个(或更多个，用于多重分类状态)不同组内的个体的样品收集数据集。因为每个样品所属类别(组或群体)对于每个样品事先是已知的，所以可以训练分类方法以给出所需分类应答。还能够使用无监督学习技术来产生诊断分类器。

用于开发诊断分类器的常用方法包括决策树；套袋，提高，森林和随机森林；基于规则推论的学习；Parzen窗；线性模型；逻辑；神经网络方法；无监督聚类；K-平均值；分层递升/递减；半监督学习；原型方法；最近邻；核密度估计；支持向量机；隐马尔可夫模型；玻尔兹曼学习；并且分类器可以简单或以使特定目标函数降到最低的方式组合。关于综述，参见例如Pattern Classification，R.O.Duda等人，编辑，John Wiley&Sons，第2版，2001；还参见The Elements of Statistical Learning-Data Mining，Inference，and Prediction，T.Hastie等人，编辑，Springer Science+BusinessMedia，LLC，第2版，2009；所述参考文献各自整体引入本文作为参考。

为了使用监督学习技术产生分类器，获得称为训练数据的样品集合。在诊断测试的背景下，训练数据包括来自未知样品以后将被指定至其的不同组(类别)的样品。例如，由对照群体中的个体和特定疾病、状况或事件群体中的个体收集的样品可以构成训练数据，以开发可以将未知样品(或更特别地，由其获得样品的个体)分类为具有该疾病、状况或事件危险升高，或者不含该疾病、状况或事件危险升高的分类器。由训练数据开发分类器被称为训练该分类器。关于分类器训练的具体细节取决于监督学习技术的性质(参见例如Pattern Classification，R.O.Duda等人，编辑，John Wiley&Sons，第2版，2001；还参见，The Elements of Statistical Learning-DataMining，Inference，and Prediction，T.Hastie等人，编辑，SpringerScience+Business Media，LLC，第2版，2009)。

因为通常存在比训练集合中的样品多许多的潜在生物标记值，所以必须小心避免过拟合。当统计模型描述随机误差或噪声代替潜在关系时，发生过拟合。过拟合可以以多种方式避免，所述方式包括例如限制开发分类器中使用的标记数目，假设标记应答互相独立，限制采用的潜在统计模型的复杂性，以及确保潜在统计模型符合数据。

为了鉴定与事件发生相关的生物标记集合，使用主成分分析(PCA)来分析组合的对照和早期事件样品集合。PCA就由所有样品之间的最强变化限定的轴展示样品，不考虑病例或对照结果，因此减轻过拟合病例和对照之间的区分的危险。因为严重血栓形成事件的发生具有涉及机会的强组分，要求报告不稳定斑块在重要血管中的破裂，所以将不预期看出对照和事件样品集之间的明确分离。虽然观察到的病例和对照之间的分离不大，但它在第二种主成分上发生，对应于该样品集中的总变化的约10％，其指示潜在生物变异是相对简单定量的(图2A)。

在接下来的分析集合中，生物标记可以就样品间差异的那些组分进行分析，所述组分对于对照样品和早期事件样品之间的分离是特异性的。可以采用的一种方法是DSGA(Bair,E.和Tibshirani,R.(2004)Semi-supervisedmethods to predict patient survival from gene expression data.PLOS Biol.，2，511–522)的使用，以去除(缩小)对照集合中的样品之间的前三个主成分的变化方向。尽管对于发现的对照集合进行维度减少，但在对照中的样品和来自早期事件的样品两者均运行通过PCA。病例与早期事件的分离可以沿水平轴观察到(图2B)。

与心血管危险相关的蛋白质的交叉验证选择

为了避免蛋白质预测力与特定选择样品的特异体质特点的过拟合，采取交叉验证和维度减少方法。交叉验证涉及样品集的多重选择，以测定通过与未选择样品的使用组合的蛋白质的危险相关，以监控该方法应用于未用于产生危险模型的样品的能力(The Elements of Statistical Learning-DataMining，Inference，and Prediction，T.Hastie等人，编辑，SpringerScience+Business Media，LLC，第2版，2009)。我们应用Tibshirani等人(Bair,E.和Tibshirani,R.(2004)Semi-supervised methods to predict patient survival fromgene expression data.PLOS Biol.，2，511–522.)的有监督PCA方法，其可应用于事件危险建模的高维度数据集。有监督PCA(SPCA)方法涉及与数据中观察到的事件风险统计相关的蛋白质集合的单变量选择，和组合来自所有这些蛋白质的信息的关联组分的测定。这种关联组分测定是维度减少步骤，通过使来自超过1000种蛋白质的完全蛋白质选单的独立变量数目减少下至几个主成分，其不仅组合跨越蛋白质的信息，还减轻过拟合的可能性(在这项工作中，我们仅检查第一种主成分)。Tibshirani等人的SPCA方法对蛋白质选择应用交叉验证，以便测定在制止交叉验证测试集中真正预测性的蛋白质数目。这些蛋白质用于产生与事件危险相关的蛋白质变化的关联组分。使用SPCA，我们发现具有155种蛋白质的列表，使用这种交叉验证的维度减少技术，所述155种蛋白质与事件危险统计相关。在SPCA的这种应用中，我们还允许对应于随机SOMA聚体序列的测试蛋白质信号以及对应于非人蛋白质的信号，其不存在于样品中。这10-20种已知非生物学信号无一由SPCA在155种蛋白质中加以选择(表1)。使用交叉验证SPCA方法的这个步骤对于针对假阳性蛋白质标记关联筛查是重要的。Tibshirani等人中的方法尤其通过使用预验证的交叉验证方法和PCA中固有的维度减少保护不受假发现。来自SPCA的155种蛋白质列表用于使用不同技术检查后续分析，以检测在来自SPCA的155种蛋白质列表中不含有的蛋白质标记的假发现。

个别蛋白质与时间与事件的关系的单变量分析和多变量分析

Cox比例风险模型(Cox，David R(1972)."Regression Models andLife-Tables".Journal of the Royal Statistical Society.SeriesB(Methodological)34(2)：187–220.))广泛用于医用统计学中。Cox回归避免特定时间函数与累积存活的拟合，并且相反采用涉及基线风险函数(其可以随着时间而改变)的相对危险模型。基线风险函数描述关于所有个体的存活时间分布的普通形状，而相对危险给出协变量值(例如单一个体或组)集合的风险水平，作为基线风险的倍数。相对危险在Cox模型中对于时间是恒定的。

我们使1092个简单单变量Cox模型与所有信号拟合。46种蛋白质(表2)具有好于10^-14的P值(Wald检验，(Wald，Abraham.(1943).A Method ofEstimating Plane Vulnerability Based on Damage of Survivors.StatisticalResearch Group，Columbia University)。所有这46种蛋白质均包括在使用SPCA选择的155种蛋白质的列表中(上文，表1)。大量高度显著蛋白质起初是令人惊讶的，然而，肾在心血管疾病中的牵涉暗示GFR(肾小球滤过率)中的改变。GFR中的降低将增加具有非零肾清除率的所有蛋白质，血液中的蛋白质浓度通过经由肾(清除)的蛋白质丧失到尿内而减少，如由GFR测量的肾滤过减少因此与这些蛋白质在血液中的浓度增加相关，所述蛋白质部分由肾过滤。

