BR112021008262A2

BR112021008262A2 - Biomarcadores de aterosclerose subclínica

Info

Publication number: BR112021008262A2
Application number: BR112021008262-0A
Authority: BR
Inventors: Estefanía Núñez Sánchez; Jesús Vázquez Cobos; Valentín Fuster; Diego Martinez Lopez; José Luis Martin Ventura; Elena Bonzon Kulichenko; Enrique Calvo Alcocer
Original assignee: Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii (F.S.P.); Fundación Instituto De Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz; Universidad Autónoma de Madrid
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-10-26
Also published as: CN113287019A; JP2022512949A; US20220187312A1; ES2932268T3; EP3874275B1; EP3874275A1; WO2020089282A1

Abstract

biomarcadores de aterosclerose subclënica. a presente invenção se refere a pigr, apoa, hpt, hep2, c5, itih1 e igha2 como biomarcadores para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica e a métodos e kits que usam os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “BIOMARCADORES DE ATEROSCLEROSE SUBCLÍNICA” Campo da Invenção

[001] A presente invenção pertence ao campo de diagnósticos. Em particular, se refere a biomarcadores de proteínas para triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica e métodos e kits que usam os mesmos.

Fundamentos da Invenção

[002] Um dos desafios associados ao gerenciamento clínico de doença aterosclerótica é que esta é comumente diagnosticada muito tarde, normalmente quando a condição está muito avançada e as lesões já são irreversíveis, ou quando causou sinais clínicos ou eventos em órgãos ou territórios vascularizados pelas artérias doentes.

[003] A prevenção primária é atualmente baseada na avaliação de fatores de risco modificáveis de acordo com recomendações padronizadas. Contudo, constatou-se que a cada nível de exposição de fator de risco, existe variação substancial na quantidade de aterosclerose (Fernandez-Ortiz A et al., Em Heart J 2013; 166:990-8).

[004] Medição não invasiva por métodos de imageamento de carga aterosclerótica subclínica em pessoas de meia idade tem o potencial de melhorar a avaliação de risco cardiovascular e pode contribuir para uma prevenção mais efetiva de eventos cardiovasculares. Mesmo assim, as diretrizes mais recentes (Perk J. et al., Eur Heart J 2012; 33:1635-701) apenas recomendam esses testes de imageamento em adultos assintomáticos considerados em risco moderado (Fernandez-Ortiz A et al. 2013).

[005] O estudo da Progressão e Detecção Precoce de Aterosclerose Subclínica (PESA) é um estudo de coorte longitudinal com objetivo de caracterizar a prevalência de aterosclerose subclínica e os determinantes associados com a presença e progressão da doença em uma população de meia idade assintomática.

[006] Curiosamente, uma proporção substancial de indivíduos assintomáticos classificados como de baixo risco com base nas pontuações de risco cardiovasculares tradicionais (ou seja, 10-y FHS) mostrou ter, no estudo de PESA, aterosclerose extensiva (Fernandez-Friera L et al., Circulation. 2015; 131:2104-2113).

[007] Os autores executaram uma análise visando identificar diferenças entre participantes com aterosclerose subclínica em um território único (doença focal) e aqueles com múltiplos territórios (doença intermediária ou generalizada). Os resultados dessa análise evidenciaram uma associação estatisticamente significativa entre a extensão de aterosclerose e pontuações de risco cardiovascular (CVR) e a maioria dos fatores de CVR. Fernandez-Friera L et al.

2015 adicionalmente revelaram que a maioria dos indivíduos classificados como de alto risco pelas escalas de pontuação de fatores de risco tradicionais tinham aterosclerose subclínica, com uma alta proporção tendo a doença intermediária ou generalizada.

[008] Contudo, aterosclerose subclínica esteve também presente em 60% dos indivíduos classificados como de baixo risco, sugerindo uma associação de aterosclerose com características não consideradas em escalas de risco padrão.

Isso foi uma observação impressionante já que indivíduos que apresentam aterosclerose subclínica multiterritorial, embora sejam classificados como de baixo risco, irão provavelmente desenvolver eventos de doenças cardiovasculares de aterosclerose (ASCVD).

[009] Fernandez-Friera L et al. 2017 (J Am Coll Cardiol. 2017; 70(24):2979-2991) também referindo-se ao estudo de PESA relatam que vários indivíduos de meia idade sem fatores de CVR apresentam aterosclerose. Esse estudo constatou que os níveis de colesterol LDL (LDL-C), mesmo em níveis atualmente considerados normais, são, independentemente, associados à presença e extensão de aterosclerose subclínica. Portanto, isso aponta para uma redução de LDL-C como uma medida preventiva a ser adotada mesmo em indivíduos considerados como em baixo risco.

[0010] Identificação de biomarcadores de aterosclerose no ambiente subclínico é tecnicamente mais desafiadora em um contexto de CVD bem desenvolvida ou eventos CV agudos, em que é esperado que a doença tenha um impacto claro nos níveis de proteínas plasmáticas. Muitos poucos estudos avaliaram os potenciais Biomarcadores de proteínas plasmáticas de Aterosclerose Subclínica. Imunoensaios foram usados para quantificar alterações nas proteínas específicas de plasma de adiponectina (Saarikoski LA et al., 2010) e TIMP4 (Oikonen M et al., 2012), mostrando que essas proteínas são diminuídas em indivíduos com aterosclerose carótida subclínica assintomática no Risco cardiovascular no coorte de Young Finns. Uma análise proteômica de descoberta do Risco cardiovascular no Coorte de Young Finns constatou uma associação entre níveis de plasma FBLN1C e presença de placas em indivíduos de meia idade (Bhosale SD et al., 2018), e o resultado foi confirmado por meio de proteômica direcionada na mesma população. Contudo, em nosso estudo, FBLN1C não passou nos rigorosos critérios de filtragem usados.

[0011] Yin X et al., 2014 (Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2014, 34:939-945) concerne à identificação de biomarcadores de proteína plasma que individualmente ou em agregado previram o risco de ASCVD.

Esse documento revelou uma associação entre PIGR e infarto do miocárdio em uma análise de marcador único.

[0012] Ngo D et al. 2016 (Circulation 2016, 134:270- 285) visa detectar associações entre concentrações de proteínas de plasma e componentes de pontuação de risco de Framingham no Estudo de Framingham Heart (FHS). Em particular, esse estudo menciona uma associação entre níveis de PIGR no plasma e o fumo. O fumo é um fator de risco cardíaco bem estabelecido e é uma das variáveis no algoritmo de avaliação de risco de FHS. PIGR é adicionalmente relatada por ser associada com a pontuação de FHS da doença coronária do coração de FHS.

[0013] Consequentemente, existe uma necessidade de encontrar novos biomarcadores para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de indivíduos que apresentam aterosclerose subclínica. Ademais, isso é particularmente desejável para identificar marcadores que são independentes de pontuações e fatores de CVR tradicionais, a fim de serem capaz de detectar aqueles indivíduos que apresentam aterosclerose subclínica dentre aqueles classificados como tendo baixo risco cardiovascular.

Sumário da Invenção

[0014] O presente pedido fornece os resultados do que é, para nosso conhecimento, a maior e mais profunda análise proteômica de plasma baseada em espectrometria de massa até hoje na busca por biomarcadores relacionados à aterosclerose. Os inventores usaram uma plataforma proteômica capaz de quantificar mais de 1000 proteínas de amostras de plasma não esgotadas em um coorte de 444 indivíduos do estudo de PESA. Essa análise foi possível ao combinar a precisão e robustez quantitativa fornecida pela marcação isobárica multiplexada com fluxos de trabalho estatísticos bem validados e automatizados (Navarro P e Vazquez J, 2014; Garcia-Marques F et al, 2016; Trevisan- Herraz M et al . 2018). Uma segunda análise de amostras de plasma obtidas dos mesmos indivíduos em acompanhamento de 3 anos validou os resultados e identificou um conjunto de proteínas de biomarcador putativo às quais a associação com aterosclerose permaneceu estável ao longo do tempo. Essa validação na segunda visita foi essencial para reduzir fontes de erro na fase de descoberta, para descartar proteínas com variabilidade biológica marcada, e para concentrar os esforços em um conjunto robusto de biomarcadores úteis para a detecção de aterosclerose subclínica.

[0015] Os níveis de PIGR (Receptor de Imunoglobulina Polimérica), APOA (Apolipoproteína(a)), HPT (haptoglobina), HEP2 (cofator 2 da heparina), C5 (componente 5 do complemento), ITIH1 (Inibidor 1 de alfa-tripsina) e IGHA2 (constante de imunoglobulina pesada alfa 2) no plasma como determinados por análise de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) foram constatados pelos inventores por serem associados à doença aterosclerótica subclínica independentemente uma da outra, e dos fatores de risco cardiovascular estabelecidos(por exemplo, idade, fumo) e escalas de risco cardiovascular (por exemplo, Pontuação de risco FHS).

[0016] Ademais, a acumulação dessas proteínas na camada média e principalmente na camada íntima (placa) mostrou ser maior conforme a placa evolui da faixa do tipo gorduroso para a lesão do tipo fibrolipídica (consultar Figura 1 e Figura 5). Portanto, os níveis dessas proteínas também foram associados pelos inventores ao grau de avanço da aterosclerose.

[0017] Sobre esta base, esses biomarcadores, e preferencialmente combinações dos mesmos, são propostas pelos inventores para uso em um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica como descrito no presente documento.

[0018] Consequentemente, o primeiro aspecto da invenção se refere a um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica em um indivíduo, que compreende determinar os níveis de um ou mais marcadores de proteína selecionados dentre o grupo que consiste em PIGR, APOA, HPT, HEP2, C5, ITIH1 e IGHA2 em uma amostra biológica isolada de um indivíduo, em que o dito método compreende: a) determinar em uma amostra biológica isolada do dito indivíduo os níveis de expressão de proteína de um ou mais dentre os ditos biomarcadores; e b) comparar os níveis dos biomarcadores com um valor de referência; c) em que, quando os níveis na amostra do indivíduo de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e/ou C5 estão aumentados em relação ao valor de referência correspondente, isso é indicativo de aterosclerose subclínica.

[0019] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tem aterosclerose subclínica, em que o dito método compreende: a. identificar um indivíduo que tem aterosclerose subclínica pelo método para triagem, diagnóstico e/ou monitoramento conforme definido no presente documento; b. administrar no dito paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de um tratamento adequado para prevenir/reduzir placas ateroscleróticas.

[0020] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um kit para determinar os níveis de um ou mais dentro os marcadores de proteína como descritos no presente documento em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

O kit pode também conter instruções que indicam como os materiais dentro do kit podem ser usados.

[0021] Ainda em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de um kit do aspecto precedente em um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica como descrito no presente documento.

Breve Descrição dos Desenhos

[0022] Figura 1, Análise proteômica quantitativa dos níveis de PIGR (Figura 1A), APOA (Figura 1B), ITIH1 (Figura 1C), C5 (Figura 1D) e IGHA2 (Figura 1E) em camadas média e íntimas de amostras de aortas humanas (controles; com placas ateroscleróticas com faixas gordurosas (FS) e com placas com lesões fibrolipídicas (FL)). Resultados estatisticamente significativos foram realçados com asteriscos(*), em que * significa um valor p de 0,05, ** significa um valor p de 0,01, *** significa um valor p de 0,001 e **** significa um valor p de 0,0001, e o valor de referência é o grupo saudável.

[0023] Figura 2, Associação dos Níveis de proteínas plasmáticas com Fatores de risco CV tradicionais. A rede foi construída pela análise da correlação de cada um dos fatores de risco contínuos com os níveis de plasma de cada uma das proteínas quantificadas pelos proteômicos. Correlações estatisticamente significativas foram selecionadas por um valor p de Bonferroni corrigido <0,05 tanto em PESA-V1 quanto em PESA-V2, e coeficientes de correlação de Pearson foram usados como pesos para construir uma rede de correlação usando Cytoscape. A espessura das linhas é proporcional aos pesos (cinza escuro: correlação positiva; cinza claro: correlação negativa). Correlações entre os fatores de risco também são mostradas. DBP: pressão arterial diastólica; SBP: pressão arterial sistólica; LDL: lipoproteína de baixa densidade; Ch: colesterol; HDL: lipoproteína de alta densidade; APOB: apolipoproteína B-100; PRG4: proteoclicano 4; PCYOX1: prenilcisteína oxidase 1; P06309: Variável Kapa de imunoglobulina 2D-28 (GeneName IGKV2D-28); APOM: apolipoproteína M; APOE: apolipoproteína E; APOC3: apolipoproteína C-III; APOC2: apolipoproteína C-II; THRB: protombina; PLTP: proteína de transferência de fosfolipídeo; APOF: apolipoproteína F; PON3: Soro paraoxonase/lactonase 3; CFB: fator de complemento B; APOA1: apolipoproteína A-I; APOA2: apolipoproteína A-II.

[0024] Figura 3, Correlação de proteínas de plasma com espessura de placa e CACS em coortes de PESA-V1 e PESA-V2,

[0025] (A) Correlação de níveis de proteínas plasmáticas relativos com a espessura de placa (coeficientes de correlação de Pearson) obtidos em PESA-V1 são comparados com aqueles obtidos em PESA-V2, Tamanhos de ponto são indicativos de abundância de proteínas no plasma (em número de peptídeos quantificados por proteína). A inserção mostra o comportamento de proteínas relacionadas reposta imune humoral, e de outras proteínas gerando uma correlação significativa.

[0026] (B) Correlação de níveis de plasma relativos com CACS em PESA-V1 e em PESA-V2, Dados são mostrados como em (A).

[0027] Figura 4, Gráficos em floresta que mostram razões de probabilidade de aterosclerose subclínica (casos vs controles) em PESA-V1 para as proteínas selecionadas.

[0028] Razões de probabilidade se refere a valores de proteína relativos determinados por proteômicos e expressos em unidades de desvio padrão, usando modelos de regressão logística univariáveis (Não ajustado), ou modelos multivariados ajustados por Pontuações de Risco comum (10-Y FHS, BEWAT ou ICHS). Barras de erro indicam 95% de intervalos de confiança.

[0029] Figura 5, Níveis de abundância de proteína absoluta das cinco proteínas selecionadas em amostras ateroscleróticas de tecidos humanos.

[0030] As cinco proteínas foram sujeitas à quantificação absoluta pelos proteômicos e seus níveis expressos em relação à quantidade de proteína total de cada amostra. Os níveis foram medidos em amostras da camada média (obtidas de aortas saudáveis, ou de aortas que mostraram placas precoces (com lesões fibrolipídicas ou com faixas gordurosas)), ou da camada íntima (com lesões fibrolipídicas ou com faixas gordurosas). Significâncias estatísticas indicadas das alterações de abundância de proteína em relação àquelas de amostras saudáveis são calculadas usando o teste t dos Estudantes.

[0031] Figura 6, Gráficos em floresta que mostram razões de probabilidade de aterosclerose subclínica (casos vs controles) em AWHS para proteínas selecionadas.

[0032] Razões de probabilidade se referem a valores de proteína como determinados pela turbidimetria e expressos em unidades de desvio padrão, usando modelos de regressão logística univariáveis (Não ajustado), ou modelos multivariados ajustados por Pontuações de Risco comum (10-Y FHS, BEWAT ou ICHS). Barras de erro indicam 95% de intervalos de confiança.

[0033] Figura 7, Gráficos em floresta que mostram Áreas Sob a Curva após análise ROC de painéis biomarcadores de proteína para previsão melhorada de aterosclerose subclínica em PESA-V1 e em AWHS. Barras de erro indicam 95% de intervalos de confiança dos valores de AUC. Asteriscos indicam significância estatística de que a AUC é significativamente melhor que aquela obtida usando a pontuação de risco somente.

[0034] Figura 8, Gráficos em floresta que mostram Áreas sob a curva após análise ROC de painéis biomarcadores de proteína para previsão melhorada de aterosclerose subclínica em indivíduos com baixo risco (10-Y FHS <0,1) em PESA-V1 e em AWHS. Barras de erro indicam 95% de intervalos de confiança dos valores de AUC. Asteriscos indicam significância estatística de que AUC é significativamente melhor que 0,5.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

[0035] Os termos "indivíduo", ou "sujeito"' são usados no presente documento intercambiavelmente para se referir a todos os animais classificados como mamíferos e incluem, porém não se limitam a, animais domésticos e de fazenda, primatas e humanos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cachorros, gatos, ou roedores. Preferencialmente, o indivíduo é um ser humano macho ou fêmea de qualquer idade ou raça.

[0036] O termo "diagnóstico”, como usado no presente documento, se refere tanto ao processo de tentar determinar e/ou identificar uma possível doença em um indivíduo, ou seja, o procedimento de diagnóstico, e à opinião alcançada por esse processo, ou seja, a opinião do diagnóstico.

[0037] O termo “triagem” é entendido no presente documento como o exame ou este de um grupo de indivíduos assintomáticos que pertencem a população geral, ou de um grupo de indivíduos que têm um ou mais fatores de risco (ou seja, um indivíduo com suspeita de desenvolver ou com risco de desenvolver uma doença), com o objetivo de discriminar indivíduos saudáveis daqueles que têm ou são suspeitos de terem uma doença. Um método de triagem é geralmente usado para a “detecção precoce” de uma doença. A expressão “detecção precoce” se refere a detecção antes da presença de sinais clínicos.

[0038] O termo "monitoramento" como usado no presente documento se refere a determinação da evolução da doença e/ou da eficácia da terapia, por exemplo, determinando se existe uma remissão da doença; ou pelo contrário, se existe progressão da doença ou uma recaída.

[0039] O termo “biomarcador” como usado no presente documento se refere aos marcadores de doença que são substâncias tipicamente encontrados em uma amostra corporal que podem ser facilmente medidos. A quantidade medida pode correlacionar com a fisiopatologia da doença subjacente, como a presença ou ausência de aterosclerose subclínica, ou com seu prognóstico (ou seja, probabilidade de superar a doença subjacente). Em pacientes que recebem tratamento para sua condição a quantidade medida pode também correlacionar com a responsividade à terapia.

[0040] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” como usado no presente documento se refere a uma quantidade que é efetiva, após administração de dose única ou múltipla em um indivíduo (como um paciente humano) no tratamento profilático ou terapêutico de uma doença, transtorno ou condição patológica.

[0041] O termo em sequência “substancialmente idêntico” como usado no presente documento se refere a uma sequência que é de pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de referência. Identificar a porcentagem entre as duas sequências pode ser determinada por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch.

[0042] O termo "reagente de afinidade" pode se referir a um ligante (por exemplo, anticorpo, peptídeo, proteína, ácido nucleico ou molécula pequena) que captura de modo seletivo (se liga a) uma molécula alvo através de reconhecimento molecular específico, tipicamente com uma afinidade de ligação na faixa nanomolar até subnanomolar.

Por exemplo, o reagente de afinidade pode ser um aptâmero, anticorpo ou anticorpo mimético.

[0043] O termo “afinidade” como usado no presente documento pode se referir ao equilíbrio constante para a dissociação de um antígeno com uma molécula ligante de antígeno(KD), e é considerada uma medida para a força ligante entre um determinante antigênico e um sítio ligante de antígeno na molécula ligante de antígeno molécula: quanto menor o valor de KD, mais forte será a força ligante entre um determinante antigênico e a molécula ligante de antígeno (alternativamente, a afinidade pode também ser expressa como a constante de associação (KA), que é de 1/KD). Será claro para os especialistas no assunto que a constante de dissociação pode ser a constante de dissociação real ou aparente.

[0044] O termo “aptâmero” ou “aptâmero ácido nucleico” como usado no presente documento pode se referir a um ácido nucleico de fita simples isolado o purificado (RNA ou DNA) que se liga com alta especificidade e afinidade a um alvo através de outras interações que além do pareamento base de Watson-Crick. Um aptâmero tem uma estrutura tridimensional que fornece contatos químicos para especificamente se ligar com um alvo. Diferentemente da ligação de ácido nucleico tradicional, a ligação de aptâmero não é dependente de uma sequência de base linear conservada, mas sim de uma estrutura particular secundária ou terciária. Isto é, as sequências de ácidos nucleicos dos aptâmeros são sequências não codificantes. Qualquer codificação potencial que um aptâmero pode possuir é totalmente fortuita e não desempenha nenhum papel na ligação de um aptâmero em um alvo. Um aptâmero tipicamente minimizado tem 5-15 kDa em tamanho (15-45 nucleotídeos), se liga a um alvo com afinidade nanomolar até subnanomolar, e se discrimina de alvos relativamente próximos (por exemplo, aptâmeros irão tipicamente não se ligar com outras proteínas do mesmo gene ou família funcional).

[0045] O termo “anticorpo” como usado no presente documento pode se referir a uma imunoglobulina ou um fragmento ligante de antígeno do mesmo. A menos que especificado de outra maneira, o termo inclui, porém não se limita a, anticorpos gerados de modo monoclonal, monoespecífico, multiespecífico, humanizado, humano, quimérico, sintético, recombinante, híbrido, mutado, enxertado, e in vitro. O anticorpo pode incluir uma região constante, ou uma porção da mesma, com os genes de regiões constantes kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon. Por exemplo, regiões constantes de cadeia pesada dos vários isótopos podem ser usadas, incluindo: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE. A título de exemplo, a região constante de cadeia leve pode ser kappa ou lambda. Em certas modalidades, o termo "anticorpo" pode também se referir a derivados de anticorpo, como proteínas de fusão baseadas em anticorpo (por exemplo, incluindo uma região equivalente a região Fc de uma imunoglobulina) ou anticorpos adicionalmente modificados para conter porções não proteicas adicionais, como polímeros solúveis em água, por exemplo, polietilenoglicol (PEG).

[0046] Os termos “domínio ligante de antígeno” e “fragmento ligante de antígeno” se referem a uma parte de uma molécula de anticorpo que compreende aminoácidos responsáveis pela ligação específica entre anticorpo e antígeno. Para certos antígenos, o domínio ligante de antígeno ou fragmento ligante de antígeno pode apenas se ligar em uma parte do antígeno. A parte do antígeno que é especificamente reconhecida e unida pelo anticorpo é referida como a “epítopo” ou “determinante antigênico.” O domínio ligante de antígenos e fragmentos ligantes de antígenos incluem Fab; um fragmento de F(ab')2 (um fragmento bivalente que tem dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte dissulfeto em uma região de região de dobradiça); um fragmento de Fv; um fragmento de cadeia única de Fv (scFv); um fragmento de Fd (que tem os dois domínios VH e CH1); anticorpos de domínio único (sdAbs; que consistem em um domínio VH único), e outros fragmentos de anticorpos que retêm a função ligante de antígeno. O fragmento Fab tem domínios VH-CH1 e VL-CL ligados de modo covalente por uma ligação dissulfeto entre as regiões constantes. O fragmento Fv é menor e tem domínios VH e VL ligados de modo não covalente. O scFv contém um polipeptídeo flexível que liga (1) o terminal C de VH ao terminal N de VL, ou (2) o terminal C de VL ao terminal N de VH. Os sdAbs incluem anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves e anticorpos de domínio único derivados de anticorpos de quatro cadeias convencionais. Esses domínios ligantes de antígenos e fragmentos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles especialistas no assunto, e são avaliados pela função da mesma maneira que imunoglobulinas intactas.

[0047] O termo "anticorpo recombinante" como usado no presente documento se refere a um anticorpo produzido ou expresso usando um vetor de expressão recombinante, em que o vetor de expressão compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo recombinante, de modo que a introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira apropriada resulte na produção ou expressão do anticorpo recombinante.

Anticorpos recombinantes podem ser anticorpos quiméricos ou humanizados, ou anticorpos mono ou multiespecíficos.

[0048] O termo “anticorpo mimético” como usado no presente documento pode se referir a um esqueleto com base em proteína que foi projetado para ligar alvos terapêuticos com afinidade e especificidade que combinam com aquelas dos anticorpos naturais. Anticorpos miméticos foram desenvolvidos utilizando uma dobra semelhante à imunoglobulina, por exemplo, tipo de fibronectina III, NCAM e CTLA-4, Outros esqueletos miméticos sem similaridade com dobras de imunoglobulina também foram obtidos. Exemplos não limitadores dos ditos esqueletos são DARPins, anticalins, moléculas affibodies, adnectinas, finômero, etc. (consultar por exemplo, Weidle et al., 2013, Cancer Genomics & Proteomics, 10, 1-18; Lofblom, J. et al., 2011, Curr. Opin.

Biotechnol., 22, 843–848; Banta, S. et al., 2010, Annu. Rev.

Biomed. Eng., 15, 93–113).

Métodos da Invenção

[0049] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica em um indivíduo, que compreende determinar os níveis de um ou mais marcadores de proteína selecionados dentre o grupo que consiste em PIGR, APOA, HPT (haptoglobina), HEP2 (cofator 2 da heparina), C5, ITIH1 e IGHA2 em uma amostra biológica isolada de um indivíduo, em que o dito método compreende: a) determinar em uma amostra biológica isolada do dito indivíduo os níveis de expressão de proteína de um ou mais dentre ditos biomarcadores; e b) comparar os níveis dos biomarcadores com um valor de referência; c) em que quando os níveis na amostra do indivíduo de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e/ou C5 estão aumentados em relação ao valor de referência correspondente, isso é um indicativo de aterosclerose subclínica.

[0050] Ademais, a acumulação de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5 na placa foi associada pelos inventores ao grau de avanço de aterosclerose (consultar Figura 1 e Figura 5). Consequentemente, a determinação dos níveis de plasma dessas proteínas no método de triagem, diagnóstico e/ou monitoramento da invenção pode também fornecer informações sobre ou permitir a previsão do grau de avanço de aterosclerose subclínica.

[0051] O termo “aterosclerose subclínica” como usado no presente documento se refere à aterosclerose em indivíduos assintomáticos. A expressão “indivíduos assintomáticos” se refere àqueles sujeitos que não experimentaram sinais clínicos de cardiovascular doença, incluindo, por exemplo, infarto do miocárdio, angina de peito ou acidente vascular cerebral.

[0052] Preferencialmente, “aterosclerose subclínica” se refere a presença de placas ateroscleróticas na carótida, aórtica, ou territórios iliofemorais ou CACS ≥1 em indivíduos assintomáticos. A “extensão” multiterritorial de aterosclerose subclínica é definida de acordo com o número de sítios vasculares afetados (carótida direita, carótida esquerda, aorta abdominal, iliofemoral direito, iliofemoral esquerdo, e artérias coronárias). Por exemplo, como detalhado nos Exemplos, no estudo de PESA os participantes foram classificados em quatro categorias distintas de acordo com os resultados dos ensaios de imageamento (“pontuação PESA”), nomeadamente como livre da doença (0 sítios vasculares afetados) ou como tendo aterosclerose focal (1 sítio), intermediária (2–3 sítios), ou generalizada (4–6 sítios).

[0053] A “presença de placas ateroscleróticas” pode ser avaliada por varredura de corte transversal das carótidas, aorta abdominal infrarenal, e artérias iliofemorais. O termo “placa” tipicamente se refere a uma protusão focal no lúmen arterial de espessura >0,5 mm ou >50% da espessura média íntima circundante ou uma espessura difusa >1,5 mm medida entre as interfaces íntima lúmen e média adventícia.

[0054] A Etapa (a) do método sob o primeiro aspecto da invenção compreende determinar na dita amostra biológica os níveis de expressão de um ou mais marcadores de proteína conforme definido acima.

[0055] O PIGR (Receptor de imunoglobulina polimérica) liga moléculas poliméricas IgA e IgM na superfície basolateral das células epiteliais; o complexo é então transportado ao longo da célula para ser secretado na superfície apical. Durante esse processo ocorre uma clivagem que separa o extracelular (conhecido como componente secretor) do segmento agente de transmembrana. A sequência canônica de PIGR humana é referida como SEQ ID NO:1 (UniProtKB Número de acesso P01833-1; essa é a versão 4 da sequência de 26 de junho de 2007):

[0056] O termo “PIGR” como usado no presente documento se refere à proteína humana PIGR com SEQ ID NO:1 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:1,

[0057] A sequência canônica da constante de imunoglobulina humana pesada alfa 2 (IGHA2) é referida como SEQ ID NO:2 (UniProtKB Número de Acesso P01877-1; essa é a versão 4 da sequência de 15 de março de 2017):

[0058] O termo “IGHA2” como usado no presente documento se refere à proteína humana IGHA2 com SEQ ID NO:2 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:2,

[0059] A presença de PIGR e IGHA2 em lesões ateroscleróticas precoces é uma nova constatação. PIGR e IGHA2 são funcionalmente relacionados e são conhecidas por serem envolvidas na resposta imune humoral. Imunoglobulinas IgA são, contudo, para serem a primeira linha de proteção imune específica de antígeno em superfícies mucosas, enquanto o PIGR é um receptor que liga polimérico circulante IgA e IgM na superfície basolateral de células epiteliais do intestino e transporta elas ao longo da célula para serem secretadas na superfície apical no lúmen intestinal (Kaetzel CS, 2005; Wines BD e Hogarth PM, 2006). Embora aterosclerose seja hoje em dia considerada uma doença imune inflamatória crônica com um forte componente autoimune e uma clara contribuição de tanto a imunidade inata quanto adaptativa

(Hansson GK e Hermansson A, 2011), existem poucas informações sobre o papel dos anticorpos IgA em doenças CV (Tsiantoulas

D et al., 2014). Foram relatados que os níveis de PIGR aumentam em expectoração e no sangue de fumantes e pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (Ohlmeier S et al.,

2012); ademais, o PIGR foi ligado a fumantes em um coorte do

Estudo de Framingham Offspring, embora os níveis de PIGR não tenham sido associados com doença CV nesse coorte (Ngo D et al., 2016). A única ligação que estamos cientes entre o PIGR e aterosclerose é o elevado nível dessa proteína em vesículas extracelulares de indivíduos com síndrome coronária aguda,

embora a inclusão o desse parâmetro não melhore a detecção doença sobre fatores de risco convencionais ou troponina I

(de Hoog VC et al., 2013). Nenhuma associação entre a isoforma IgA do IGHA2 e aterosclerose foi relatada antes;

contudo, soro total elevado IgA (que inclui IGHA1, a isoforma mais abundante, e IGHA2) foi relatada em relação aterosclerose avançada ou em eventos de CV em estágios finais; por exemplo, em pacientes com aterosclerose severa

(Muscari A et al., 1988) ou com prévio infarto do miocárdio ou outros grandes eventos de isquemia (Muscari A et al.,

1993). Os níveis de IgA, juntos com aqueles de IgE e IgG,

mas não com IgM, também correlacionam com infarto do miocárdio e morte cardíaca em homens dislipidêmicos (Kovanen PT et al., 1998).

[0060] A apolipoproteína(a) (APOA) é o principal constituinte da lipoproteína(a) (LPA). APOA é conhecida por ser clivada proteoliticamente e os fragmentos se acumulam em lesões ateroscleróticas. A APOA é bem conhecida por se acumular na íntima; esta proteína contém locais de ligação de lisina que permitem que ela se ligue firmemente a superfícies expostas no endotélio desnudado, entre e se acumule em espaços subintimais (Tsimikas S, 2017). Existe evidência abundante que liga a APOA com a aterosclerose.

Embora o papel fisiológico da Lp(a) em humanos seja ainda não completamente elucidado (Orso E Schmitz G, 2017), a partícula foi identificada como previsor independente da calcificação artéria coronária (Greif M et al., 2013), e epidemiologia sustenta a forte associação entre Lp(a) elevada e resultados de doenças CV ateroscleróticas (Ellis KL et al., 2017), sugerindo que a Lp(a) desempenha um papel de causa na doença (Ellis KL e Watts GF, 2018). Não existem tratamentos para Lp(a) especificamente baixa, e assim, o efeito potencial de abaixar a Lp(a) em risco de CVD não foi demonstrado; mesmo assim, algumas autoridades recomendam testar os níveis de Lp(a) níveis em certas situações clínicas, por exemplo em indivíduos com um histórico pessoal ou familiar de CAD prematuro ou com risco intermediário/alto de CAD (Ellis KL e Watts GF, 2018).

[0061] Nossos resultados fornecem a primeira demonstração do potencial dos Níveis de proteína APOA como previsores independentes de aterosclerose na fase subclínica, complementando as informações fornecidas não apenas pelos fatores de risco conhecidos mas também pela IGAH2 e HPT.

[0062] A sequência canônica de APOA humana é referida como SEQ ID NO:3 (UniProtKB Número de Acesso P08519; essa é a versão 1 da sequência de 1 de agosto de 1988):

[0063] O termo “APOA” como usado no presente documento se refere proteína humana APOA com SEQ ID NO:3 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:3,

[0064] A cadeia pesada de inibidor de inter alfa tripsina H1 (ITIH1) pode atuar como um carreador de ácido hialurônico em soro ou como proteína de ligação entre ácido hialurônico e outra matriz de proteína, incluindo aquelas nas superfícies da célula em tecidos para regular a localização, síntese e degradação de ácido hialurônico que são essenciais para células que estão passando por processos biológicos. A sequência canônica de ITIH1 humana é referida como SEQ ID NO:4 (UniProtKB Número de Acesso P19827; essa é a versão 3 da sequência de 15 de julho de 1998):

[0065] O termo “ITIH1” como usado no presente documento se refere à proteína humana ITIH1 com SEQ ID NO:4 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:4,

[0066] A ativação do complemento humano C5 por um C5 convertase inicia a montagem espontânea de componentes de complemento tardios, C5-C9, no complexo de ataque à membrana.