有用的模型将比46种蛋白质的完全列表更节省。另外如PCA中可见，许多蛋白质可能是高度关联的，有效模型将考虑这点。我们在两个步骤中将46种高度显著蛋白质的列表过滤下至10种蛋白质。首先，我们使列表限制于20种蛋白质，其给出具有大于0.37的量级的系数(等价于蛋白质信号中的倍增的30％风险改变)，这个步骤在使用所有46种蛋白质的单一多变量Cox模型上进行。(在拟合Cox模型前获得蛋白质测量的天然对数，因此Cox系数的指数对应于蛋白质测量中的e-倍(2.71)改变的危害比。)

通过要求p值应比0.01更显著，下一个步骤将20种蛋白质过滤下至十种。该步骤压制共变蛋白质且允许独立蛋白质贡献。对生物标记选择作出最终调整，因为补体系统的最后共同通路中的膜攻击复合物的成员C9判断为在其发信号中太不特异性，这是不能由该研究单独决定的事情，因为该研究产生为明确证实心血管危险。去除C9并且所有剩余蛋白质在其位置处进行评估。替代蛋白质在Wald检验评分中的改善上进行排序，并且KLK3.SerpinA3接近于与C9一样有效。

关于心血管危险的这种十标记模型的卡普兰迈耶存活曲线显示于图3A-3E中。

表1鉴定了可用于个体中的未来CV事件危险评估的155种生物标记。当与在生物标记发现努力中通常发现的相比较时，这令人惊讶地高于预期的数目，并且可以归于所述研究的规模，其涵盖在几百份个别样品中测量的超过1000种蛋白质，在一些情况下浓度为低飞摩尔范围。据推测，发现的大量生物标记反映导致心血管事件的生物学中牵涉的多种生物化学途径，和机体对CV事件的应答；每种途径和过程均涉及许多蛋白质。结果显示小组蛋白质中没有单个蛋白质对于此类复杂过程独特提供信息；相反，多重蛋白质涉及有关过程，例如GFR、动脉粥样硬化、炎症和激素CV调节。

来自实施例2的结果提示某些可能的结论：首先，大量生物标记的鉴定使它们能够聚集成巨大数目的提供相似高性能的分类器。其次，分类器可以这样构建，从而使得特定生物标记可以以反映冗余的方式取代其他生物标记，所述冗余无疑遍及潜在疾病、状况或事件过程的复杂性。也就是说，由表1中鉴定的任何个别生物标记贡献的有关疾病、状况或事件的信息与由其他生物标记贡献的信息重叠，从而使得表1中没有特定生物标记或生物标记的小组必须包括在任何分类器中。

试剂盒

表1，第7列的生物标记的任何组合可以使用合适的试剂盒进行检测，例如用于进行本文公开的方法。此外，任何试剂盒均可含有如本文所述的一种或多种可检测标记，例如荧光部分等。

在一个实施方案中，如本文进一步描述，试剂盒包括：(a)一种或多种捕获试剂(例如至少一种SOMA聚体或抗体)，用于检测生物样品中的一种或多种生物标记，其中所述生物标记包括表1，第7列中阐述的生物标记中的任何，和任选的(b)一种或多种软件或计算机程序产品，用于将由其获得生物样品的个体分类为具有或不具有CV事件危险增加，或者用于测定个体具有CV事件危险增加的似然性。可替代地，代替一种或多种计算机程序产品，可以提供用于通过人手动进行上述步骤的一种或多种说明书。

固体载体与相应捕获试剂和信号产生材料的组合在本文中被称为“检测装置”或“试剂盒”。试剂盒还可以包括关于使用装置和试剂、处理样品且分析数据的说明书。进一步地，试剂盒可以与计算机系统或软件一起使用，以分析且报道生物样品的分析结果。

试剂盒还可以含有一种或多种试剂(如增溶缓冲液、去污剂、洗涤剂或缓冲液)，用于加工生物样品。本文所述的试剂盒中的任何还可以包括例如缓冲液、封闭剂、质谱法基质材料、抗体捕获剂、阳性对照样品、阴性对照样品、软件和信息例如方案、指导和参考数据。

在一个方面，本发明提供了分析CV事件危险状态的试剂盒。试剂盒包括对于选自表1，第7列的生物标记特异性的一种或多种SOMA聚体的PCR引物。试剂盒可以进一步包括生物标记的使用和生物标记与CV事件危险预测的关联的说明书。试剂盒还可以包括DNA阵列，其含有对于选自表1，第7列的生物标记特异性的一种或多种SOMA聚体的补体、用于扩增或分离样品DNA的试剂和/或酶。试剂盒可以包括用于实时PCR的试剂，例如TaqMan探针和/或引物和酶。

例如，试剂盒可以包含：(a)试剂，其包含至少用于定量测试样品中的一种或多种生物标记的捕获试剂，其中所述生物标记包含表1，第7列中阐述的生物标记或者本文所述的任何其他生物标记或生物标记组，和任选的(b)一种或多种算法或计算机程序，用于进行下述步骤：比较测试样品中定量的每种生物标记的量与一个或多个预定截断，并且基于所述比较指定关于定量的每种生物标记的评分，组合关于定量的每种生物标记的指定评分以获得总评分，比较总评分与预定评分，以及使用所述比较测定个体是否具有CV事件危险增加。可替代地，代替一种或多种算法或计算机程序，可以提供用于通过人手动进行上述步骤的一种或多种说明书。

计算机方法和软件

一旦选择生物标记或生物标记组，诊断个体的方法就可以包括下述步骤：1)收集或以其他方式获得生物样品；2)进行分析方法以检测且测量生物样品中的生物标记或组中的生物标记；3)进行用于收集生物标记值的方法所需的任何数据规范化或标准化；4)计算标记评分；5)组合标记评分以获得总诊断或预测评分；和6)报告个体的诊断或预测评分。在这种方法中，诊断或预测评分可以是由所有标记计算的总和测定的单一数目，将该数目与指示疾病存在或不存在的预设阈值比较。或者，诊断评分可以是一系列条，其各自代表生物标记值，并且可以将应答模式与预设模式比较，用于测定疾病、状况或事件危险增加(或不增加)的存在或不存在。

本文所述方法的至少一些实施方案可以使用计算机实现。计算机系统100的例子在图4中示出。参考图4，显示了包括经由总线108电联接的硬件元件的系统100，所述硬件元件包括处理器101、输入装置102、输出装置103、存储装置104、计算机可读存储介质读取器105a、通讯系统106、加工加速(例如DSP或专用处理器)107和存储器109。计算机可读存储介质读取器105a与计算机可读存储介质105b进一步联接，该组合全面地代表远程、局域、固定和/或可移动的存储装置加上存储介质、存储器等，用于暂时和/或更永久地含有计算机可读信息，其可以包括存储装置104、存储器109和/或任何其他此类可存取系统100资源。系统100还包括软件元件(显示为目前定位于工作存储器191内)，包括操作系统192及其他代码193，例如程序、数据等等。