A sequência canônica de C5 humana é referida como SEQ ID NO:5 (UniProtKB Número de Acesso P01031-1; essa é a versão 4 da sequência de 5 de fevereiro de 2008):

[0067] O termo “C5” como usado no presente documento se refere à proteína humana C5 com SEQ ID NO:5 e às sequências substancialmente idênticas da mesma. Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:5,

[0068] A presença e acumulação de HPT na camada íntima é consistente com seu papel oxidante promovendo a depuração de hemoglobina livre liberada das células de sangue vermelho (RBC); contudo, a acumulação de HPT nas fases precoces da formação da placa não foram documentadas antes. Nesse sentido, a presença de ferro redox ativo, hemoglobina e glicoforina A em placas ateroscleróticas precoces foi recentemente revelado, implicando infiltração íntima de RBC como um dos ativadores iniciais para oxidação íntima (Delbosc S et al., 2017).

[0069] Vários estudos humanos indicaram que o fenótipo HPT 2- pode estar associado com CVD em diabetes mellitus tipo 2 (Levy AP et al., 2002; Levy AP et al., 2004). Níveis de HPT aumentados foram anteriormente observados em pacientes CAD (Lee CW et al., 2013) e foram preditivos de eventos CV (Holme I et al., 2009). HPT é considerada uma proteína de fase aguda, e, como outras proteínas dessa classe como a CRP, fibrinogênio, e proteína de soro amiloide, foi usada como um marcador da inflamação. Esses marcadores, sozinhos ou em combinação, melhoram a previsão de grandes eventos de CV como infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico (Holme I et al., 2009; Engstrom G et al., 2002; Holme I et al., 2010; Brea D et al., 2009; Sabatine MS et al., 2007). Contudo, essas proteínas também detectam outras doenças associadas a inflamações; por exemplo, aumentos similares em HPT e fibrinogênio ocorrem em pacientes com disfunção renal ou doença CV avançada, refletindo eventos inflamatórios compartilhados nessas condições (Luczak M et al., 2011). Ademais, um estudo recente de associações entre proteínas de fase aguda e eventos de CV em 581 pacientes constatou nenhuma associação entre HPT e características de placa coronária ou eventos clínicos (Battes LC et al., 2014). Em um estudo proteômico de descoberta, foi constatado que os marcadores inflamatórios SAA-1 e CRP eram aumentados em pacientes com aterosclerose estável ou síndrome coronária aguda, mas nenhuma alteração foi detectada nos níveis de HPT (Kristensen LP et al., 2014).

Nossos resultados atuais mostraram nenhuma associação dessas proteínas de fase aguda com espessura de placa ou CACS. Esses resultados sugerem que os níveis de plasma de HPT não acompanha estritamente o comportamento dos marcadores inflamatórios.

[0070] A sequência canônica de haptoglobina humana é referida como SEQ ID NO:9 (UniProtKB Número de Acesso P00738; essa é a versão 1 da sequência de 21 de julho de 1986):

[0071] O termo “HPT” como usado no presente documento se refere a haptoglobina humana proteína com SEQ ID NO:9 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:9,

[0072] HEP2 foi previamente encontrada no núcleo rico em lipídeo de ateromas (Rau JC et al., 2009), mas não foi descrita em placas precoces. Expressão reduzida de HEP2 foi associada com aterosclerose agravada (Kanagawa Y et al., 2001; Takamori N et al., 2004), devido, presumivelmente, a seu papel como inibidor de trombina. Similarmente, a atividade de plasma HEP2 foi inversamente associada a prevalência de doença arterial (Aihara K et al., 2009), indivíduos com altos níveis de HEP2 mostraram ter menos aterosclerose (Aihara K et al., 2004) e se pensa que HEP2 desempenhe um papel de proteção contra remodelação vascular e cardíaca (Aihara K et al., 2009; Ikeda Y et al., 2012).

Assim, nossa constatação de que HEP2 é aumentada em aterosclerose subclínica não foi esperada de estudos anteriores.

[0073] A sequência canônica do cofator humano 2 da heparina (HEP2) é referida como SEQ ID NO:10 (UniProtKB Número de Acesso P05546; essa é a versão 3 da sequência de 1 de novembro de 1991):

[0074] O termo “HEP2” como usado no presente documento se refere à proteína humana HEP2 com SEQ ID NO:10 e às sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:10,

[0075] Em uma modalidade particular, o método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento da invenção compreende determinar na etapa a) os níveis de expressão de proteína de um ou mais biomarcadores que compreendem ou consistem em: i. PIGR e/ou IGHA2; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro ou cinco biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5,

[0076] Preferencialmente, a etapa a) compreende determinar os níveis de expressão de PIGR e/ou IGHA2 e um, dois ou três biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5, Consequentemente, em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, o dito um ou mais biomarcadores na etapa a) são uma pluralidade de biomarcadores que compreendem ou consistem em: a. PIGR e/ou IGHA2, e APOA; b. PIGR e/ou IGHA2, e HPT; c. PIGR e/ou IGHA2, e HEP2; d. PIGR e/ou IGHA2, e C5; e. PIGR e/ou IGHA2, e ITIH1; f. PIGR e/ou IGHA2, APOA e HPT; g. PIGR e/ou IGHA2, APOA e HEP2; h. PIGR e/ou IGHA2, APOA e C5; i. PIGR e/ou IGHA2, APOA e ITIH1; j. PIGR e/ou IGHA2, HPT e HEP2; k. PIGR e/ou IGHA2, HPT e C5; l. PIGR e/ou IGHA2, HPT e ITIH1; m. PIGR e/ou IGHA2, HEP2 e C5; n. PIGR e/ou IGHA2, HEP2 e ITIH1; o. PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e C5; p. PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e ITIH1; q. PIGR e/ou IGHA2, APOA, HEP2 e C5; r. PIGR e/ou IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1; s. PIGR e/ou IGHA2, HPT, HEP2 e C5; t. PIGR e/ou IGHA2, HPT, HEP2 e ITIH1; e u. PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e HEP2,

[0077] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, o dito um ou mais biomarcadores na etapa a) são uma pluralidade de biomarcadores que compreendem ou consistem em: - PIGR, APOA e ITIH1; ou - PIGR, APOA e C5; ou - IGHA2, APOA e ITIH1; ou - IGHA2, APOA e C5; ou - PIGR, ITIH1 e C5; ou - IGHA2, ITIH1 e C5,

[0078] Mais preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende PIGR e/ou IGHA2; e adicionalmente compreende dois biomarcadores que são de APOA; e pelo menos um dentre HPT, HEP2, ITIH1 ou C5, Consequentemente, e uma outra modalidade, opcionalmente em combinação com qualquer uma dentre as modalidades ou recursos descritos no presente documento, a dita pluralidade de biomarcadores compreende ou consiste em: - IGHA2, APOA e pelo menos um dentre HPT, HEP2, ITIH1 ou C5; ou - PIGR, APOA e pelo menos um dentre HPT, HEP2, ITIH1 ou C5,

[0079] Ainda com mais preferência, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende ou consiste em: - IGHA2, APOA e HPT; ou - PIGR, APOA e HPT.

[0080] Em uma modalidade adicional, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende ou consiste em PIGR, IGHA2, APOA, e pelo menos um dentre HPT, HEP2, ITIH1 ou C5, Preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende ou consiste em uma pluralidade de biomarcadores selecionados dentre o grupo que consiste em: (i) PIGR, IGHA2, APOA, ITIH1 e C5; (ii) PIGR, IGHA2, APOA, HPT e HEP2; (iii) PIGR, IGHA2, APOA, HPT e ITIH1; (iv) PIGR, IGHA2, APOA, HPT e C5; (v) PIGR, IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1; e (vi) PIGR, IGHA2, APOA, HEP2 e C5,

[0081] Modalidades alternativas compreendem determinar na etapa a) os níveis de expressão de um ou mais biomarcadores que compreendem ou consistem em: i. pelo menos ITIH1; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores, selecionados de APOA, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2,

[0082] Preferencialmente, os ditos um ou mais biomarcadores em a) são uma pluralidade de biomarcadores que compreendem ITIH1 e um ou dois biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2, Consequentemente, em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, a dita pluralidade de biomarcadores compreende ou consiste em: - ITIH1 e APOA; ou - ITIH1 e PIGR; ou - ITIH1 e IGHA2; ou - ITIH1 e C5; ou - ITIH1 e HPT; ou - ITIH1 e HEP2; ou - ITIH1, APOA e PIGR; ou - ITIH1, APOA e IGHA2; ou - ITIH1, APOA e C5; ou - ITIH1, APOA e HPT; ou - ITIH1, APOA e HEP2; ou - ITIH1, PIGR e IGHA2; ou - ITIH1, PIGR e C5; ou - ITIH1, PIGR e HPT; ou ITIH1, PIGR e HEP2; ou - ITIH1, IGHA2 e C5; ou - ITIH1, IGHA2 e HPT; ou - ITIH1, IGHA2 e HEP2; ou - ITIH1, C5 e HPT; ou - ITIH1, C5 e HEP2; ou - ITIH1, HPT e HEP2,

[0083] Mais preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende ITIH1 e dois biomarcadores consistem em (i) APOA; e (ii) pelo menos um dentre PIGR,

IGHA2, HPT, HEP2 ou C5,

[0084] Modalidades adicionais alternativas compreendem determinar na etapa a) os níveis de expressão de um ou mais biomarcadores que compreendem ou consistem em: i. pelo menos HPT; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores, selecionados de APOA, HEP2, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2,

[0085] Preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende HPT e um ou dois biomarcadores selecionados dentre APOA, HEP2, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2, Consequentemente, em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, a dita pluralidade de biomarcadores compreende ou consiste em: - HPT e APOA; ou - HPT e PIGR; ou - HPT e IGHA2; ou - HPT e C5; ou - HPT e ITIH1; ou - HPT e HEP2; - HPT, APOA e PIGR; ou - HPT, APOA e IGHA2; ou - HPT, APOA e C5; ou - HPT, APOA e ITIH1; ou

- HPT, APOA e HEP2; ou - HPT, PIGR e IGHA2; ou - HPT, PIGR e C5; ou - HPT, PIGR e ITIH1; ou - HPT, PIGR e HEP2; ou - HPT, IGHA2 e C5; ou - HPT, IGHA2 e ITIH1; ou - HPT, IGHA2 e HEP2; ou - HPT, C5 e ITIH1; ou - HPT, C5 e HEP2; ou - HPT, ITIH1 e HEP2,

[0086] Mais preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende HPT e dois biomarcadores consistem em (i) APOA; e (ii) pelo menos um dentre PIGR, HEP2, IGHA2, C5 ou ITIH1,

[0087] Ainda modalidades adicionais alternativas compreendem determinar na etapa a) os níveis de expressão de um ou mais biomarcadores que compreendem ou consistem em: i. pelo menos APOA; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores, selecionados de ITIH1, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2,

[0088] Preferencialmente, o dito um ou mais biomarcadores em a) são uma pluralidade de biomarcadores que compreendem APOA e um ou dois biomarcadores selecionados de

ITIH1, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2, Consequentemente, em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, a dita pluralidade de biomarcadores compreende ou consiste em:

- APOA e ITIH1; ou

- APOA e PIGR; ou

- APOA e IGHA2; ou

- APOA e C5; ou

- APOA e HPT; ou

- APOA e HEP2; ou

- APOA, ITIH1 e PIGR; ou

- APOA, ITIH1 e IGHA2; ou

- APOA, ITIH1 e C5; ou

- APOA, ITIH1 e HPT; ou

- APOA, ITIH1 e HEP2; ou

- APOA, PIGR e IGHA2; ou

- APOA, PIGR e C5; ou

- APOA, PIGR e HPT; ou

- APOA, PIGR e HEP2; ou

- APOA, IGHA2 e C5; ou

- APOA, IGHA2 e HPT; ou

- APOA, IGHA2 e HEP2; ou

- APOA, C5 e HPT; ou

- APOA, C5 e HEP2; ou

- APOA, HPT e HEP2,

[0089] Mais preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende APOA e dois biomarcadores consistem em (i) HPT; e (ii) pelo menos um dentre PIGR, IGHA2, HEP2, ITIH1 ou C5,

[0090] Ainda, modalidades alternativas adicionais compreendem determinar na etapa a) os níveis de expressão de um ou mais biomarcadores que compreendem ou consistem em: i. pelo menos HEP2; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores, selecionados de APOA, HPT, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2,

[0091] Preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende HEP2 e um ou dois biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2, Consequentemente, em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades descritas no presente documento, a dita pluralidade de biomarcadores compreende ou consiste em: - HEP2 e APOA; ou - HEP2 e PIGR; ou - HEP2 e IGHA2; ou - HEP2 e C5; ou - HEP2 e ITIH1; ou - HEP2 e HPT;

- HEP2, APOA e PIGR; ou - HEP2, APOA e IGHA2; ou - HEP2, APOA e C5; ou - HEP2, APOA e ITIH1; ou - HEP2, APOA e HPT; ou - HEP2, PIGR e IGHA2; ou - HEP2, PIGR e C5; ou - HEP2, PIGR e ITIH1; ou - HEP2, PIGR e HPT; ou - HEP2, IGHA2 e C5; ou - HEP2, IGHA2 e ITIH1; ou - HEP2, IGHA2 e HPT; ou - HEP2, C5 e ITIH1; ou - HEP2, C5 e HPT; ou - HEP2, ITIH1 e HPT.

[0092] Mais preferencialmente, a dita pluralidade de biomarcadores em a) compreende HEP2 e dois biomarcadores consistem em (i) APOA; e (ii) pelo menos um dentre PIGR, HPT, IGHA2, C5 ou ITIH1,

[0093] O termo “amostra” ou "amostra biológica", como usado no presente documento, se refere a material biológico isolado de um indivíduo. A amostra biológica pode conter qualquer material biológico adequado para detectar o biomarcador desejado e pode compreender material celular e/ou não celular do indivíduo. A amostra pode ser isolada de qualquer tecido biológico adequado ou fluido como, por exemplo, sangue, plasma do sangue, soro, fluido espinhal cerebral (CSF), urina, líquido amniótico, fluidos linfa, secreções externas dos tratos respiratório, intestinal, geniturinário, lágrimas, saliva, com células sanguíneas.

Preferencialmente, as amostras usadas para determinação do nível (ou níveis) dos marcadores de proteína nos métodos da invenção são amostras que podem set obtidas usando procedimentos minimamente invasivos. Em uma modalidade preferencial, as amostras são sangue, plasma ou amostras de soro. Preferencialmente, essa amostra biológica é um plasma sanguíneo.

[0094] Esses tipos de amostras são rotineiramente usados na prática clínica e os especialistas no assunto saberão como identificar os meios mais apropriados para sua obtenção e preservação. Uma vez que uma amostra tenha sido obtida, ela pode ser usada fresca, pode ser congelada, liofilizada ou preservada usando os meios apropriados.

[0095] A expressão "determinar os níveis do marcador", como usada no presente documento, se refere a determinação da quantidade ou concentração absoluta ou relativa do biomarcador na amostra. Técnicas para testar níveis de biomarcadores individuais das amostras de teste são bem conhecidas por técnicos especialistas no assunto, e a invenção não é limitada pelos meios nos quais os componentes são avaliados.

[0096] Métodos para quantificar expressão de proteína são bem conhecidos na técnica. Métodos adequados para determinar os níveis de uma proteína dada incluem, sem limitação, aquelas descritas no presente documento abaixo.

Métodos preferenciais para determinar os níveis de expressão de proteína nos métodos da presente invenção são Imunoensaios. Vários tipos de Imunoensaios são conhecidos por um especialista no assunto para a quantificação de proteínas de interesse. Esses métodos são baseados no uso de reagentes de afinidades, que podem ser qualquer anticorpo ou outro ligante que se liga especificamente à proteína alvo ou a um fragmento da mesma, em que o dito reagente de afinidade é preferencialmente marcado. Por exemplo, o reagente de afinidade pode ser marcado enzimaticamente, ou marcado com um isótopo radioativo ou com um agente florescente.