参考图4，系统100具有广泛的灵活性和可配置性。因此，例如单一体系结构可以用于实现一个或多个服务器，其可以依照目前期望的方案、方案变化、扩展等进一步配置。然而，本领域技术人员应当了解可以依照更具体的应用要求更好地利用实施方案。例如，一个或多个系统元件可以作为系统100部件内(例如在通讯系统106内)的子元件实现。还可以使用定制的硬件和/或特定元件可以在硬件、软件或两者中实现。进一步地，虽然可以采用与其他计算装置例如网络输入/输出装置(未示出)的连接，但应当理解还可以利用与其他计算装置的有线、无线、调制解调器和/或其他一种或多种连接。

在一个方面，该系统可以包括含有CV事件危险预测特征性生物标记的特点的数据库。生物标记数据(或生物标记信息)可以用作计算机的输入以用作计算机执行方法的部分。生物标记数据可以包括如本文所述的数据。

在一个方面，该系统进一步包括一个或多个装置，用于将输入数据提供给一个或多个处理器。

该系统还包括用于存储分级数据元件的数据集的存储器。

在另一个方面，用于提供输入数据的装置包括用于检测数据元件的特征的检测器，例如质谱仪或基因芯片读取器。

该系统另外可以包括数据库管理系统。用户请求或查询可以通过数据库管理系统理解的适当语言进行格式化，该数据库管理系统处理所述查询以从训练集合的数据库中提取有关信息。

该系统可以与网络连接，所述网络连接网络服务器和一个或多个客户端。网络可以是如本领域已知的局域网(LAN)或广域网(WAN)。优选地，服务器包括运行计算机程序产品(例如软件)所需的硬件，以访问数据库数据用于处理用户请求。

该系统可以包括操作系统(例如UNIX或Linux)，用于执行来自数据库管理系统的指令。在一个方面，操作系统可以在全球通讯网络例如因特网上操作，并利用全球通讯网络服务器来连接此类网络。

该系统可以包括包含图形显示界面的一个或多个装置，该图形显示界面包括界面元件例如按钮、下拉菜单、滚动条、用于输入文本的字段等等，如本领域已知的图形用户界面中常规发现的。用户界面上输入的请求可以传送给系统中的应用程序用于格式化，以在一个或多个系统数据库中搜索有关信息。用户输入的请求或查询可以以任何合适的数据库语言构建。

图形用户界面可以通过作为操作系统部分的图形用户界面代码生成，并且可以用于输入数据和/或显示输入的数据。加工数据的结果可以在界面上显示，在与该系统通讯的打印机上打印，存储在存储装置中，和/或在网络上传输或可以以计算机可读介质的形式提供。

该系统可以与输入装置通讯，用于将关于数据元件的数据提供给系统(例如表达值)。在一个方面，输入装置可以包括基因表达谱分析系统，包括如质谱仪、基因芯片或阵列读取器等等。

根据多个实施方案用于分析CV事件危险预测生物标记信息的方法和器械可以以任何合适方式实现，例如使用在计算机系统上操作的计算机程序。可以使用常规计算机系统，其包括处理器和随机存取存储器，例如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站。另外的计算机系统部件可以包括存储装置或信息储存系统，例如大容量存储系统和用户界面，例如常规显示器、键盘和跟踪装置。计算机系统可以是单机系统，或包括服务器和一个或多个数据库的计算机网络的部分。

CV事件危险预测生物标记分析系统可以提供完成数据分析的功能和操作，例如数据收集、处理、分析、报告和/或诊断。例如，在一个实施方案中，计算机系统可以执行计算机程序，该程序可以接收、存储、搜索、分析且报告关于CV事件危险预测生物标记的信息。计算机程序可以包括进行多种功能或操作的多个模块，例如用于处理原始数据且生成补充数据的处理模块，以及用于分析原始数据和补充数据以生成CV事件危险预测状态和/或诊断或危险计算的分析模块。CV事件危险状态的计算可以任选包括生成或收集任何其他信息，包括另外的生物医学信息、关于个体与疾病、状况或事件有关的状况，鉴定是否需要进一步测试，或另外评估个体的健康状态。

现在参考图5，可见依照公开实施方案的原理利用计算机的方法的例子。在图5中，示出了流程图3000。在方框3004中，可以检索个体的生物标记信息。例如在进行个体的生物样品的测试后，生物标记信息可以从计算机数据库中检索。生物标记信息可以包含生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表1，第7列中提供的生物标记的至少N种生物标记之一，其中N＝2-155。在方框3008中，计算机可以用于分类每个生物标记值。另外在方框3012中，基于多个分类可以作出关于个体具有CV事件危险增加的似然性的测定。可以将该指示输出至显示器或其他显示装置，从而使得它可由个人观看。因此，例如该指示可以在计算机的显示屏或其他输出装置上显示。

现在参考图6，经由流程图3200可以举例说明依照另一个实施方案的利用计算机的替代方法。在方框3204中，可以利用计算机检索关于个体的生物标记信息。生物标记信息包含生物标记值，其对应于选自表1，第7列中提供的生物标记的生物标记。在方框3208中，可以用计算机进行生物标记值的分类。另外在方框3212中，基于分类可以作出关于个体具有CV事件危险增加的似然性的指示。可以将该指示输出至显示器或其他显示装置，从而使得它可由个人观看。因此，例如该指示可以在计算机的显示屏或其他输出装置上显示。

本文所述的一些实施方案可以这样实现，以便包括计算程序产品。计算机程序产品可以包括具有在介质中收录的计算机可读程序代码的计算机可读介质，用于促使应用程序在具有数据库的计算机上执行。

如本文使用的，“计算机程序产品”指以自然或程序设计语言语句形式的组织化的指令集合，其包含在任何性质的物理介质上(例如书写、电子、磁性、光学或者其他方式)，并且可以与计算机或其他自动化数据处理系统一起使用。当由计算机或数据处理系统执行时，此类程序设计语言语句促使该计算机或数据处理系统依照语句的特定内容起作用。计算机程序产品包括但不限于：植入计算机可读介质中的源代码和目标代码和/或测试或数据文库中的程序。此外，使计算系统或数据处理设备装置能够以预选方式起作用的计算机程序产品可以以多种形式提供，包括但不限于原始源代码、汇编代码、目标代码、机器语言、前述的加密或压缩形式以及任何和所有等价物。