[0097] O reagente de afinidades pode ser qualquer anticorpo ou ligante que se liga especificamente à proteína alvo ou a um fragmento da mesma. Ligantes de afinidade podem incluir proteínas, peptídeos, ácido nucleico ou aptâmeros de peptídeo, e outras proteínas-esqueleto alvo específicos, como anticorpos miméticos. Anticorpos específicos contra os marcadores de proteína usados nos métodos da invenção podem ser produzidos, por exemplo, pela imunização de um hospedeiro com uma proteína da presente invenção ou um fragmento da mesma. Da mesma maneira, peptídeos específicos contra os marcadores de proteína usados nos métodos da invenção podem ser produzidos pela triagem bibliotecas de peptídeos sintéticos.

[0098] Técnicas de Western blot ou imunoblot permitem a comparação de da abundância relativa de proteínas separadas por uma eletroforese em gel (por exemplo, proteínas nativas pela estrutura 3-D ou proteínas desnaturadas pelo comprimento do polipeptídeo). Técnicas de Imunoblot usam anticorpos (ou outros ligantes específicos em técnicas relacionadas) para identificar proteínas alvo dentre um número de espécies de proteína não relacionadas. Elas envolvem a identificação da proteína alvo através de reações específicas de antígeno-anticorpo (ou proteína-ligante).

Proteínas são tipicamente separadas por eletroforese e transferidas para uma folha de material polimérico (geralmente nitrocelulose, nylon, ou fluoreto de polivinilideno). Os borrões de fenda e ponto são procedimentos simplificados nos quais amostras de proteína não são separadas por eletroforese mas imobilizadas diretamente em uma membrana.

[0099] Tradicionalmente, a quantificação de proteínas em solução foi realizada por Imunoensaios em um suporte sólido. O dito imunoensaio pode ser, por exemplo, um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), a ensaio de imunoabsorção florescente (FIA), um imunoensaio de quimioluminescência (CIA), ou um radioimunoensaio (RIA), um imunoensaio de enzima multiplicada, um radioimunoensaio de fase sólida(SPROA), um ensaio de polarização de fluorescência (FP), um ensaio de transferência de energia ressonante fluorescente (FRET), um ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET), em ensaio de ressonância de superfície plasmática (SPR). Quaisquer versões de multiplexação e de qualquer geração seguinte dentre qualquer uma das mencionadas acima, são especificamente englobadas. Em uma modalidade particular, o dito imunoensaio é um ensaio ELISA ou qualquer versão de multiplexação do mesmo.

[00100] Outros métodos que podem ser usados para quantificação de proteínas em solução são técnicas com base em espectrometria de massa (MS), também chamadas de espectroscopia de massa. O termo “métodos com base em espectrometria de massa (MS)” como usado no presente documento se refere a espectometria de massa sozinha ou acoplada com outros métodos de detecção ou separação, influindo cromatografia de gás combinada com espectroscopia de massa, cromatografia líquida combinada com espectroscopia de massa, cromatografia de fluido supercítico combinada com espectroscopia de massa, cromatografia líquida de ultraperformance combinada com espectometria de massa, MALDI combinada com espectroscopia de massa, espectroscopia por aspersão de íon combinada com espectroscopia de massa, eletroforese capilar combinada com espectometria de massa, NMR combinada com espectometria de massa e IR combinada com espectometria de massa. Esses métodos com base em MS podem incluir MS única ou MS em tandem. Em uma outra modalidade particular, os níveis de expressão de proteína são determinados por meio de cromatografia líquida acoplada a análise de espectometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

[00101] Espectrômetros de massa operam pela conversão das moléculas de analito para um estado carregado (ionizado), com análise subsequente dos íons e quaisquer fragmentos de íons que são produzidos durante o processo de ionização, com base em sua massa para a razão de carga (m/z). Várias tecnologias diferentes estão disponíveis tanto para ionização quanto para análise de íon, resultando em vários tipos diferentes de espectrômetros de massa com diferentes combinações desses dois processos. Por um lado, exemplos de fontes de íon influem fonte de ionização de electrospray, fonte de ionização de química de pressão atmosférica, fotoionização de pressão atmosférica ou ionização de dessorção a laser assistida por matriz (MALDI). Por outro lado, analisadores de espectrômetros de massa podem ser, porém sem limitação a, analisador de massa quadrupolo, analisadores de tempo de voo (TOF), analisadores de armadilha de íon, analisadores de armadilha de órbita ou analisadores híbridos, como analisadores de tempo de voo quadrupolo híbrido (QTOF), analisadores quadrupolo de armadilha de órbita híbridos, analisadores armadilha de íon e armadilha de órbita híbridos, analisadores de armadilha de íon lineares quadrupolo triplo híbrido ou analisadores armadilha de íon quadrupolo tri-híbridos e armadilha de órbita. Em uma modalidade preferencial, os níveis dos marcadores de proteína são determinados pelo uso de um analisador armadilha de órbita quadrupolo híbrido.

[00102] Padrões internos podem ser usados na análise de MS na medida em que permite corrigir quaisquer perdas ou ineficiências no processo de preparação da amostra ou alterações na eficiência da ionização, por exemplo, aquelas decorrentes da supressão de íons. Versões de isótopos isobáricos ou estáveis do analito são padrões internos ideais na medida em que eles têm propriedades químicas quase idênticas mas são facilmente distinguidos durante a MS. Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre as modalidades descritas acima ou abaixo, a determinação dos níveis do marcador de proteína é conduzida por um método com base em MS que usa versões marcadas de isotópicas/isobáricas do marcador de proteína como padrões internos. Em adição, ou alternativamente, o solvente de extração pode ser enriquecido com compostos não detectados em amostras biológicas não enriquecidas.

[00103] Como mostrado nos Exemplos (consultar Tabelas 5 e 6), IGHG1 e IGHG2 também sã previsores independentes de aterosclerose subclínica. Em particular, esses mostraram ser diminuídos na presença da doença. Consequentemente, o método da invenção pode adicionalmente compreender: a) determinar na dita amostra biológica os níveis de expressão de proteína de IGHG1 e/ou IGHG2, b) comparar os níveis dos biomarcadores com um valor de referência; c) em que quando os níveis na amostra do indivíduo de IGHG1 e/ou IGHG2 são diminuídos em relação ao valor de referência correspondente, isso é indicativo de aterosclerose subclínica.

[00104] Em adição, os níveis de IGHA2 podem ser expressados em relação aos níveis de qualquer uma dentre a constante de imunoglobulina pesada alfa 1 (IGHA1), constante de imunoglobulina pesada gamma 1 (IGHG1), constante de imunoglobulina pesada gamma 2 (IGHG2) ou uma combinação das mesmas. Preferencialmente, os níveis de IGHA2 são expressados em relação aos níveis de IGHA1 ou aos níveis médios de IGHG1 e IGHG2,

[00105] A sequência canônica de constante de imunoglobulina humana pesada alfa 1 (IGHA1) é referida como SEQ ID NO:6 (UniProtKB Número de Acesso P01876-1; essa é a versão 2 da sequência de 1 de fevereiro de 1991):

[00106] O termo “IGHA1” como usado no presente documento se refere à proteína humana IGHA1 com SEQ ID NO:6 e a sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:6,

[00107] A sequência canônica da constante de imunoglobulina humana pesada 1 (IGHG1) é referida como SEQ ID NO:7 (UniProtKB Número de Acesso P01857-1; essa é a versão 1 da sequência de 21 de julho de 1986):

[00108] O termo “IGHG1” como usado no presente documento se refere à proteína humana IGHG1 com SEQ ID NO:7 e a sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:7,

[00109] A sequência canônica da constante de imunoglobulina humana pesada gamma 2 (IGHG2) é referida como SEQ ID NO:8 (UniProtKB Número de Acesso P01859-1; essa é a versão 2 da sequência de 16 de dezembro de 2008):

[00110] O termo “IGHG2” como usado no presente documento se refere à proteína humana IGHG2 com SEQ ID NO:8 e a sequências substancialmente idênticas da mesma.

Preferencialmente, a dita sequência é SEQ ID NO:8,

[00111] Os inventores também constataram que IGHG1, IGKC e IGLC2 diminuíram em espessura de placa em PESA-V1, enquanto IGHA1, IGHG3, IGHG4 e IGHM não foram afetadas, com essas alterações permanecendo detectáveis em PESA-V2 (Figura 3A). Assim, os dados apresentados sustentam um papel para a reposta imune humoral nas fases iniciais de aterosclerose (Tsiantoulas D et al., 2014) e também sugerem a existência de comutação de classes de Ig. Um papel na comutação de classes IgA foi proposto para BAFF (fator de ativação da célula B) e APRIL (ligante indutor de proliferação), dois fatores implicados na B-célula desenvolveram em doenças autoimunes (Kaneko T et al., 2014), com evidência sugerindo um papel para BAFF no direcionamento da comutação de IgA1 e APRIL no direcionamento da comutação de IgA2 (Litinskiy MB et al., 2002). É, portanto, concebível que um comutador de classe de IgA é ativado pela ativação diferencial de subconjuntos específicos de células B propostos a entrar em ação durante a aterosclerose (Tsiantoulas D et al., 2014).

[00112] Na etapa (b), a triagem e/ou método diagnóstico da invenção compreende comparar o nível (ou níveis) do marcador (ou marcadores) de proteína com um valor de referência.

[00113] O termo “valor de referência”, como usado no presente documento, se refere a um critério predeterminado usado como uma referência para avaliar os valores ou dados obtidos das amostras coletadas de um indivíduo. Esse “valor de referência” pode também ser referido como “valor de corte” ou “valor limite”.

[00114] O valor de referência ou nível de referência pode ser um valor absoluto, um valor relativo, um valor que tem um limite superior ou inferior, uma faixa de valores, um valor de média, um valor de mediana, um valor médio, ou um valor quando comparado com um controle particular ou um valor de linha de base. Um valor de referência pode ser baseado em um valor de amostra individual ou pode ser baseado em um grande número de amostras, como as de populações de sujeito do grupo combinado por cronologia de idade, ou baseado em um conjunto de amostras que inclui ou exclui a amostra a ser testada.

[00115] Os níveis de expressão dos marcadores de proteína podem ser usados para calcular uma pontuação combinada para ser comparada com um valor de referência. A pontuação comparada é um valor obtido de acordo com uma fórmula matemática dada ou algoritmo em que os valores de expressão de cada um dentre os marcadores de proteína usados nos métodos da invenção são variáveis do dito algoritmo matemático. Em uma modalidade particular, ao calcular a pontuação comparada, esta é proporcional aos níveis de expressão de um ou mais dentre PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5, em que a quanto maior a pontuação, mais a probabilidade de aterosclerose subclínica.

[00116] Além disso, na etapa (c) o método sob o primeiro aspecto da invenção compreende classificar o indivíduo como tendo ou que apresenta uma alta probabilidade de ter aterosclerose subclínica de acordo com a comparação com o valor de referência, em que quando os níveis na amostra do indivíduo de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e/ou C5 são aumentados na amostra do indivíduo em relação ao valor de referência correspondente, isso é indicativo de aterosclerose subclínica.

[00117] Os níveis de biomarcadores são considerados “aumentados” quando seu valor é mais alto que um valor de referência. Preferencialmente, o níveis de biomarcador (ou a pontuação comparada) são considerados maiores que um valor de referência quando são de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%,

pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, ou mais alto que o valor de referência.

[00118] Da mesma maneira, os níveis de biomarcador são considerados “diminuídos” quando seu valor é menor que o valor de referência. Preferencialmente, os níveis de biomarcador (ou a pontuação comparada) são considerados menores que um valor de referência quando são de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, ou menor que o valor de referência.

[00119] Alternativamente ou em adição, sujeitos que têm mais de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 de desvio nos níveis de dobra em relação ao valor de referência como descrito no presente documento.

[00120] O método da invenção, como é compreendido por aqueles especialistas no assunto, não reivindica estar correto em 100% das amostras analisadas. Contudo, ele requer que uma quantidade estatisticamente significativa das amostras analisadas seja classificada corretamente. A quantidade que é estatisticamente significativa pode ser estabelecida por aqueles especialistas no assunto por meio do uso de diferentes medidas de significância estatística obtidas por testes estatísticos; exemplos ilustrativos, não limitadores das ditas medidas de significância estatística incluem determinar intervalos de confiança, determinar o valor p, etc. Intervalos de confiança preferenciais são pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%. O valor ps é, preferencialmente menor que0,1, menor que0,05, menor que0,01, menor que0,005 ou menor que0,0001, Os ensinamentos da presente invenção preferencialmente permitem classificar corretamente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% dos sujeitos de um grupo determinado ou população analisada.

[00121] É adicionalmente notado que a precisão do método da invenção pode ser adicionalmente aumentada ao considerados adicionalmente parâmetros bioquímicos e/ou características clínicas dos pacientes (por exemplo, idade, sexo, tabagismo e/ou outros fatores de risco cardiovascular), como incluídos nas pontuações de riscos cardiovasculares tradicionais.

[00122] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre as modalidades ou recursos como descrito no presente documento, o método de acordo com o primeiro aspecto da invenção adicionalmente compreende conduzir uma pontuação de risco cardiovascular tradicional. Tipicamente, pontuações de risco compreendem determinações bioquímicas e fisiológicas, assim como outras características clínicas e/ou de estilo de vida do indivíduo.

Preferencialmente, a dita pontuação de risco cardiovascular tradicional é selecionada dentre o grupo que consiste em 10- y FHS ou 30-Y FHS (Kannel et al., 1979; Splansky et al., 2007), ICHS (Fernández-Alvira et al., 2017) e as pontuações de BEWAT (Fernández-Alvira et al., 2017), com mais preferência em que a dita pontuação de risco cardiovascular é de 10-y FHS.

[00123] A dita pontuação de risco pode ser combinada com medições de proteína dentre PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e/ou C5 (incluindo qualquer combinação das mesmas como descrito no presente documento acima) usando combinações matemáticas apropriadas, preferencialmente usando modelos de regressão lógicas multivariados.

[00124] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com quaisquer uma dentre as modalidades ou recursos como descrito no presente documento, o dito método é preferencialmente um método para a triagem e/ou diagnóstico de aterosclerose subclínica e a medição de biomarcador é executada em uma amostra isolada de um indivíduo classificado como de baixo risco ao conduzir uma pontuação de risco cardiovascular tradicional. Por exemplo, o risco de doença coronária do coração (CHD) aos 10 anos em porcentagem pode ser calculada com ajuda da Pontuação de Risco de Framingham (10-y FHS). Indivíduos com baixo risco tem 10% ou menos risco de CHD aos 10 anos, com risco intermediário de 10-20%, e com alto risco de 20% ou mais. Contudo, deve-se lembrar que essas categorizações são arbitrárias.

[00125] Ademais, o método sob o primeiro aspecto da invenção pode compreender conduzir estudos de imageamento in vivo. Isso pode incluir, porém sem limitação a, análise de ultrassom vascular de 2/3 (bidimensional) de presença e morfologia de placas de aterosclerose e análise de tomografia computada da calcificação da artéria coronária.

Preferencialmente, estudos de imageamento adicionais in vivo são conduzidos naqueles sujeitos selecionados que apresentam na etapa c) os níveis de biomarcador indicativos de aterosclerose.

[00126] Os métodos da presente invenção ou qualquer uma das etapas do mesmo podem ser implementadas por um computador. Portanto, um aspecto adicional da invenção se refere a um método implementado por computador, em que o método é qualquer um dentro os métodos revelados no presente documento ou qualquer combinação dos mesmos.

[00127] Deve-se notar que qualquer programa de computador capaz de implementar qualquer um dentro os métodos da presente invenção ou usados para implementar qualquer um desses métodos ou qualquer combinação dos mesmos, também fazem parte da presente invenção. Esse programa de computador é tipicamente diretamente carregável na memória interna de um computador digital, que compreende porções de código de software para executar as etapas de comparar os níveis dos marcadores de proteína como descrito na invenção, dentre uma ou mais amostras biológicas de um indivíduo, com um valor de referência e determinar a presença ou probabilidade de ter aterosclerose subclínica, quando o dito produto é executado em um computador.

[00128] Também deve-se notar que qualquer dispositivo ou aparelho que compreende meios para realizar as etapas de qualquer um dentro os métodos da presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, ou executar um programa de computador capaz de, ou para implementar qualquer um dentre os métodos da presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, está incluído como parte formadora do presente relatório descritivo.

[00129] Os métodos da invenção podem também compreender o armazenamento dos resultados do método em um carreador de dados, preferencialmente, em que o dito carreador de dados é uma mídia legível por computador. A presente invenção adicionalmente se refere a uma mídia de armazenamento legível por computador que tem, armazenado na mesma, um programa de computador da invenção ou dos resultados de qualquer um dentre os métodos da invenção.

Como usado no presente documento, “uma mídia legível por computador” pode ser qualquer aparelho que pode incluir, armazenar, comunicar, propagar, ou transportar os resultados da determinação do método da invenção. A mídia pode ser um sistema eletrônico, magnético, óptico, eletromagnético, infravermelho ou semicondutor (ou aparelho ou dispositivo) ou a mídia de propagação.