在一个方面，提供了用于CV事件危险评估的计算机程序产品。该计算机程序产品包括收录程序代码的计算机可读介质，所述程序代码可由计算装置或系统的处理器执行，所述程序代码包含：检索归于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包含生物标记值，所述生物标记值各自对应于生物样品中选自表1，第7列中提供的生物标记的至少N种生物标记之一，其中N＝2-155；以及执行分类方法的代码，所述分类方法根据生物标记值指示个体的CV事件危险状态。

在另外一个方面，提供了用于指示CV事件危险的似然性的计算机程序产品。该计算机程序产品包括收录程序代码的计算机可读介质，所述程序代码可由计算装置或系统的处理器执行，所述程序代码包含：检索归于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包含生物标记值，其对应于生物样品中选自表1，第7列中提供的生物标记的生物标记；以及执行分类方法的代码，所述分类方法根据生物标记值指示个体的CV事件危险状态。

虽然多个实施方案已作为方法或器械进行描述，但应当理解实施方案可以通过与计算机联接的代码，例如驻留在计算机上或可由计算机访问的代码实现。例如，软件和数据库可以用于实现上述方法中的许多。因此，除由硬件完成的实施方案之外，还应注意到这些实施方案可以通过使用此类制造物品完成，所述制造物品包括具有在其中收录的计算机可读程序代码的计算机可用介质，所述计算机可读程序代码促使本说明书中公开的功能的实现。因此，期望另外考虑在其程序代码方式中的实施方案同样由本专利加以保护。此外，实施方案可以收录为存储在实际上任何种类的计算机可读存储器中的代码，所述计算机可读存储器包括但不限于RAM、ROM、磁性介质、光学介质或磁光介质。甚至更一般地，实施方案可以在软件或硬件或其任何组合中实现，包括但不限于在通用处理器、微代码、PLA或ASIC上运行的软件。

还设想实施方案可以作为包括在载波中收录的计算机信号以及通过传输介质传播的信号(例如电信号和光信号)实现。因此，上述多种类型的信息均可以在结构例如数据结构中格式化，并且作为电信号通过传输介质传输，或存储在计算机可读介质上。

还应当注意，本文叙述的结构、材料和动作中的许多可以叙述为用于进行功能的方式或用于进行功能的步骤。因此，应当理解此类语言有权涵盖在本说明书内公开的所有此类结构、材料或动作及其等价物，包括通过引入作为参考的内容。

生物标记鉴定过程、本文公开的生物标记的利用和用于测定生物标记值的多种方法在上文关于CV事件危险评估详细描述。然而，过程的应用、鉴定的生物标记的用途和用于测定生物标记值的方法完全可应用于其他特定类型心血管状况、任何其他疾病或医学状况、或可能获益于或不获益于辅助医学治疗的个体的鉴定。

实施例

下述实施例仅提供用于举例说明性目的，并且不意图限制如由所附权利要求限定的本申请的范围。本文描述的所有实施例均使用本领域技术人员众所周知且常规的标准技术进行。下述实施例中描述的常规分子生物学技术可以如标准实验室手册中所述进行，所述标准实验室手册例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(2001)。

实施例1.样品的多路适体分析

本实施例描述用于分析样品和对照的多路适体测定法，用于鉴定表1中阐述的生物标记。样品分析的一般方案在图1A和1B中举例说明。通常在存活数据的医学研究中，Cox比例风险模型用于产生来自病理状态的多种协变量的危险评分。在这项工作中，我们已采用这种简单和众所周知的方法，以由Heart和Soul研究中的群体数据设计模型，所述模型例如根据这种弹性和广泛使用的Cox比例风险形式适合于应用于个别样品。通过获得相对于正常水平的生物标记测量的对数比，生物标记值如图1B中所示组合。Cox模型使用这些对数比的加权和的指数，以产生关于正常群体的危害比的估计值。

在这个方法中，对于每次溶液添加均更换移液器尖端。

另外，除非另有说明，否则大多数溶液转移和洗涤添加使用BeckmanBiomek Fxp的96孔头部。除非另有说明，否则手动移液的方法步骤使用十二通道P200Pipetteman(Rainin Instruments，LLC，Oakland，CA)。内部制备称为SB17的定制缓冲液，其包含40mM HEPES、100mM NaCl、5mMKCl、5mM MgCl2、1mM EDTA，pH7.5。除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。

1.适体原液的制备

在1x SB17，0.05％Tween-20中以2x浓度制备关于5％、0.316％和0.01％血清的定制适体原液。

将这些溶液贮存于-20℃下直至使用时。测定法当天，使每种适体混合物在37℃下解冻10分钟，置于沸水浴中10分钟，并且允许冷却至25℃20分钟，伴随在每个加热步骤之间的剧烈混合。在加热-冷却后，将55μl每种2x适体混合物手动移液到96孔Hybaid平板内，并且将平板用箔密封。最终结果是具有5％、0.316％和0.01％适体混合物的三块96孔、箔密封的Hybaid平板。个别适体浓度为2x终浓度或1nM。

2.测定样品制备

将贮存于-80℃下的100％血清的冷冻等分试样置于25℃水浴中10分钟。将解冻样品置于冰上，轻轻涡漩(设为4)8秒，并且随后再置于冰上。

在4℃下，通过使用50μL8通道跨越移液器(spanning pipettor)将8μL样品转移到96孔Hykiid平板内，制备10％样品溶液(2x终浓度)，每个孔含有72μL适当的样品稀释剂(对于血清，1x SB17、0.06％Tween-20、11.1μMZ-block_2、0.44mM MgCl₂、2.2mM AEBSF、1.1mM EGTA、55.6uM EDTA)。将这块平板贮存于冰上，直至在Biomek FxP机器人上开始下一个样品稀释步骤。

为了开始样品和适体平衡，将10％样品平板短暂离心并置于BiomekFxP上，在其中用96孔移液器通过上下移液将它混合。随后通过将6μL的10％样品转移到具有2mM AEBSF的89μL1xSB17、0.05％Tween-20内，制备0.632％样品平板(2x终浓度)。接下来，6μL所得到的0.632％样品在184μL1xSB17、0.05％Tween-20内的稀释制备0.02％样品平板(2x终浓度)。在Beckman Biomek Fxp上完成稀释。在每次转移后，通过上下移液将溶液混合。随后，通过将55μL样品加入55μL适当的2x适体混合物中，将3块样品稀释平板转移至其各自的适体溶液。样品和适体溶液通过上下移液在机器人上混合。

3.样品平衡结合

将样品/适体平板用硅帽垫密封，并且在进行至捕获1步骤前，置于37℃温箱中3.5小时。

4.捕获2珠平板的制备

将MyOne(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)链霉抗生物素蛋白质C1珠的11mL等分试样用等体积的20mM NaOH洗涤2次(对于每次洗涤，温育5分钟)，用等体积的1x SB17、0.05％Tween-20洗涤3次，并重悬浮于11mL1x SB17、0.05％Tween-20中。使用12-通道移液器，将50μL该溶液手动移液到96孔Hyhid平板的每个孔内。随后将平板用箔覆盖，并贮存于4℃下用于测定法中。