[00130] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tem aterosclerose subclínica, em que dito o método compreende: a. identificar um indivíduo que tem aterosclerose subclínica pelo método para triagem, diagnóstico e/ou monitoramento conforme definido no presente documento; b. administrar no dito paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de um tratamento para prevenir/reduzir placas ateroscleróticas.

[00131] Esses podem incluir tratamentos para reduzir os níveis de colesterol HDL ou níveis de triglicerídeo totais; e/ou aumentar os níveis de colesterol HDL no plasma.

Estatinas estão, atualmente, entre as drogas mais terapeuticamente efetivas disponíveis para reduzir o nível de LDL no sangue. Estatinas também são conhecidas por aumentar os níveis de colesterol HDL e diminuir os níveis de triglicerídeo totais. Acredita-se que as estatinas perturbam a biossíntese de colesterol e outros esteróis no fígado ao inibir competitivamente a enzima redutase 3-hidroxi-3-metil- glutaril-coenzima A ("redutase HMG-CoA"). A redutase de HMG- CoA catalisa a conversão de HMG-CoA em mevalonato, que é taxa para determinar a etapa na biossíntese do colesterol.

Consequentemente, sua inibição leva a uma redução na taxa de formação de colesterol no fígado. Estatinas são bem conhecidas na técnica, e essas incluem, por exemplo pravastatina, sinvastatina, lovastatina, fluvastatina, atorvastatina e rosuvastatina.

Kit e uso de um Kit nos Métodos da invenção

[00132] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um kit para determinar os níveis de um ou mais dentre os marcadores de proteína como descrito no presente documento em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00133] O termo "kit" ou "kit de testagem" denota combinações de reagentes e adjuvantes necessários para uma análise. Embora um kit de testagem consista, na maioria dos casos, em várias unidades, elementos de análise de uma peça também estão disponíveis, que devem, da mesma maneira, ser considerados como kits de testagem.

[00134] Em uma modalidade particular, o kit de acordo com a invenção compreende reagentes adequados para a determinação dos níveis de expressão de proteína de um ou mais dentre os marcadores selecionados dentre o grupo que consiste em PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5,

[00135] Esses reagentes podem ser úteis para determinar os níveis de expressão do marcador (ou marcadores) de proteína alvo usando qualquer método adequado a descrito no presente documento acima. Por exemplo, a determinação dos níveis do dito marcador (ou marcadores) de proteína podem ser realizados pelo uso de um reagente de afinidade, (por exemplo, por um imunoensaio) como descrito sob o primeiro aspecto da invenção.

[00136] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre PIGR ou IGHA2 (preferencialmente PIGR e IGHA2); b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) um, dois, três, quatro ou cinco dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5; c. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00137] Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre PIGR ou IGHA2 (preferencialmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de PIGR e um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de IGHA2); b. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; e c. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre HPT, HEP2, ITIH1 ou C5; d. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso do dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00138] Em uma modalidade alternativa, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) ITIH1; b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2; c. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00139] Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) ITIH1; b. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; e c. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre PIGR, HPT, HEP2, IGHA2 ou C5; d. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00140] Em uma modalidade adicional alternativa, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) HPT; b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores selecionados dentre APOA, ITIH1, HEP2, C5, PIGR e IGHA2; c. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00141] Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) HPT; b. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; e c. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre PIGR, ITIH1, HEP2, IGHA2 ou C5; d. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00142] Ainda em modalidades adicionais alternativas, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores selecionados dentre ITIH1, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2; c. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00143] Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; b. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) HPT; e c. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) pelo menos um dentre PIGR, ITIH1, HEP2, IGHA2 ou C5; d. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00144] Ainda em modalidades adicionais alternativas, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) HEP2; b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) um, dois, três, quatro, cinco ou seis biomarcadores selecionados dentre ITIH1, HPT, APOA, C5, PIGR e IGHA2; c. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00145] Em uma modalidade preferencial, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre os recursos ou modalidades como descritas no presente documento, o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) HEP2; b. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) APOA; e c. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para)

pelo menos um dentre PIGR, ITIH1, HPT, IGHA2 ou C5; d. opcionalmente, compreende adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes para determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

[00146] Combinações preferenciais de biomarcadores a serem medidos e reagentes correspondentes (por exemplo, reagente de afinidades) são como descrito para o primeiro aspecto da invenção no presente documento acima.

[00147] Ademais, qualquer uma dessas modalidades, pode adicionalmente compreender um ou mais dentre os seguintes: - um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) IGHA1; - um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) IGHG1; ou - um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de (por exemplo, um reagente de afinidade para) IGHG2,

[00148] O termo “um reagente de afinidade para” como usado no presente documento se refere a um reagente de afinidade capaz de se ligar especificamente à proteína alvo recitada. Os vários reagentes de afinidades podem ser marcados com as mesmas ou diferentes etiquetas.

Preferencialmente, esses serão marcados com etiquetas diferentes para análises de multiplexação.

[00149] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com um ou mais dentre as modalidades ou recursos descritos no presente documento, o dito reagente de afinidade é um anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal. O reagente de afinidade pode se ligar em qualquer região linear ou conformacional (por exemplo, epítopo) específica para a proteína alvo.

[00150] Exemplos ilustrativos/não limitadores de anticorpos comercialmente disponíveis que se ligam especificamente nas proteínas como descrito no presente documento, incluem os seguintes: - Rat monoclonal PIGR (7C1, ABCAM) Número de catálogo ab170321, - Mouse Anti-Human IgA2 (A9604D2, Southern biotech) Número de catálogo 9140-01, - Complement C5 Monoclonal Antibody (12F3, thermo scientific) Número de catálogo HYB 029-02-02, - Rabbit monoclonal Anti-Lipoprotein (a) antibody [EPR6474, ABCAM) Número de catálogo ab125014, - ITIH1 Monoclonal Antibody (40B10 , thermo scientific) Número de catálogo LF-MA014, - IGHA1: mouse antihuman iga1 (souther biotech,9130-01)

- IGHG1: Mouse IgG1, Kappa Monoclonal (ABCAM, ab81032) - IGHG2: Mouse antihuman-igG2 monoclonal (SIGMA, I5635) Imunoensaios e reagentes de afinidade possíveis foram descritos no presente documento. Em uma modalidade particular, o dito imunoensaio é um ensaio ELISA.

[00151] Em algumas modalidades, o kit inclui os reagentes de afinidades mencionados acima para proteína (ou proteínas) alvo e um ou mais reagentes auxiliares. Um reagente de afinidade primário (por exemplo, um anticorpo primário) pode ser usado para capturar propósitos e um reagente de afinidade secundário (por exemplo, anticorpo secundário) para detectar propósitos.

[00152] O reagente de afinidade primário ou de captura é tipicamente um anticorpo monoclonal específico para a proteína alvo. Reagentes de afinidade secundários ou de detecção podem anticorpos monoclonais ou policlonais.

Também, esses podem ser derivados de qualquer organismo mamífero, incluindo camundongos, ratos, hamsters, cabras, camelos, frangos, coelhos, e outros.

[00153] O reagente de afinidade de detecção pode ser marcado. Uma etiqueta ou marcação pode qualquer composição que seja detectável. Quaisquer meios analíticos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar ou detectar o reagente de afinidade secundário. Esses meios incluem o use de espectroscopia, química, fotoquímica, bioquímica,

imunoquímica, ou óptica. A marcação pode ser, por exemplo, uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, e outras comumente usadas em um ELISA), uma marcação por rádio (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P), um composto químico luminescente (por exemplo, luciferina, e 2,3-dihidroftalazinedionas, luminol, etc.), uma tinta fluorescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, vermelho do Texas, rodamina, etc.), ou qualquer outra tinta conhecida na técnica.

[00154] A marcação pode ser acoplada diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de pares ligantes como biotina e avidina) ao reagente de afinidade de detecção de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Como indicado acima, uma grande variedade de marcações pode ser usada. A escolha da marcação pode depender da sensibilidade exigida, facilidade na conjugação com o composto, exigências e estabilidade, instrumentação disponível, ou provisões descartáveis.

[00155] Preferencialmente, o dito kit compreende um suporte sólido ou superfície que é revestida com o reagente de afinidade primário. O suporte sólido pode incluir qualquer suporte conhecido na técnica sobre o qual uma proteína dessa revelação pode ser imobilizada. Em algumas modalidades, os ditos suportes sólidos são placas de poços de microtitulação, corrediça (por exemplo, corrediças de vidro), chips (por exemplo, chips de proteína, chips biosensores, como chips Biacore), cartuchos microfluidos, cubetas, microesfera (por exemplo, microesferas magnéticas, microesferas xMAP®) ou resinas.

[00156] Reagentes auxiliares tipicamente usados em um imunoensaio, como um imunoensaio de suporte sólido, podem incluir, por exemplo, um armazenamento temporário de imobilização, um reagente de imobilização, um armazenamento temporário de diluição, um reagente de detecção, um armazenamento temporário de bloqueio, um armazenamento temporário de lavagem, um armazenamento temporário de detecção, uma solução de pausa, um armazenamento temporário de enxague de sistema, e uma solução de limpeza de sistema que são bem conhecidos pelos especialistas no assunto.

[00157] Recursos e modalidades preferenciais do kit da invenção são conforme definido acima para outros aspectos da invenção.

[00158] Em adição, a determinação dos níveis do dito marcador (ou marcadores) de proteína pode ser realizado por um método com base em espectometria de massa (MS), e o dito kit pode compreender o dito marcador não marcado e/ou o dito marcador estavelmente marcado para detecção por um método com base em espectometria de massa (MS), preferencialmente em que o marcador é marcado com uma etiqueta que compreende um ou mais isótopos estáveis. Átomos isotópicos que podem ser incorporados na etiqueta são átomos pesados, por exemplo 13C, 15N, 18O e/ou 34S, que podem ser distinguidos por MS.

[00159] Ainda em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de um kit do aspecto precedente em um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica como descrito no presente documento.

[00160] Recursos e modalidades preferenciais são conforme definido acima para outros aspectos da invenção.

[00161] É contemplado que quaisquer recursos descritos no presente documento podem opcionalmente ser combinados com qualquer uma dentre as modalidades de qualquer método, kit, use de um kit, ou programa de computador da invenção; e qualquer modalidade discutida nesse relatório descritivo pode ser implementada em relação a qualquer um desses. Será compreendido que modalidades particulares descritas no presente documento são mostradas a título de ilustração de não de limitação da invenção. Os principais recursos dessa invenção podem ser empregados em várias modalidades sem se afastar do escopo da invenção.

[00162] Todas as publicações e pedidos de patente estão incorporadas no presente documento com referência a mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[00163] O uso da palavra "um", ou "uma" pode significar "um," mas é também consistente com o significado de "um ou mais," "pelo menos um," e "um ou mais de um". O uso do termo “uma outra” pode também se referir a um ou mais.

O uso do termo "ou" nas reivindicações significa "e/ou" a menos que explicitamente indicado para se referir a apenas alternativas ou quando alternativas forem mutualmente excludentes.

[00164] Como usado nesse relatório descritivo reivindicação (ou reivindicações), as palavras "que compreende" (e qualquer forma do verbo compreender, como "compreende"), "que tem" (e qualquer forma do verbo ter, como "tem" e), "que inclui" (e qualquer forma do verbo incluir, como "inclui" e) ou "que contém" (e qualquer forma do verbo conter, como "contém" e) são inclusivas ou abertas e não excluem elementos adicionais, não recitados ou etapas do método. O termo “compreende” também engloba e revela expressivamente os termos “consiste em” e “consiste essencialmente em”. Como usado no presente documento, a frase "que consiste essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos materiais especificados ou etapas e aqueles que não afetam materialmente o as características básicas e de novidade da invenção reivindicada. Como usado no presente documento, a frase "consistem em” exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado na reivindicação exceto por, por exemplo, impurezas ordinariamente associadas com o elemento ou limitação.

[00165] O termo "ou combinações dos mesmos” como usado no presente documento se refere a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C, ou combinações dos mesmos” tem a intenção de incluir pelo menos um dentre: A, B, C, AB, AC, BC, ou ABC, e se a ordem for importante em um contexto particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, ou CAB. Continuando com esse exemplo, estão expressivamente inclusas combinações que contém repetições de um ou mais itens ou termos, como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, e assim por diante. O especialista no assunto deverá compreender que tipicamente não existe limite no número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que, de alguma outra maneira, seja aparente pelo contexto.

[00166] Como usado no presente documento, palavras de aproximação como, sem limitação, "cerca de", "em torno”, “aproximadamente” se refere a uma condição que ao ser muito modificado é compreendido que não deva ser necessariamente absoluta ou perfeita mas deve ser considerada próxima o suficiente para aqueles especialistas no assunto para garantir a que designação da condição está presente. A extensão na qual a descrição pode variar irá depender de quão grande uma mudança pode ser instituída e ainda sim ter um especialista no assunto que reconheça o recurso modificado como ainda tendo as características necessárias e possibilidades do recurso não modificado. Em geral, mas sujeita a discussão precedente, um valor numérico no presente documento que é modificado por uma palavra de aproximação como "cerca de" pode variar do valor estabelecido em ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10%. Consequentemente, o termo “cerca de” pode significar o valor indicado de ± 5% do seu valor, preferencialmente o valor indicado de ± 2% do seu valor, com mais preferência, o termo “cerca de” significa exatamente o valor indicado (± 0%).

[00167] Os exemplos a seguir servem para ilustra a presente invenção e não devem ser interpretados como limitadores do escopo da mesma Exemplos Exemplo 1 - Identificar Biomarcadores de Proteína de Aterosclerose Subclínica por meio de Proteômicos quantitativos - Coorte de PESA Visita 1 (PESA-v1)

1.1 Materiais e Métodos

[00168] Subcoorte de PESA: a análise proteômica é executada em plasma de 476 indivíduos. As amostras são pareadas de acordo com sexo, idade e histórico clínico. Todos os indivíduos de PESA foram sujeitos a imageamento e análise bioquímica extensiva como descrito previamente (Fernandez- Friera et al., 2015; Fernandez-Ortiz et al., 2013). De acordo com a extensão de aterosclerose subclínica, indivíduos foram classificados em quatro grupos usando a Pontuação de PESA (Fernandez-Friera et al., 2015): sem doença, doença focalizada, intermediária ou generalizada.

[00169] Proteômicos quantitativos através marcação isobárica multiplexada e análise quantitativa dos dados foram executadas seguindo protocolos detalhados configurados em nosso laboratório e já descritos (Burillo et al., 2016; Garcia-Marques et al., 2016; Gomez-Serrano et al., 2016; Latorre-Pellicer et al., 2016; Martin-Alonso et al., 2015).

Análises de identificação, quantificação e estatística e biológicas são feitas usando modelos desenvolvidos em nosso laboratório e totalmente descritos antes (Análises de espectometria de massa são executadas em uma máquina de armadilha de órbita quadrupolo (HF Armadilha de órbita, ThermoFisher).

[00170] As análises epidemiológicas são executadas como se segue. A seleção de um painel de biomarcadores potenciais em um subcoorte de PESA é executada através da análise valores de proteína quantitativos, determinados como descrito acima, usando o pacote SPSS através da construção linear multivariável ou modelos de regressão logística para prever a doença (em termos de número de placa, espessura, número de territórios afetados ou Pontuação de PESA), após ajuste através de todos os outros fatores de risco conhecidos

(por exemplo, colesterol, pressão arterial, gênero, idade, níveis de LDL e HDL). A análise de ROC é então executada para medir o aumento na capacidade de previsão do painel biomarcador sobre métodos existentes para prever o risco cardiovascular (por exemplo 10-y FHS, pontuações BEWAT ou ICHS).

1. 2 - Análise da Associação de Níveis de PIGR, APOA e C5 no Plasma com a Extensão de Lesões Ateroscleróticas em Indivíduos Assintomáticos Tabela 1 - Análise da Correlação de Níveis de PIGR, APOA e C5 no Plasma com Espessura de Placa Média (Medida por meio de eco 2D) ou com Placa de Burden (Medida por meio de eco 3D)

Espessura de placa Placa Burden (eco 2D) (eco 3D) as proteínas, Idade, Multivariável, Todas Multivariável, Todas ajustadas por 10-Y F Multivariável, todas ajustadas .por 10-Y Multivariável Todas ajustadas. por 30-Y Multivariatem Todas as proteínas Idade, Ajustadas por meio Fatores de Risco de todos os CVRF Adj.Por meio de Tabagismo, SBP as proteínas, as proteínas, as proteínas, Univariável Univariável Tabaco, SBP

AIICV F

F val. val. val. val. val. val. val.