5.捕获1珠平板的制备

将三块0.45μm Millipore HV平板(Durapore membrane，目录#MAHVN4550)100μL1x SB17、0.05％Tween-20平衡至少10分钟。平衡缓冲液随后通过平板过滤，并且向每个孔内加入133.3μL7.5％链霉抗生物素蛋白质-琼脂糖珠浆(在1x SB17、0.05％Tween-20中)。为了在将链霉抗生物素蛋白质-琼脂糖珠转移到滤板内时使其保持悬浮，将珠溶液用200μL，12通道移液器手动混合，在移液事件之间至少6次。在将珠跨越3块滤板分配后，施加真空以去除珠上清液。最后，将珠在滤板中用200μL1x SB17、0.05％Tween-20洗涤，并且随后重悬浮于200μL1x SB17、0.05％Tween-20中。将滤板的底部吸干，并将平板贮存用于测定法中。

6.装载Cytomat

使Cytomat装载有所有尖端、平板、槽中的所有试剂(除了在加入平板前立即新鲜制备的NHS-生物素试剂之外)、3块制备的捕获1滤板和1块制备的MyOne平板。

7.捕获1

在3.5小时平衡时间后，将样品/适体平板从温箱中取出，离心约1分钟，去除帽垫覆盖，并置于Beckman Biomek Fxp的平台(deck)上。启动Beckman Biomek Fxp程序。除非另有说明，否则捕获1中的所有后续步骤均由Beckman Biomek Fxp机器人完成。在该程序内，对捕获1滤板施加真空以去除珠上清液。将各100微升的5％、0.316％和0.01％平衡结合反应加入其各自的捕获1滤板，并且使用平台型(on-deck)定轨振荡器以800rpm将每块板混合10分钟。

经由真空过滤去除未结合的溶液。通过分配溶液并立即抽真空以使溶液通过平板过滤，将捕获1珠用在1x SB17、0.05％Tween-20中的190μL100μM生物素洗涤，随后用5x190μL1x SB17、0.05％Tween-20洗涤。

8.加标签

将在无水DMSO中的100mM NHS-PEO4-生物素等分试样(贮存于-20℃下)在37℃下解冻6分钟，并且随后在手动加入平台型槽前立即用加标签缓冲液(pH7.25的SB17、0.05％Tween-20)稀释1:100，由此将100μLNHS-PEO4-生物素分配到每块捕获1滤板的每个孔内。允许这个溶液在定轨振荡器上伴随捕获1珠振荡以800rpm温育5分钟。

9.动力学攻击和光切割

通过真空过滤去除加标签反应，并且通过向捕获1平板中加入在1xSB17、0.05％Tween-20中的150μL20mM甘氨酸来猝灭反应。经由真空过滤去除甘氨酸溶液，并且将另外1500μL20mM甘氨酸(在1x SB17、0.05％Tween-20中)加入每块平板，并在通过真空过滤去除前，在定轨振荡器上以800rpm温育1分钟。

随后通过加入1x SB17、0.05％Tween-20洗涤捕获1平板的孔，随后立即为真空过滤，并且随后在真空过滤前加入190μL1x SB17、0.05％Tween-20，伴随以800rpm的1分钟振荡。这两个洗涤步骤再重复两次，除了最后一次洗涤不通过真空过滤去除之外。在最后一次洗涤后，将平板置于1mL深孔平板的顶部并从平台上取出，用于以1000rpm下离心1分钟，以在洗脱前从琼脂糖珠中尽可能多地去除多余体积。

将平板放回到Beckman Biomek Fxp上，并向滤板的每个孔内加入在1xSB17、0.05％Tween-20中的85μL10mM DxSO4。

将滤板从平台上取出，置于在BlackRay(Ted Pella，Inc.，Redding，CA)光源下的Variomag Thermoshaker(Thermo Fisher Scientific，Inc.，ffaltham，ΜΑ)上，并且在以800rpm振荡的同时照射5分钟。在5分钟温育后，使平板旋转180度且伴随振荡多照射5分钟。

通过首先将5％捕获1滤板置于1mL深孔平板的顶部并以1000rpm离心1分钟，将光切割的溶液从每块捕获1平板顺次洗脱到共同深孔平板内。随后，将0.316％和0.01％捕获1平板顺次离心到相同的深孔平板内。

10.捕获2珠捕获

将含有合并的捕获1洗脱物的1mL深孔块置于Beckman Biomek Fxp的平台上用于捕获2。

机器人将光切割洗脱物全部从1mL深孔平板转移到含有先前制备的捕获2MyOne磁珠的Hyhid平板上(在经由磁性分离去除MyOne缓冲液后)。

在以1350rpm振荡的同时，使溶液在Variomag Thermoshaker(ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)上在25℃下温育5分钟。

机器人将平板转移到平台型磁性分离器站。在去除并弃去上清液前，将平板在磁体上温育90秒。

11.37℃30％甘油洗涤

将捕获2平板移到平台型热振荡器，将75μL1x SB17、0.05％Tween-20转移到每个孔。将平板在1350rpm和37℃下混合1分钟，以重悬浮并加温珠。在37℃下，向捕获2平板的每个孔中转移75μL60％甘油，并将平板继续在1350rpm和3℃下混合另一分钟。机器人将平板转移到37℃磁性分离器，在其中将其在磁体上温育2分钟，并且随后机器人去除并弃去上清液。将这些洗涤再重复2次。

从捕获2珠中去除第三次30％甘油洗涤液后，将150μL1x SB17、0.05％Tween-20加入每个孔内，并在37℃磁体上通过磁性分离去除前，在37℃下以1350rpm振荡温育1分钟。

在磁性分离前，以1350rpm振荡的同时，使用150μL1x SB19、0.05％Tween-20伴随1分钟温育将捕获2珠最后洗涤一次。

12.捕获2珠洗脱和中和

通过向每个孔加入具有1M NaCl、0.05％Tween-20的105μL100mMCAPSO，从捕获2珠中洗脱适体。使珠伴随以1300rpm的振荡与这种溶液一起温育5分钟。

随后，在将63μL洗脱物转移到在每个孔含有7μL500mM HCl、500mM HEPES、0.05％Tween-20的新96孔平板前，将捕获2平板置于磁性分离器上90秒。在转移后，通过将90μL上下移液五次来机器化混合溶液。

13.杂交

Beckman Biomek Fxp将20μL中和的捕获2洗脱物转移到新鲜的Hybaid平板，并且向每个孔加入含有10x杂交对照掺料的6μL10x AgilentBlock。接下来，将30μL2x Agilent杂交缓冲液手动移液到含有中和样品和封闭缓冲液的平板的每个孔内，并且通过缓慢地手动将25μL上下移液15次将溶液混合，以避免大量气泡形成。将平板以1000rpm旋转1分钟。

定制Agilent微阵列载玻片(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)设计为含有与适体随机区加上一些引物区互补的探针。对于大多数适体，凭经验测定互补序列的最佳长度，并且范围为40-50个核苷酸。对于以后的适体，缺省选择46聚体互补区。探针由聚T接头与载玻片表面连接用于60个核苷酸的总探针长度。

将密封载玻片置于Agilent杂交室内，将各40μL含有杂交和封闭溶液的样品手动移液到每个垫圈内。以预期使气泡形成降到最低的方式使用8通道可调跨越移液器。随后将其条形码朝上的定制Agilent载玻片缓慢下降到密封载玻片上(关于详细描述，参见Agilent手册)。

将杂交室上部置于载玻片/背衬夹心上，并将夹紧托架滑动到整个组件上。通过牢固地转动螺旋来夹紧这些组件。

目视检查每个载玻片/背衬载玻片夹心，以确保溶液气泡可以在样品内自由移动。如果气泡无法自由移动，则轻拍杂交室以释放位于垫圈附近的气泡。

将组装的杂交室在Agilent杂交炉中在60℃下以20rpm旋转温育19小时。

14.杂交后洗涤

将约400mL Agilent洗涤缓冲液1置于两个分开的玻璃染色皿的每一个内。将一个染色皿置于磁力搅拌板上，并将载玻片架和搅拌棒置于缓冲液内。

通过将搅拌棒置于空玻璃染色皿内，制备用于Agilent洗涤2的染色皿。

预留第四个玻璃染色皿，用于最终乙腈洗涤。

拆开六个杂交室的每一个。逐个地将载玻片/背衬夹心从其杂交室中取出，并浸入含有洗涤1的染色皿中。使用一对镊子将载玻片/背衬夹心撬开，同时仍浸没微阵列载玻片。将载玻片快速转移到磁力搅拌板上的洗涤1染色皿中的载玻片架内。

将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并且将载玻片温育5分钟。

当洗涤1剩余一分钟时，将在温箱中预热至37℃的洗涤缓冲液2加入第二个制备的染色皿。将载玻片架快速转移到洗涤缓冲液2中，并且通过将其刮取到染色皿的顶部上，去除架底部上的任何过量缓冲液。将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并将载玻片温育5分钟。将载玻片架从洗涤2中缓慢拉出，花费大约15秒以从溶液中取出载玻片。

对于在洗涤2中剩余的一分钟，将乙腈(ACN)加入第四个染色皿。将载玻片架转移到乙腈染色皿。将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并将载玻片温育5分钟。

将载玻片架从ACN染色皿中缓慢拉出，并置于吸水巾上。载玻片的底部边缘快速干燥，并将载玻片置于干净的载玻片盒内。

15.微阵列成像

将微阵列载玻片置于Agilent扫描仪载玻片支架内，并根据制造商说明书装载到Agilent微阵列扫描仪内。

将载玻片在Cy3通道中以5μm分辨率在100％PMT设定下成像，并且XRD选项以0.05启用。所得到的tiff图像使用Agilent特点抽取软件版本10.5进行处理。

实施例2.生物标记鉴定

进行潜在CV事件生物标记的鉴定，用于预测在San Francisco Bay Area的个体群体中的CV事件危险。参加者必须满足该研究的下述入选标准之一：先前的心肌梗塞、在1根或多根冠状血管中大于50％狭窄的血管造影证据、通过跑步机的运动诱发的缺血或核测试、或先前冠状动脉血运重建术。淘汰标准包括近期心肌梗塞、不能绕1个街区走动和计划搬迁。收集空腹血样，并且将血清和血浆等分试样贮存于-70℃下。如实施例1中所述的多路SOMA聚体亲和测定法用于测量且报道关于这987份样品各自中的1034种分析物的RFU值。

为了鉴定与事件发生相关的生物标记集合，使用PCA来分析组合的对照和早期事件样品集合。PCA就由所有样品之间的最强变化限定的轴展示样品，不考虑病例或对照结果，因此减轻过拟合病例和对照之间的区分的危险。(“对照”指满足入围标准中的至少一个，但在研究过程期间不具有CV事件的个体；“病例”指满足入围标准中的至少一个，但在研究过程期间的确具有CV事件的个体。)虽然观察到的病例和对照之间的分离不大，但它在第二种主成分上发生，对应于该样品集中的总变化的约10％，其指示潜在生物变异是相对简单定量的(图2A)。

在接下来的分析集合中，生物标记可以就样品间差异的那些组分进行分析，所述组分对于对照样品和早期事件样品之间的分离是特异性的。尽管对于对照集合单独进行维度减少，以测定由对照样品之间的差异跨越的变化的多变量多维空间，但在对照集合中的样品和早期事件样品集合两者中的样品对于对照样品之间测定的变化空间是令人泄气的，残留变化在使病例与对照分开的那些组分中富集。这被称为DSGA方法。病例与早期事件的分离可以沿水平轴观察到(图2B)(Nicolau M，Tibshirani R，AL，Jeffrey SS.Disease-specific genomic analysis：Identifyingthe signature of pathologic biology.Bioinformatics.2007；23:957–965.)。

为了避免蛋白质预测力与特定选择样品的特异体质特点的过拟合，采取交叉验证和维度减少方法。这种关联组分测定是维度减少步骤，通过使来自超过1000种蛋白质的完全蛋白质选单的独立变量数目减少下至几个主成分，其不仅组合跨越蛋白质的信息，还减轻过拟合的可能性(在这项工作中，我们仅检查第一种主成分)。这些蛋白质用于产生与事件危险相关的蛋白质变化的关联组分。使用SPCA，我们发现具有155种蛋白质的列表，使用这种交叉验证的维度减少技术，所述155种蛋白质与事件危险统计相关。在SPCA(有监督的主成分分析)的这种应用中，我们还允许对应于随机SOMA聚体序列的测试蛋白质信号以及对应于非人蛋白质的信号，其不存在于样品中。这10-20种已知非生物学信号无一由SPCA在155种蛋白质中加以选择(表1)。使用交叉验证SPCA方法的这个步骤对于针对假阳性蛋白质标记关联筛查是重要的。Tibshirani等人(Bair,E.和Tibshirani,R.(2004)Semi-supervised methods to predict patient survival fromgene expression data.PLOS Biol.，2，511–522)中的方法尤其通过使用预验证的交叉验证方法和PCA中固有的维度减少保护不受假发现。来自SPCA的155种蛋白质列表用于使用不同技术检查后续分析，以检测在来自SPCA的155种蛋白质列表中不含有的蛋白质标记的假发现。

实施例3.个别蛋白质与时间与CV事件的关系的单变量分析

Cox比例风险模型(Cox，David R(1972)."Regression Models andLife-Tables".Journal of the Royal Statistical Society.SeriesB(Methodological)34(2)：187–220))广泛用于医用统计学中。Cox回归避免特定时间函数与累积存活的拟合，并且相反采用涉及基线风险函数(其可以随着时间而改变)的相对危险模型。基线风险函数描述关于所有个体的存活时间分布的普通形状，而相对危险给出协变量值(例如单一个体或组)集合的风险水平，作为基线风险的倍数。相对危险在Cox模型中对于时间是恒定的。