FDR FDR p p p p p p p >sp|P01833|PIGR_HUMAN Receptor de imunoglobulina polimérica 2E-07 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0004 0,012 0,009 0,002 >sp|P08519|APOA HUMAN Apolipoproteína(a) 0,026 0,001 0,000 0,000 0,000 0,237 0,061 0,029 >sp|P01031|CO5_HUMAN Complemento C5 0,008 0,006 0,064 0,045 0,037 0,029 0,017 0,03 0,012 79/137 >sp|P04003|C4BPA_HUMAN C4b-cadeia alfa de proteína de ligação 0,007 0,002 0,057 0,055 >sp|P48740|MASP1_HUMAN Lectina serina protease 1 de ligação ao Mannan 0,029 0,002 >tr|Q5SQS3|Q5SQS3_HUMAN Lectina de ligação ao Mannan 0,037 0,022 >sp|P02748|CO9_HUMAN Componente 9 do complemento 0,032 0,034 >tr|B4E1Z4|B4E1Z4 HUMAN Fator de complemento B 0,042 0,055 >sp|P05546|HEP2_HUMAN Cofator 2 da heparina 0,008 0,021 >sp|P00742|FA10_HUMAN Fator de coagulação X 0,111 0,014 >sp|Q96IY4|CBPB2 HUMAN Carboxipeptidase B2 0,069 0,035 0,032 0,008 >sp|P00738|HPT_Haptoglobina humana 0,015 0,123 >sp|P00450|CERU HUMAN Ceruloplasmina 0,035 0,020 >sp|P55056|APOC4_HUMAN Apolipoproteína C-IV 0,195 0,034 0,004 >sp|P04114|APOB HUMAN Apolipoproteína B-100 0,016 0,003 0,091 >sp|P19827|ITIH1 HUMAN Cadeia pesada dos inibidores de inter alfa 0,2387 0,093 0,024 0,062 tripsina H1 >sp|Q9HDC9|APMAP_HUMAN Proteína associada à membrana plasmática de 0,019 adipócitos >sp|P36955|PEDF_HUMAN Fator derivado do epitélio pigmentar 0,023 >sp|P23142|FBLN1_HUMAN Fibulina-1 0,069 0,002 0,004 >sp|P06396|GELS_HUMAN Gelsolina 0,013 0,010 >sp|Q6UXB8|PI16_HUMAN Inibidor de Protease 16 0,069 0,001 0,019 >sp|P19320|VCAM1_HUMAN Proteína de adesão celular vascular 1 0,018

Multivariável, todas val. p 0,032 as proteínas, ajustadas por 10-Y F Placa Burden Multivariável, Todas (eco 3D) val. p as proteínas Idade, Tabaco, SBP val. p Ajustadas por meio de todos os CVRF

FDR 0,053 Univariável Multivariatem Todas val. p as proteínas, ajustadas. por 30-Y

F Espessura de placa Multivariável Todas val. p 0,052 as proteínas, ajustadas .por 10-Y (eco 2D)

F Multivariável, Todas val. p as proteínas, Idade, Tabagismo, SBP Adj.Por meio de val. p Fatores de Risco

AIICV

FDR 0,095 Univariável >sp|P04275|VWF HUMAN fator de von Willebrand

[00171] A tabela mostra como os níveis de plasma de PIGR, APOA e C5 tem forte correlação com qualquer um dentre as duas medições independentes da extensão de lesões ateroscleróticas mesmo após ajuste por um fator de risco convencional. Além disso, as três proteínas permanecem significativamente associadas a espessura de placa quando as três são tomadas juntas em um modelo multivariável que inclui fatores de riscos. Esse resultado significa que as três proteínas estão associadas com a placa independentemente uma das outras.

Tabela 2 - Análise de Correlação de Níveis de PIGR, APOA e C5 no Plasma com Espessura de placa média (Medida por meio de eco 2d) ou com Placa de Burden (Medida por meio de eco 3D) na Subpopulação de Indivíduos com Baixo risco De acordo com 10-y FHS.

Espessura de placa (eco 2D) Baixo risco Baixo risco 10-y F 10-y F Baixo risco 10-y F com Livre Fatores de CVRF CVR (N=44) (N=256) Multivariável, todas as Multivariável, todas as Multivariável, todas as proteínas proteínas proteínas FDR val. p val. p >sp|P01833|PIGR_HUMAN Receptor de imunoglobulina 0,02 0,028 polimérica >sp|P08519|APOA_HUMAN Apolipoproteína(a) 0,001 0,003 >sp|P01031|CO5_HUMAN Complemento C5 0,019 0,036 >sp|P04114|APOB_HUMAN Apolipoproteína B-100 0,001

[00172] A tabela mostra como os níveis de PIGR, APOA e C5, tomados juntos em um modelo multivariável, mantém a sua correlação com a extensão de lesões ateroscleróticas mesmo na subpopulação de indivíduos com baixo risco de acordo com 10-y FHS. Esses resultados indicam que essas proteínas podem independentemente e efetivamente rastrear a presença de lesões de aterosclerose em casos em que não há evidência de risco cardiovascular de acordo com fatores de risco clássicos.

1. 3 - Análise dos Níveis de proteína de PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 Camada Média e Íntimas proveniente da Aorta Humana sem ou com Lesões ateroscleróticas

[00173] Os dados mostrados na Figura 1 indicam que todas as proteínas selecionadas no Plasma como potenciais marcadores de aterosclerose subclínica, nomeadamente PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2, se acumularam na camada média e principalmente na camada íntima (placa), e que a acumulação é mais alta conforme a placa evolui da faixa do tipo gorduroso para a lesão do tipo fibrolipídica. Tal acumulação pode explicar (ou ser uma consequência de) os níveis de plasma aumentado em indivíduos com aterosclerose subclínica.

1. 4 - Análise do Desempenho dos Níveis de plasma de PIGR, APOA e ITIH1 (C5) como Previsores Independentes de Aterosclerose Subclínica Generalizada Tabela 3 - Análise de Regressão Logística de Níveis de PIGR, APOA, ITIH1 e C5 no Plasma como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem Doença vs Generalizada na Pontuação de PESA).

Pontuação de PESA (Normal vs Generalizada) regressão logística Multivariável, Multivariável, Multivariável, Multivariável, Multivariável, todas as todas as todas as todas as todas as Ajuste por meio proteínas, proteínas, proteínas, proteínas, proteínas, de todos os CVRF ajuste por meio ajuste, por ajuste por meio ajuste por meio ajuste, por de Idade, meio de 10-Y F de 30-Y F de BEWAT meio de ICHS Tabagismo val. OU 95% CI val OU 95% CI val OU 95% CI val OU 95% CI val OU 95% CI p . p . p . p . p PIGR 0 1,441,19 1,7 0 1,4 1,2 1,8 0 1,44 1,2 1,7 0 1,4 1,1 1,7 0 1,5 1,2 1,8 0 1,5 1,2 1,8 5 8 2 1 3 2 9 3 8 3 4 9 4 APOA 0,0191,121,02 1,2 0 1,1 1,0 1,2 0 1,12 1,0 1,2 0,0 1,1 1,0 1,2 0,0 1,1 1,0 1,2 0 1,1 1,0 1,2 2 5 5 7 3 3 3 2 1 2 2 1 2 3 1 1 2 1 C5 0,03 1,371,03 1,8 3 ITIH1 0,024 1,6 1,07 2,4 0 1,8 1,2 2,7 0 1,92 1,3 2,8 0 1,8 1,2 2,6 0 1,8 1,2 2,6 0 1,8 1,2 2,6 1 3 2 6 7 2 2 3 4 4 7 7 4 7 6

[00174] Os dados mostram que cada um dentre os níveis de PIGR, APOA, ITIH1 e C5 no Plasma é um previsor independente de aterosclerose subclínica generalizada mesmo quando fatores de risco conhecidos são incluídos no modelo logístico modelo logístico. Em adição, PIGR, APOA e ITIH1, juntos, são também previsores independentes na presença de pontuações de risco conhecidas como 10-y FHS, 30-Y FHS, BEWAT ou ICHS. Sem a intenção de ser limitado pela teoria, na análise de regressão nós observamos que C5 e ITIH1 tem forte covariância, de modo que eles aparentam ser dependentes. A covariância observada poderia sugerir que C5 e ITIH1 podem ser intercambiáveis (se ITIH1 não for considerado no modelo multivariável, então C5 se comporta como previsor independente junto com PIGR e APOA e qualquer um dentre os fatores de risco conhecidos) Tabela 4 - Análise de Regressão Logística de Níveis de PIGR, APOA e ITIH1 no Plasma como Previsores de Doença Generalizada na Subpopulação de Indivíduos com Baixo Risco de acordo com 10-y FHS ou 30-Y FHS.

Pontuação de PESA (Normal vs Generalizada) População de baixo População de baixo risco 10-Y F risco 30-Y F Multivariável Multivariável (Todos) (Todos) val. OU 95% CI val. OU 95% CI p p >sp|P01833|PIGR_HUMAN Receptor de imunoglobulina 0,00 1,33 1,08 1,65 0,02 1,46 1,05 2,03 polimérica 9 1 5 2 >sp|P08519|APOA_HUMAN Apolipoproteína(a) 0,00 1,17 1,05 1,29 3 3 >tr|B4E1Z4|B4E1Z4_HUMAN Fator de complemento B 0,02 1,59 1,05 2,39 8 3

>sp|P19827|ITIH1_HUMAN cadeia pesada de inibidor 0,00 2,38 1,42 3,99 0,03 2,53 1,1 5,85 de inter alfa tripsina 1 1

[00175] A Tabela 4 mostra que PIGR, APOA e ITIH1 mantém suas habilidades de serem previsores independentes de doença generalizada mesmo na subpopulação de indivíduos com baixo risco de acordo com 10-y FHS. A tabela também mostra que PIGR e ITIH1 mantém suas habilidades de serem previsores independentes de doença generalizada mesmo na subpopulação de indivíduos com baixo risco de acordo com 30-Y FHS. Esses resultados indicam que essas proteínas podem efetivamente prever a presença de lesões de aterosclerose em casos em que não há evidência de risco cardiovascular de acordo com fatores de risco clássicos.

1. 5 - Análise da Associação com Aterosclerose e da Capacidade de Prever Aterosclerose Generalizada de Níveis de IGHA2 no Plasma Tabela 5 - Análise de Correlação de Níveis de IGHA1, IGHA2, IGHG1 e IGHG2 no Plasma com Espessura de Placa Média (Medida por meio de eco 2d)

Espessura de placa Baixo População risco Completa 10-y F Regressão linear Ajuste Bivariável por meio de 10-Y F Univariável Univariável val. p val. p val. p IGHA1 0,281 0,316 0,416 IGHA2 0,0012 0,01 0,016 (Aumentou) IGHA2-IGHA1 4E-06 0 0,003 IGHG1 0,0016 0,009 0,103 (Diminuiu) IGHG2 0,0013 0,017 0,197 (Diminuiu) IGHA2 Média (IGHG1,IGHG2) 5E-07 0 0,001

[00176] A tabela mostra que a espessura de placa correlaciona com abundância aumentada de IGHA2 (mas não de IGHA1) e com abundância diminuída de IGHG1 ou IGHG2, independentemente de 10-y FHS. A correlação com IGHA2 é mantida mesmo na subpopulação de indivíduos com baixo risco de acordo com 10-y FHS. A razão IGHA2/IGHG1 tem uma correlação ainda mais forte que IGHA2 sozinha. A razão IGHA2/média (IGHG1, IGHG2) é ainda maior. Esses resultados sugerem que a espessura de placa correlaciona com comutador de isótopo Ig.

Tabela 6 - Análise de Regressão Logística de Níveis de

IGHA1, IGHA2, IGHG1 e IGHG2 no Plasma como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem Doença vs Generalizada na Pontuação de PESA).

Pontuação de PESA TODA População (Extremos) População de baixo risco 10-Y F Regressão logística Teste Bivariável (Ajuste t Univariável 10-Y F) Univariável val. val. OU 95% CI val. OU 95% CI val. OU 95% CI p p p p 0,8976 0,88 0,99 0,89 1,10 0,85 1,01 0,90 1,13 0,62 0,96 0,84 1,10 IGHA1 01 7 3 5 1 2 1 2 2 7 8 7 5 5E-05 0 1,27 1,12 1,43 0 1,27 1,11 1,45 0,00 1,28 1,09 1,10 IGHA2 7 1 2 5 1 2 8 5 1E-05 0 1,32 1,16 1,51 0,00 1,26 1,10 1,44 0,00 1,30 1,11 1,53 IGHA2-IGHA1 7 6 1 1 2 4 1 8 1 9 0,01 0,01 0,80 0,68 0,95 0,04 0,83 0,69 0,99 0,09 0,84 0,68 1,02 IGHG1 3 9 4 6 5 2 1 7 8 0,031 0,03 0,87 0,77 0,99 0,26 0,92 0,81 1,05 0,55 0,95 0,82 1,10 IGHG2 4 6 5 1 7 3 8 2 6 4 9 IGHA2-Média (IGHG1, 8E-08 0 1,33 1,19 1,49 0 1,30 1,15 1,48 0 1,30 1,13 1,50 IGHG2) 3 1 2 8 7 6 1 8

[00177] A tabela mostra que o nível IGHA2 no Plasma (corrigido ou não por outras Igs), exceto aqueles de IGHA1, é um previsor independente de aterosclerose subclínica generalizada mesmo quando a pontuação de risco 10-y FHS é incluída no modelo logístico. Esse efeito é mantido na população com baixo risco.

1. 6 - Análise do Desempenho dos Painéis Biomarcadores como Previsores Independentes de Aterosclerose Subclínica Generalizada Tabela 7 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) de Várias Pontuações de Risco e Fatores de Risco como

Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem Doença vs Doença Generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI valor p 10-y FHS 0,713 0,658 0,768 0 BEWAT 0,613 0,552 0,674 0 ICHS 0,611 0,55 0,672 0,001 Tabaco 0,689 0,631 0,748 0 Idade 0,713 0,658 0,769 0

[00178] A tabela mostra como as três pontuações de risco, assim como fatores de risco individuais, são capazes de produzir uma discriminação estatisticamente significativa de indivíduos sem doença e aqueles com doença generalizada.

Tabela 8 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) de PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem doença vs Doença Generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI valor p PIGR 0,66 0,6 0,719 0 APOA 0,573 0,51 0,636 0,024 ITIH1 0,579 0,517 0,641 0,014 C5 0,61 0,549 0,671 0,001 IGHA2 0,634 0,573 0,694 0

[00179] A tabela mostra que cada um dentre as proteínas individuais são capazes de produzir uma discriminação estatisticamente significativa entre no indivíduos sem doença e aqueles com doença generalizada.

Tabela 9 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) de Vários Painéis que Contém Três Proteínas Provenientes do Grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2, como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem doença vs Doença Generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI valor p PIGR+AP0A+C5 0,707 0,651 0,764 0 IGHA2+AP0A+ITIH1 0,686 0,627 0,745 0

[00180] Quando comparada com os dados na Tabela 7, essa tabela mostra que é possível usar combinações de três proteínas que são capazes de discriminar entre indivíduos sem doença e aqueles com doença generalizada com um desempenho similar ou melhor que aqueles das pontuações de risco amplamente usados.

Tabela 10 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) de 10-y FHS Sozinho ou em Combinação com Diferentes Painéis de Proteínas, como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem doença vs Doença Generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI 10-y FHS 0,713 0,658 0,768 10-y FHS+PIGR+APOA+C5 0,767 0,715 0,819 10-y FHS+PIGR+APOA+ITIH1 0,78 0,729 0,83 10-y FHS+IGHA2+APOA+C5 0,784 0,734 0,834

Curvas de ROC 10-y FHS+IGHA2+APOA+ITIH1 0,779 0,728 0,83 10-y FHS+PIGR+IGHA2+APOA+C5+ITIH1 0,812 0,764 0,86

[00181] A tabela mostra que a adição no 10-y FHS dos painéis que contém várias proteínas dentro o grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produz um desempenho discriminatório significativamente mais alto que aquele do 10-y FHS sozinho (como deduzido dos intervalos de confiança de 95% dos valores de AUC). Esses resultados indicam que o painel de proteína pode servir para melhorar significativamente a previsão de aterosclerose subclínica em comparação com padrões concorrentes.

Tabela 11 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) do ICHS Sozinho ou em Combinação com Diferentes Painéis de Proteínas, como previsores de Doença generalizada na População de PESA (Sem doença vs Doença generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI 0,611 055 0,672 ICHS 0,708 0,651 0,764 ICHS+PIGR+APOA+C5 0,718 0,662 0,774 ICHS+PIGR+APOA+ITIH1 0,721 0,664 0,778 ICHS+IGHA2+APOA+C5 0,699 0,64 0,758 ICHS+IGHA2+APOA+ITIH1 0,763 0,711 0,816 ICHS+PIGR+IGHA2+APOA+C5+ITIH1 0,664 0,605 0,724 ICHS+IGHA2

[00182] A tabela mostra que a adição ao ICHS de painéis que contém várias proteínas provenientes do grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produz um desempenho discriminatório significativamente maior que aquele do ICHS sozinho (como deduzido dos intervalos de confiança de 95% dos valores de AUC). Esses resultados indicam que o painel de proteína pode servir para melhorar significativamente a previsão de aterosclerose subclínica em comparação com padrões os atuais.

Tabela 12 - Análise da Curva de Recepção e Operação (ROC) da Pontuação de BEWAT Sozinha ou em Combinação com Diferentes Painéis de Proteínas, como Previsores de Doença Generalizada na População de PESA (Sem doença vs Doença Generalizada).

Curvas de ROC AUC 95% CI 0,613 0552 0,674 BEWAT 0,711 0,654 0,768 BEWAT+PIGR+APOA+C5 0,725 0,669 0,781 BEWAT+PIGR+APOA+ITIH1 0,727 0,67 0,784 BEWAT+IGHA2+APOA+C5 0,712 0,654 0,77 BEWAT+IGHA2+APOA+ITIH1 0,767 0,715 0,819 BEWAT+PIGR+IGHA2+APOA+C5+ITIH1 0,665 0,606 0,724 BEWAT+IGHA2

[00183] A tabela mostra que a adição à Pontuação de BEWAT dos painéis que contém várias proteínas provenientes do grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produz i, desempenho discriminatório significativamente mais alto que aquele da

BEWAT sozinha (como deduzido de intervalos de confiança de 95% dos valores AUC). Esses resultados indicam que o painel de proteína pode servir para melhorar significativamente a previsão de aterosclerose subclínica em comparação com os padrões atuais.

Exemplo 2 - Confirmar Estabilidade das Alterações de Abundância de Proteína Ao longo do Tempo – Coorte de PESA Visita 2(PESA-v2) & Validar o Painel Biomarcador Obtido por meio de Análise Imunoturbidimétrica

2.1 - Materiais & Métodos

[00184] Amostras de plasma. Amostras de plasma foram coletadas do estudo de Coorte de PESA (Fernandez-Friera L et al., 2015) e coorte de AWHS. (Casasnovas JA et al., 2012) Para a fase de descoberta, um estudo de controle de caso aninhado dentro da coorte de PESA prospectiva foi projetado (PESA-V1). Para contabilizar o potencial de confusão e para aumentar a eficiência, o estudo foi restringido aos homens, e controles foram combinados para os fatores de risco CV.

Primeiramente, 222 sujeitos de caso foram selecionados dentre participantes com aterosclerose extensiva subclínica, definidos como sujeitos com 3 ou mais territórios vasculares afetados. Sujeitos de controle foram selecionados em uma escala de 1:1, entre participantes sem aterosclerose extensiva subclínica, definidos como sujeitos com nenhum ou 1 território vascular afetado. Os sujeitos de controle foram combinados com sujeitos de caso com base na idade (calibre: 3 anos), hipertensão, dislipidemia e diabetes. Amostras de plasma provenientes dos mesmos indivíduos foram também coletadas três anos depois(PESA-V2), exceto dois casos e seus controles combinados que não renovaram seu consentimento para análise “ômica”. O conjunto de validações foi projetado dentro do coorte de AWHS seguindo a mesma metodologia. Um controle de caso aninhado, restrito a homens e combinado por idade, hipertensão, dislipidemia e diabetes foi executado. Duzentos e vinte sujeitos de caso foram selecionados dentre os participantes com aterosclerose extensiva subclínica, definidos como sujeitos com 3 ou mais territórios vasculares afetados. O mesmo número de sujeitos de controle foi selecionado dentre os participantes de controle sem aterosclerose extensiva subclínica, definidos como sujeitos com 2 ou menos territórios vasculares afetados.

[00185] Avaliação de Fatores de risco CV e aterosclerose subclínica. No estudo de PESA, fatores de risco CV foram prospectivamente coletados por meio de questionários (histórico familiar, fumo) ou quantificação objetiva (hipertensão, diabetes, dislipidemia) como previamente descrito. (Fernandez-Friera L et al., 2015).

Duas tomografias computadorizadas sem contraste e de ultrassom vascular dimensional foram executadas em todos os participantes como previamente descrito. (Fernandez-Friera

L et al., 2015; Fernandez-Friera L et al., 2017) A presença de placas ateroscleróticas através de ultrassom foi avaliada pela varredura de corte transversal de artérias carótidas, infrarenal abdominal aorta, e iliofemoral. A identificação de placas em tanto as artérias carótida quanto femoral e as características clínicas no estudo de foram determinadas como descrito (Laclaustra M et al., 2016).

[00186] Amostras de tecido. Amostras de tecido aórticas provenientes das camadas média e íntima foram obtidas de doadores de órgãos falecidos com a autorização da Agência de Biomedicina da França (PFS 09-007, BRIF BB-0033- 00029; AoS BBMRI-EU /infrastructure BIOBANQUE; No. Access : 2, Last : 15 de abril de 2014, [BIORESOURCE]). Algumas dessas amostras foram macroscopicamente normais (AoS) e desprovidas de lesões ateromatosas iniciais e foram usadas como controles de saúde (9 indivíduos) para comparação com aquelas amostras com faixas gordurosas (FS) (7 indivíduos para a camada média e 6 no caso da camada íntima) ou placas fibrolipídicas (FL) (11 indivíduos no caso da camada média e 12 no caso da camada íntima). O tecido (100 mg de FL, FS ou AoS) foi homogeneizado em baixa temperatura, e lisatos foram ressuspensos em armazenamento temporário (50 mM iodoacetamida (Sigma), 1% SDS, 1mM EDTA, 100 mM Tris-HCL, pH 8,5) para extração de proteína ou em TRIZOL para isolamento de mRNA. Proteínas foram extraídas por meio de vórtex em amostras 4 vezes com

15min de intervalos no gelo. Proteínas na sobrenadante foram medidas pelo método BCUm e armazenadas à -80 ºC até a análise proteômica.

[00187] Análise Proteômica. Plasma e amostras de proteína de tecido foram sujeitas a digestão auxiliada por filtro tripsina de acordo com instruções do fabricante (Nanosep Centrifugal Devices com Omega Membrane-10K, PALL), e os peptídeos resultantes para marcação isobárica multiplexada com reagentes TMT (Thermo Fisher Scientific).

(Baldan-Martin M et al., 2018; Bagwan N et al., 2018) Dois dentre os 10 canais foram reservados para amostras padrão de referência interna criados juntando as amostras. Peptídeos de plasma foram separados em cinco frações usando um kit de fracionamento de peptídeo de fase reversa de alto pH (Thermo Fisher Scientific), e peptídeos de tecido foram separados em oito frações usando cartuchos OASIS MCX. Cada fração de plasma foi analisada por LC-MS/MS usando um sistema Ultimate 3000 HPLC (Thermo Fisher Scientific) acoplado através de uma fonte de íon de nanoelectrospray (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha) a um espectrômetro de massa HF Exactive Q (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha). (Bagwan N et al., 2018) Frações de tecido foram analisadas em um sistema de cromatografia líquida Easy nLC 1000 acoplado a um espectrômetro de massa de Armadilha de Fusão de órbita Fusion (Thermo Scientific). (Baldan-Martin M et al., 2018)

[00188] Análise Imunoturbidimétrica. Níveis de plasma de IGHA2, HPT e APOA foram medidos por meio de ensaios Imunoturbidimétricos (LK088,OPT, NK058,OPT e LK098,OPT, respectivamente) usando o analisador de Ligação de Sítio Optilite. A análise foi executada de uma maneira blindada por um técnico da companhia do Ligante de Sítio.

[00189] Análise estatística. Identificação de peptídeo, quantificação e estatística e análises de biologia de sistemas foram executadas usando os modelos desenvolvidos em nosso laboratório (Navarro P et al., 2014; Navarro P e Vazquez J, 2008; Jorge I et al., 2009; Garcia-Marques F et al., 2016; Bonzon-Kulichenko E et al., 2016; Martinez- Bartolome S et al., 2008). Informações quantitativas foram extraídas do espectro MS/MS dos peptídeos marcados com TMT.

Quantificação de peptídeos foi analisada usando o modelo WSPP, que usa quantificações cruas como dados de entrada e computa as alterações de log2-fold de proteína para cada indivíduo em relação ao valor médio de duas amostras padrão internas de referência. Nesse modelo, razões de proteína log2 são expressas como variáveis padronizadas em unidades de desvio padrão de acordo com suas variâncias estimadas (valores Zq).

[00190] Modelos de regressão logística e ajuste linear e foram usados para analisar a associação de proteínas com de presença e extensão de aterosclerose usando software

SPSS (IBM, Armonk, Nova Iorque). Uma análise multivariável foi conduzida para explorar variáveis candidatas com uma associação clínica: glucose, LDL, HDL, pressão arterial diastólica e sistólica, fumo, e idade.

Associações foram expressas como razões de probabilidade (ORs) com 95%

intervalos de confiança (CI). Diferenças foram consideradas significativas em um valor p<0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.

A estatística C ou área sob a curva característica operadora de receptor (ROC) (AUC) foi calculada para cada modelo como uma medida da capacidade discriminatórias de cada painel biomarcador de proteína.

A comparação do índex C para modelos que incluem e não foi informações fornecidas pelos painéis biomarcador foram executadas de acordo com o método de DeLong (DeLong ER et al., 1988). Para avaliar se o painéis biomarcadores ajudaram a classificar corretamente indivíduos de acordo com presença e extensão de aterosclerose subclínica, nós calculamos o índice de reclassificação de rede de categoria usando quatro categorias de risco discretas (NRI0,25), e o índice de reclassificação de rede livre de categoria (NRI>0), também chamado de índex de reclassificação de rede contínua (Kerr

KF et al., 2014, Pepe MS et al., 2015; Leening MJ et al.,

2014), que não depende da escolha arbitrária de categorias,

mas considera qualquer mudança no risco previsto na direção correta como apropriado.

Na subpopulação de baixo risco nós avaliamos se os painéis biomarcadores ajudaram a classificar indivíduos de acordo com a presença de aterosclerose subclínica usando duas categorias de risco (risco/sem risco) (NRI0,5).

Projeto de Estudo

[00191] O relatório atual examina um subcoorte do estudo de PESA. (Fernandez-Ortiz A et al., 2013). A primeira coorte, usada para a fase de descoberta (PESA-V1), incluiu 444 homens com uma idade média de 48,5 anos, organizados em 222 pares de indivíduos sem histórico clínico de aterosclerose. Características clínicas completas do coorte de PESA-V1 são detalhados na tabela 13, Amostras de plasma de PESA-V1 foram analisadas por proteômicos quantitativos profundos.

Tabela 13 - Características da População de PESA-V1 Usadas para a Fase de Descoberta Sem Aterosclerose aterosclerose (n=222) (n=222) Idade (anos) 48 ±4 49 ±4 SBP (mmHg) 120 ±12 124 ±12 DBP (mmHg) 75 ±9 77 ±9 Glucose em jejum (mg/dl) 94 ±11 96 ±15 Colesterol total (mg/dl) 201 ±33 210 ±36 LDL-C (mg/dl) 136 ±30 143 ±33 HDL-C (mg/dl) 44 ±10 43 ±10 Triglicerídeos (mg/dl) 106 ±58 121 ±65 Fumo atual 25% 41%

[00192] A estabilidade das alterações de abundância de proteínas detectadas ao longo do tempo foi confirmada por meio da repetição da análise proteômica com plasma coletado dos mesmos indivíduos três anos depois (PESA-V2) (exceto para os quatro indivíduos que não renovaram seus consentimentos para análises “ômicas”); as características clínicas de indivíduos PESA-V2 são retratadas na Tabela Suplementar 1, Os proteômicos quantificaram uma média de 1093 proteínas por indivíduo, e 454 proteínas poderiam ser quantificadas em mais de 80% dos indivíduos. As análises das 884 amostras de plasma exigem um total de 560 execuções de LC-MS.

Tabela 14 - Características da População de PESA-V2 Sem Aterosclerose aterosclerose (n=220) (n=220) Idade (anos) 48 ±4 49 ±4 SBP (mmHg) 120 ±12 124 ±12 DBP (mmHg) 75 ±9 77 ±9 Glucose em jejum (mg/dl) 94 ±11 97 ±21 Colesterol total (mg/dl) 201 ±33 209 ±37 LDL-C (mg/dl) 137 ±29 141 ±34 HDL-C (mg/dl) 46 ±11 44 ±10 Triglicerídeos (mg/dl) 102 ±50 121 ±65 Fumo atual 21% 34% Valores são médios de ± SD ou %

[00193] Para a fase de validação, nós examinamos um terceiro coorte de 350 homens provenientes do Estudo de Saúde

Aragon Workers. Esse coorte teve uma idade média de 50,3 anos e foi organizada em 175 pares de indivíduos sem histórico de doença CV clínica e com características clínicas similares àquelas do subcoorte de PESA (Tabela 15).(Casasnovas JA et al., 2012; Laclaustra M et al., 2016) Amostras de plasma provenientes do coorte de AWHS foram analisadas por turbidimetria usando anticorpos comercialmente disponíveis contra proteínas selecionadas.

Tabela 15 - Características da População de AWHS Usadas para a Fase de validação Sem Aterosclerose aterosclerose (n=175) (n=175) Idade (anos) 49,6 ±4,1 51,0 ±3,6 SBP (mmHg) 122,1 ±12,0 125,8 ±13,9 DBP (mmHg) 81,4 ±8,7 82,5 ±8,8 Glucose em jejum (mg/dl) 98,2 ±17,9 98,3 ±17,2 Colesterol total (mg/dl) 215,41 ±35,5 221,6 ±37,3 HDL-C (mg/dl) 54,0 ±11,1 50,4 ±10,4 Fumo atual 17% 44% Valores são médios de ± SD ou %

2.1 - Associação de Proteínas de Plasma com Fatores de Risco Tradicionais

[00194] A rede de correlação foi construída incluindo as proteínas as quais os níveis foram significativamente correlacionados com Fatores de risco CV tradicionais contínuos tanto nos conjuntos de amostra de PESA-V1 quanto na PESA-V2; os fatores de risco CV considerados foram glucose, idade, pressão arterial diastólica e sistólica, colesterol, LDL e HDL (Figura 2). A maioria das correlações foram de apolipoproteínas e outras proteínas implicaram em transporte de lipídeo, que mostrou uma correlação positiva com o colesterol LDL e HDL. Além dessas associações esperadas, não houveram padrões de associação claros com outros fatores, sugerindo que, na fase subclínica, Fatores de risco CV tradicionais tem um impacto limitado no proteoma de plasma.

2.2 - Associação de Proteínas de plasma com Espessura de Placa e Pontuação de Cálcio

[00195] A associação entre níveis de proteínas plasmáticas e espessura de placa foi avaliada por análise de regressão linear corrigida por testagem de hipóteses múltiplas. Essa análise revelou uma lista de proteínas de plasma que mostraram correlação significativa (FDR < 5%) com espessura de placa em PESA-V1 (Tabela 16). A maioria das proteínas mantidas na correlação com espessura de placa com um FDR abaixo de 15% no acompanhamento de 3 anos (PESA-V2) (Tabela 16). A maioria dessas proteínas foram relacionadas com a reposta imune humoral, incluindo o receptor de imunoglobulina polimérica (PIGR) e IGHA2, que foram aumentados, e constante de imunoglobulina pesada gamma 2

(IGHG2), constante de imunoglobulina kappa (IGKC), constante de imunoglobulina pesada gamma 1 (IGHG1) e constante de imunoglobulina lambda 2 (IGLC2), que foram diminuídas.

Proteína de ligação HPT, C4- (C4BP), cofator 2 da heparina (HEP2), APOA, componente 9 de complemento (CO9) e gelsolina (GELS) também mantiveram sua correlação com a espessura de placa três anos depois (Tabela 16). Nós também notamos proteína de adesão vascular 1 (VCAM1) e fator de von Willebrand (VWF), duas proteínas consideradas como biomarcadores de disfunção endotelial, diminuíram seus níveis com espessura de placa em PESA-V1 (Tabela 16). Embora essa tendência tenha sido contrária ao esperado, essa observação não foi reproduzida em PESA-V2, Tabela 16 - Proteínas que Mostraram Correlação Significativa com Espessura de placa. Análise de regressão Linear foi Executada para Medir a Correlação Entre Espessura de Placa e Níveis de Proteínas Plasmáticas em PESA-V1 e PESA- V2, Significância estatística do Coeficiente de Correlação de Pearson foi Expresso em Termos de Taxa de Descoberta Falsa (FDR). Proteínas que Têm um Correlação Significativa são Listadas em V1 (FDR ≤ 5%) e em V2 (FDR ≤ 15%).