该方法涉及使1092个简单单变量Cox模型与所有信号拟合。四十六种蛋白质具有好于10^-14的P值(Wald，Abraham.(1943).A Method of EstimatingPlane Vulnerability Based on Damage of Survivors.Statistical Research Group，Columbia University))。大量高度显著蛋白质起初是令人惊讶的，然而，肾在心血管疾病中的牵涉暗示肾小球滤过率(GFR)中的改变。GFR中的降低将增加具有非零肾清除率的所有蛋白质。

有用的模型(在技术复杂性和实验室成本方面)将比表2中所示的46种蛋白质的完全列表更节省。另外如PCA中可见，许多蛋白质可能是高度关联的，有效模型将考虑这点。在两个步骤中将46种高度显著蛋白质的列表过滤下至如表3中所示的10种蛋白质。首先，使列表限制于20种蛋白质，其给出具有大于0.37的量级的系数(等价于蛋白质信号中的倍增的30％风险改变)。这个步骤在使用所有46种蛋白质的单一多变量Cox模型上进行。(在拟合Cox模型前获得蛋白质测量的天然对数。因此Cox系数的指数对应于蛋白质测量中的e-倍(2.71)改变的危害比。)

通过要求P值应比0.01更显著，下一个步骤将20种蛋白质过滤下至九种。该步骤压制共变蛋白质且允许独立蛋白质贡献。对生物标记选择作出最终调整，因为补体系统的最后共同通路中的膜攻击复合物的成员C9判断为在其发信号中太不特异性，这是不能由该研究单独决定的事情，因为该研究产生为明确证实CV事件危险。去除C9并且所有剩余蛋白质在其位置处进行评估。替代蛋白质在Wald检验评分中的改善上进行排序，并且KLK3.SerpinA3接近于与C9一样有效。

关于心血管危险的这种十标记模型的卡普兰迈耶存活曲线显示于图3A-4F中(表3)。

实施例4.个别蛋白质与特定类型CV事件的关系的单变量分析

心血管事件在很大程度上分成两类：血栓形成和CHF。区分血栓形成和CHF危险在指导治疗中具有医学效用，例如在抗血栓形成和利尿药用药之间选择。尽管许多生物学在事件的血栓形成和CHF种类之间共享，但血栓形成事件特别涉及血液凝固的生物学(如由名称血栓形成暗示的)。使用在Cox比例风险模型中鉴定的表3的十种蛋白质(实施例3)，能够寻找与凝固联系的信号和与组织重塑联系的信号。为了测定CHF和血栓形成事件之间的任何区分信号，对于CHF和血栓形成事件分别标绘有关卡普兰迈耶曲线。

血小板或凝血细胞是凝固生物学中的关键参与者。GPVI是血小板膜糖蛋白，并且对于这种蛋白质，在图8中对于CHF和血栓形成事件进行与无事件存活的相关的分析。图8A显示作为群体分布的四分位数标绘的，无血栓形成事件存活与GPVI水平的强相关。图8B显示GPVI的四分位数与CHF事件的无事件存活不相关。

与GPVI形成对比，MATN2(matrilin2)是细胞外基质相关蛋白质。图9A显示MATN2的四分位数与血栓形成事件的危险不相关，而图9B显示MATN2和CHF事件之间的强相关。关于在群体的第4个四分位数中具有MATN2的个体的无事件存活比前三个四分位数显著更差。

总之，该实施例的结果证实我们的十蛋白质标记可以在血液取样后经过数年的危险方面区分血栓形成事件和CHF事件。

实施例5.血管生成素2和CHRDL1在用他汀用药的个体中的有用性。

许多个体由他汀用药，具有已知心血管疾病以及许多没有具体心血管状况的个体，例如具有高LDL胆固醇的那些个体。这些有力药物改变许多生物标记区分处于危险中的个体与不处于危险中的个体的能力。在这个群体中起作用的生物标记是有价值的。

图10显示在使用他汀的那些对象中，血管生成素2对于预测高危个体中的CV事件仍是强烈有用的。图10显示采取他汀用药的所有538个对象的卡普兰迈耶曲线，并且举例说明与不在血管生成素2的第4个四分位数中的对象相比较，在血管生成素2的群体分布的第4个四分位数中的个体以增加的比率患有心血管事件。因此，尽管用他汀治疗的效应，血管生成素2是心血管事件危险的有用生物标记。

图11显示在使用他汀的那些对象中，CHRDL1也与这个高危群体中的心血管事件危险相关。图11显示采取他汀用药的所有538个对象的卡普兰迈耶曲线。它举例说明CHRDL1与由他汀用药治疗的个体中的心血管事件的无事件存活相关。因此，尽管用他汀治疗的效应，CHRDL1是心血管事件危险的有用生物标记。

表1：CV事件生物标记

表2：46种生物标记的列表

表3：10种生物标记的列表

表4：Heart&Soul研究群体事件时间和类型

Claims

1.一种用于就CV事件危险评估筛查个体的方法，所述方法包括：

在来自个体的生物样品中检测各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值，以便基于所述生物标记值预测CV事件的危险，并且其中N＝2–155。

2.权利要求1的方法，其中所述生物标记选自表2，并且N＝2-46。

3.权利要求1的方法，其中所述生物标记选自表3，并且N＝2-10。

4.权利要求1的方法，其中检测所述生物标记值包括进行体外测定法。

5.权利要求4的方法，其中所述体外测定法包括对应于所述生物标记各自的至少一种捕获试剂，并且进一步包括从SOMA聚体、抗体和核酸探针中选择至少一种捕获试剂。

6.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自全血、干血点、血浆、血清和尿。

7.根据权利要求1的方法，其中基于所述生物标记值和对应于所述个体的至少一项另外的生物医学信息，就CV事件危险评估个体，其中所述至少一项另外的生物医学信息独立地选自以下组中：

(a)对应于选自下述的心血管危险因素存在的信息：先前的心肌梗塞、在1根或多根冠状血管中大于50％狭窄的证据、通过跑步机的运动诱发的缺血或核测试或先前冠状动脉血运重建术中，

(b)对应于所述个体的物理描述词的信息，

(c)对应于所述个体的重量中的改变的信息，

(d)对应于所述个体的种族性的信息，

(e)对应于所述个体的性别的信息，

(f)对应于所述个体的吸烟史的信息，

(g)对应于所述个体的饮酒史的信息，

(h)对应于所述个体的职业史的信息，

(i)对应于所述个体的心血管疾病或其他循环系统状况的家族史的信息，

(j)对应于所述个体中至少一种遗传标记的存在或不存在的信息，所述遗传标记与所述个体或所述个体的家族成员中的心血管疾病的更高危险关联，

(k)对应于所述个体的临床症状的信息，

(l)对应于其他实验室测试的信息，

(m)对应于所述个体的基因表达值的信息，和

(n)对应于所述个体的已知心血管危险因素例如高饱和脂肪、高盐、高胆固醇的饮食消费的信息，

(o)对应于通过选自下述的技术获得的所述个体的成像结果的信息：心电图、超声心动图、内膜-中膜厚度的颈动脉超声、流量介导的舒张、脉搏波速度、踝-臂指数、负荷超声心动图、心肌灌注成像、通过CT的冠状动脉钙化、高分辨率CT血管造影术、MRI成像及其他成像模式，和

(p)关于所述个体用药的信息。

8.一种用于评估在五年时间段内的未来心血管(CV)事件危险的生物标记组，所述组包含选自表1的生物标记的N种生物标记，其中N＝2–155。

9.权利要求8的生物标记组，其中所述生物标记选自表2，其中N＝2-46。

10.权利要求8的生物标记组，其中所述生物标记选自表3，其中N＝2-10。

11.一种通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险，用于筛查群体中的个体的方法，所述方法包括：

在来自所述个体的生物样品中检测血管生成素2的生物标记值，和

基于所述血管生成素2生物标记值测定未来CV事件的危险。

12.权利要求11的方法，其进一步包括在测定步骤前的步骤，所述在测定步骤前的步骤包括：

提供关于所述个体的他汀使用的信息，和

其中所述的未来CV事件危险的测定基于所述血管生成素2生物标记值和所述他汀信息。

13.权利要求11的方法，其进一步包括：

在所述生物样品中检测选自MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT及其组合的生物标记的生物标记值。

14.权利要求11的方法，其进一步包括：

在来自所述个体的所述生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表3的生物标记的N种生物标记，其中N＝2-10。

15.权利要求13的方法，其进一步包括：

16.一种用于通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险而筛查群体中的个体的生物标记组，所述组包含：

血管生成素2生物标记。

17.权利要求16的组，其中所述组进一步包含选自MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT的一种或多种生物标记及其任何组合。

18.权利要求16的组，其中所述组进一步包含选自表3的一种或多种生物标记。

19.权利要求17的组，其中所述组进一步包含选自表3的一种或多种生物标记。

20.一种通过评估在5年时期内的未来CV事件危险筛查个体的方法，其中所述评估包括血管生成事件或充血性心力衰竭(CHF)事件的区别预后，所述方法包括：

在来自所述群体个体的生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于用于血栓形成事件预后的GPVI生物标记和用于CHF事件预后的MATN2生物标记。

21.权利要求20的方法，其中所述生物样品进一步用于检测关于N种生物标记的生物标记值，所述N种生物标记选自表3中阐述的生物标记，其中N＝3-10。

22.权利要求20的方法，其中所述血栓形成事件包含心肌梗塞(MI)、短暂性脑缺血发作(TIA)、中风、急性冠脉综合征和需要冠状动脉重建术。

23.一种用于通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险而筛查群体中的个体的生物标记组，所述组包含：

GPVI生物标记；和

MATN2生物标记。

24.权利要求23的组，其中所述组进一步包含选自表3中阐述的生物标记的N种生物标记中的一种或多种。

25.一种用于通过评估或预后在5年时期内的未来CV事件危险而筛查群体中的个体的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

对于所述个体的生物样品中的生物标记特异性的至少一种捕获试剂；和

其中所述捕获试剂包含信号生成材料。

26.权利要求25的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自下述的一种或多种生物标记：

a)血管生成素2生物标记；

b)血管生成素2生物标记和选自MMP7、CHRDL1、MATN2、PSA-ACT及其任何组合的任何生物标记；

c)选自GPVI生物标记、MATN2生物标记及其任何组合的生物标记；

d)选自表3中阐述的生物标记的N种生物标记，其中N＝2-10；和

其任何组合。

27.权利要求25的试剂盒，其中所述捕获试剂选自SOMA聚体、抗体和核酸探针。

28.权利要求25的试剂盒，其进一步包含说明书或者一种或多种软件或计算机程序产品，用于将由其获得所述生物样品的个体分类为具有或不具有增加的CV事件危险。

29.一种用于评估群体中的5年时间段内的未来心血管(CV)事件危险的方法，其包括：

在来自所述群体个体的生物样品中检测生物标记值，所述生物标记值各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一，其中所述个体基于所述生物标记值就CV事件危险进行评估，并且其中N＝2-155。

30.权利要求29的方法，其中所述生物标记选自表2，并且N＝2-46。

31.权利要求29的方法，其中所述生物标记选自表3，并且N＝2-10。

32.权利要求29的方法，其进一步包括：

基于选自下述的特征选择所述群体：

a)具有或不具有心血管疾病的既往史的群体；和

b)具有或不具有遗传危险因素的群体，所述遗传危险因素包含突变、单核苷酸多态性和/或插入/缺失。

33.权利要求29的方法，其中评估个体的CV事件危险允许将他们分层为选自下述的类别：

a)增加或降低疾病管理程序的不同类别；

b)与人寿保险范围有关的不同危险类别；

c)与健康保险范围有关的不同危险类别；

d)关于伙伴关系的候选资格的不同类别；

e)关于进入CV治疗剂的临床试验内的合格性的不同类别；

f)与CV治疗剂或任何治疗剂的心血管安全有关的不同危险类别。

34.权利要求29的方法，其中检测所述生物标记值包括进行体外测定法。

35.权利要求34的方法，其中所述体外测定法包括对应于所述生物标记各自的至少一种捕获试剂，并且进一步包括从SOMA聚体、抗体和核酸探针中选择至少一种捕获试剂。

36.权利要求34的方法，其中所述生物样品选自全血、干血点、血浆、血清和尿。

37.一种用于评估心血管(CV)事件危险的计算机执行方法，所述方法包括：

在计算机上检索关于个体的生物标记信息，其中所述生物标记信息包含对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值；

用计算机进行所述生物标记值各自的分类；

基于多个分类指示所述个体的CV事件危险评估的结果；和

其中N＝2-155。

38.权利要求37的方法，其中所述生物标记选自表2，并且N＝2-46。

39.权利要求37的方法，其中所述生物标记选自表3，并且N＝2-10。

40.权利要求37的方法，其中指示所述个体的CV事件危险评估结果包括在计算机显示器上展示所述结果。

41.一种用于评估CV事件危险的计算机程序产品，所述计算机程序产品包括：

收录可由计算装置或系统的处理器执行的程序代码的计算机可读介质，所述程序代码包含：

检索归于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包含各自对应于选自表1的至少N种生物标记之一的生物标记值，其中所述生物标记在生物样品中检测到；和执行分类方法的代码，所述分类方法根据所述生物标记值指示个体的CV事件危险评估的结果；和

其中N＝2–155。

42.权利要求41的程序代码，其中所述生物标记选自表2，并且N＝2-46。

43.权利要求41的程序代码，其中所述生物标记选自表3，并且N＝2-10。

44.权利要求40的计算机程序产品，其中所述分类方法使用连续测量评分或指定至两个或更多个类别。