Proteínas PESA-V1 PESA-V2 Aumentada val. p FDR val. p FDR Receptor de imunoglobulina <0,001 <0,001 0,002 0,044 polimérica (PIGR) C4b cadeia alfa de proteína de <0,001 0,009 0,022 0,120 ligação (C4BPA)

Proteínas PESA-V1 PESA-V2 Cofator 2 da heparina (HEP2) <0,001 0,012 <0,001 0,027 Haptoglobina (HPT) <0,001 0,021 <0,001 <0,001 Apolipoproteína(a) (APOA) <0,001 0,037 0,021 0,115 Ig região C de cadeia alfa 2 (IGHA2) 0,001 0,041 0,002 0,044 Componente 9 do complemento (CO9) 0,002 0,045 0,004 0,061 Diminuída val. p FDR val. p FDR Gelsolina (GELS) <0,001 0,018 <0,001 <0,001 Ig região C de cadeia kappa (IGKC) <0,001 0,019 0,010 0,089 Ig região C de cadeia gamma 1 (IGHG1) 0,002 0,041 0,010 0,085

[00196] Em geral, as correlações com espessura de placa em PESA-V1 foram reproduzidas em PESA-V2 (Figura 3A).

Curiosamente, as proteínas relacionadas à reposta imune humoral foram, dentre aquelas as que mais mantiveram em V2 a correlação observada em V1 (Figura 3A). A associação oposta com espessura de placa de IGHA2 e constante de imunoglobulina pesada delta (IGHD) em comparação com aquelas dentre IGLC2, IGKC, IGHG1 e IGHG2, juntas com falta de correlação para isótopos relacionados de constante de imunoglobulina pesada alfa 1 (IGHA1) e constante de imunoglobulina pesada gamma 3 e 4 (IGHG3 e IGHG34, respectivamente), sugeriram que a formação da placa está associada com um comutador isotópico.

[00197] Entre as proteínas que correlacionaram correlacionados com a espessura de placa, nós julgamos que IGHA2, PIGR, HEP2, HPT, APOA, GELS, IGKC, IGLC2 e IGHG1 foram as proteínas que mais mantiveram a correlação tanto em PESA- V1 e V2 após ajuste por fatores de riscos individuais usando análise de regressão linear multivariável(Tabela 17).

Tabela 17 - Correlação de Níveis de Proteínas Plasmáticas com Espessura de Placa. Análise de Regressão Linear Bivariada foi Executada para Medir a Correlação Entre Espessura de Placa e os Níveis das Proteínas de Plasma Indicadas em PESA-V1 e PESA-V2 Coortes após Ajuste por Cada um dentre os Fatores de Risco Conhecidos. Significância Estatística do Coeficientes de Correlação de Pearson Expressos em Termos do Valor p.

V1 V2

Ajuste Bivariável por meio

Ajuste Bivariável por meio Proteínas de Glucose de Glucose de Tabaco de Tabaco de Idade de Idade de LDL de HDL de SBP de DBP de LDL de HDL de SBP de DBP Aumentada val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p Ig região C de cadeia alfa 2 (IGHA2) 0,004 0,002 0,002 0,003 0,003 0,015 0,015 0,009 0,004 0,003 0,009 0,006 0,011 0,022 Receptor de imunoglobulina polimérica (PIGR) 1,55S-09 8,96E-10 1,08E-09 5,55E-10 1,04E-09 6,48E-05 4,43E-10 0,009 0,004 0,005 0,001 0,002 0,342 0,001 Cofator 2 da heparina (HEP2) 0,000897 0,000172 0,000223 0,000303 0,000367 0,0039 0,000223 0,006 0,001 0,002 0,005 0,005 0,046 0,001 Haptoglobina (HPT) 0,003 0,001 0,001 0,002 0,001 0,142 0,001 9,63E-6 6,08E-07 1,24E-06 1,07E-05 6,35E-06 0,002 1,55E-06

105/137 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,001 0,002 0,002 0,002 0,002 0,003 0,000426 0,026 0,03 0,037 0,076 0,063 0,039 0,018 Componente 9 do complemento (CO9) 0,338 0,003 0,004 0,002 0,002 0,119 0,009 0,004 0,03 0,009 0,009 0,009 0,19 0,032 C4b-cadeia alfa de proteína de ligação (C4BPA) 0,000271 0,000177 0,000211 0,000244 0,000247 0,002 0,000114 0,06 0,024 0,049 0,103 0,098 0,1 0,078

Diminuída val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p Gelsolina (GELS) 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,004 0,000139 3,76E-06 3,76E-06 7,68E-06 1,29E-05 7,44E-05 0,000143 Ig região C de cadeia kappa (IGKC) 0,000465 0,001 0,001 0,00385 0,001 0,006 0,0004 0,027 0,015 0,02 0,027 0,028 0,094 0,009 Ig regiões C de cadeia lambda 2 (IGLC2) 0,005 0,008 0,009 0,008 0,009 0,098 0,01 0,026 0,02 0,029 0,048 0,035 0,081 0,087 Ig região C de cadeia gamma 1 (IGHG1) 0,002 0,003 0,003 0,003 0,005 0,012 0,008 0,027 0,013 0,021 0,052 0,043 0,071 0,067 Ig região C de cadeia gamma 2 (IGHG2) 0,003 0,002 0,003 0,002 0,003 0,018 0,001 0,14 0,088 0,088 0,138 0,126 0,545 0,075

[00198] Uma vez que esses resultados foram obtidos após a análise de um grande número de proteínas por meio de proteômicos, nós estudamos se alguns deles poderiam ser reproduzidos usando outras abordagens. Análise de turbidimetria dos níveis de plasma de duas proteínas representativas (IGHA2 e APOA) para as quais existem anticorpos disponíveis comercialmente confirmou suas correlações independentes com a espessura de placa (Tabela 18).

Tabela 18 - Validação de Alguns Resultados Proteômicos por meio de Abordagens com base em Anticorpo. Os Níveis de Plasma de IGHA2 e APOA Foram Medidos por Turbidimetria.

Análise de regressão Linear Bivariada Foi Executada para Medir a Correlação Entre a Espessura de Placa e Níveis de Proteína em Coorte de PESA-V1 após Ajuste por meio de Cada um dentre os Fatores de Risco Conhecidos. Significância Estatística do Coeficiente de Correlação de Pearson foi Expressa em Termos do Valor p. de de de de de de de meio meio meio meio meio meio meio Univariável Ajuste por por por por por Ajuste por por glucose Smoking Ajuste Ajuste Ajuste Ajuste Ajuste Idade

LDL HDL SBP

DBP Proteínas valor p Ig região C de cadeia alfa <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,004 0,003 2 (IGHA2) Apolipoproteína(a) (APOA) 0,005 0,003 0,006 0,007 0,007 0,007 <0,001 0,003

[00199] Uma análise similar foi executada com as proteínas que correlacionaram com a pontuação de cálcio da artéria coronária (CACS). Algumas das proteínas associadas com a espessura de placa, incluindo HPT, APOA e GELS, também mostraram uma correlação significativa com CACS em PESA-V1 que foi mantida em V2 (Tabela 19 e Figura 3B).

Tabela 19 - Proteínas que Mostraram Correlação Significativa com a Pontuação de Cálcio da Artéria coronária.

Análise de regressão Linear foi Executada para Medir a Correlação Entre CACS e Níveis de proteínas Plasmáticas em PESA-V1 e PESA-V2, Significância Estatística do Coeficiente de Correlação de Pearson foi Expressa em Termos de Taxa de Descoberta Falsa (FDR). Proteínas que Têm Correlação Significativa V1 (FDR ≤ 5%) e em V2 (FDR ≤ 15%) Foram Listadas.

Proteínas PESA-V1 PESA-V2 Aumentada val. p FDR val. p FDR Haptoglobina (HPT) <0,001 0,041 <0,001 0,045 Diminuída val. p FDR val. p FDR Gelsolina (GELS) 0,001 0,040 <0,001 0,013 CD5 antígeno-like (CD5L) <0,001 0,022 0,004 0,150

[00200] Contudo, entre as proteínas relacionadas à reposta imune humoral, apenas IGKC manteve sua correlação com CACS (Tabela 19 e Figura 3B). Fator de complemento B

(CFB), imunoglobulina de constante pesada mu (IGHM) e CD5 semelhante a antígeno (CD5L) fora outras proteínas que correlacionaram com CACS mas não com espessura de placa.

Dentre as proteínas que correlacionam com CACS, HPT, APOA, GELS, CD5L e IGKC foram as que melhor mantiveram a correlação tanto em PESA-V1 quanto em V2 após ajuste pelos fatores de riscos (Tabela 20).

Tabela 20 - Correlação dos Níveis de Proteínas Plasmáticas com Pontuação de Cálcio. Análise de Regressão Linear Bivariada foi Executada para Medir a Correlação entre CACS e os Níveis das Proteínas de Plasma Indicadas em PESA- V1 e Coortes de PESA-V2 após Ajuste por cada um dentre os Fatores de Risco Conhecidos. Significância Estatística do Coeficiente de Correlação de Pearson foi Expressa em Termos do Valor p.

V1 V2

Ajuste Bivariável por

Ajuste Bivariável por meio de Glucose meio de Glucose meio de Tabaco meio de Tabaco meio de Idade meio de Idade Proteínas meio de LDL meio de HDL meio de SBP meio de DBP meio de LDL meio de HDL meio de SBP meio de DBP Aumentada val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p Haptoglobina (HPT) 0,003 0,001 0,001 0,002 0,002 0,007 0,001 0,003 0,001 0,001 0,004 0,003 0,011 0,001 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,031 0,041 0,04 0,044 0,037 0,05 0,028 0,02 0,02 0,025 0,041 0,037 0,027 0,017 Componente 9 do complemento (CO9) 0,018 0,008 0,007 0,009 0,01 0,02 0,009 0,081 0,028 0,039 0,099 0,093 0,097 0,049

109/137 Diminuída val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p val. p Gelsolina (GELS) 0,008 0,003 0,002 0,003 0,005 0,004 0,008 0,001 9E-05 8E-05 0,0002 0,0002 0,0004 0,001

CDS semelhante a antígeno (CD5L) 0,001 0 0 0,001 0,001 0,001 0,001 0,016 0,007 0,009 0,021 0,018 0,007 0,01 Ig região C de cadeia kappa (IGKC) 0,002 0,003 0,003 0,002 0,003 0,007 0,003 0,03 0,017 0,024 0,031 0,033 0,051 0,017 Ig regiões C de cadeia mu (IGHM) 0,004 0,002 0,002 0,003 0,003 0,003 0,003 0,076 0,043 0,05 0,119 0,101 0,037 0,055

[00201] Nós também analisamos o comportamento de proteínas de fase aguda representativa (incluindo proteína C-reativa (CRP), soro amiloide A-1 (SAA1) e glicoproteína ácida alfa 1 (ORM1)) e dentre outras proteínas que foram previamente descritas para associara com aterosclerose subclínica (Tabela 21). Embora CRP correlacionadas com espessura de placa em PESA-V2, nenhuma das proteínas de fase aguda mantiveram uma correlação estável nas duas visitas de PESA. Dentre as proteínas previamente propostas para associar com aterosclerose subclínica,(Saarikoski LA et al., 2010; Bhosale SD et al., 2018) a caderina 13 (CDH13) mostrou correlação significativa com espessura de placa em PESA-V1, mas o resultado não foi confirmado em PESA-V2, Nenhuma associação foi detectada com CACS em qualquer uma das duas visitas.

Tabela 21 - Correlação com Espessura de Placa e Pontuação de cálcio de Proteínas de Fase Aguda Representativas e Proteínas como Descrito para Associar com Aterosclerose subclínica Placa Mckness Pontuação de Cálcio VI V2 VI V2 val. val. val. val. Proteínas FDR FDR FDR FDR Refs. p p p p Proteína A-1 de 0,46 soro amiloide 0,300 0 409 0,372 0,480 0,021 0,125 0,211 [1] 7 (SAA1) 0,046 Proteína reativa 0,14 dl. 0,145 0,290 0,002 (acima 0,318 0,465 0,024 C (CRP) 5 [2] ) Glicoproteína 0,182 0 309 0,121 0,271 0,465 0,477 0,064 0,20 [2]

Placa Mckness Pontuação de Cálcio ácida Alfa 1 7 glicoproteína 1 (ORM1) Adiponectina 0,35 0,083 0,234 0,002 0,101 0208 0,381 0,007 [3] (ADIPOQ) 7 Flibulina-1 0,33 0,003 0,017 0,032 0,133 0,013 0,053 0,163 [4] (FBLN1) 6 0,020 Caderina-13 0,57 0,000 (abai 0,139 0,378 0,061 0,245 0,026 (4) (CDH13) 8 xo) 72 colagenese IV 0,46 0,308 0,409 0,391 0,473 0,393 0,477 0,280 [4] tipo kDa (MMP2) 7 Apolipoproteína E 0,33 0,325 0,388 0,103 0,238 0,243 0,321 0,237 (4] (APOE) 7 Referências

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2.3 - Associação Entre Alterações de Proteínas de plasma e Aterosclerose subclínica são Independentes daS Pontuações de Risco

[00202] A Análise de Regressão Logística foi conduzida para determinar o efeito dos níveis de proteínas plasmáticas na probabilidade que participantes tenham doença ateroscleróstica subclínica. Níveis de plasma aumentados de PIGR, IGHA2, APOA, HPT e HEP2 foram significativamente associados com probabilidade aumentada de doença e as associações permaneceram significativas após ajustes por meio de pontuações de 10-Year FHS (Tabela 22 e Figura 4).

Níveis diminuídos de IGHG1 foram também associados com doença após ajustes por meio de pontuação de 10-Year FHS (Tabela 22). CD5L não foi significativamente associado, e GELS e IGKC perderam sua associação com aterosclerose subclínica após ajuste por meio de 10-Year FHS (Tabela 22).

Tabela 22 - Análise de Regressão Logística de Associação com a Presença de Aterosclerose Subclínica. Razões de Probabilidade se Referem a Valores Relativos de Proteína Determinados por meio de Proteômicos e Expressos em Unidades de Desvio Padrão, Usando Modelos de Regressão Logística univariáveis (Univariável), ou Modelos Ajustados Bivariados por meio de Pontuação de 10-Year FHS (Ajustado por meio de.

10-Y F).

Ajustada por meio de Proteínas Univariável 10-Year FHS val. Aumentada val. p OU 95% Cl OU 95% Cl p Receptor de <0,001 1,554 1,256 1,922 0,005 1,374 1,102 1,711 imunoglobulina polimérica (PIGR) 0,008 1,295 1,069 1,567 0,024 1,259 1,031 1,538 Ig região C de cadeia alfa 2 (IGHA2) Apolipoproteína(a) 0,018 1,261 1,041 1,527 0,015 1,279 1,049 1,56 (APOA) Haptoglobina (HPT) <0,001 1,412 1,157 1,723 0,05 1,225 0,994 1,51 Cofator 2 da heparina <0,001 1,414 1,195 1,673 0,005 1,285 1,078 1,531 (HEP2) val. Diminuída val. p OU 95% Cl OU 95% Cl p Gelsolina (GELS) 0,008 0,772 0,638 0,936 0,107 0 849 0,695 1,036 Ig região C de cadeia 0,007 0,819 0,709 0,946 0,017 0,834 0,719 0,968 gamma 1 (IGHG1) Ig região C de cadeia 0,049 0,833 0,694 0,999 0,181 0 879 0,727 1,062 kappa (IGKC) CDS semelhante a 0,226 0947 0868 1,034 0,408 0962 0879 1,054 antígeno (CD5L)

[00203] Para selecionar um painel biomarcador, várias combinações de proteína foram testadas usando modelos de regressão logística multivariados. A IGHG1 não alcançou significância estatística quando outras proteínas foram incluídas no mesmo panel, embora PIGR, IGHA2, APOA, HPT e HEP2 poderiam ser combinadas para formar vários painéis de três proteínas, em que PIGR poderia ser substituído por IGHA2 e HEP2 por HPT (Tabela 23). A associação individual dessas cinco proteínas com aterosclerose subclínica permaneceu significativa após ajuste por meio de BEWAT ou pontuação de riscos ICHS (Figura 4).

Tabela 23 - Modelos de regressão logística

Multivariados para Previsão de Aterosclerose Subclínica em PESA-V1, Modelos de regressão Logística Multivariados foram Usados para Determinar Associação de Valores de Proteína com a Presença de Aterosclerose Subclínica.

val. OU 95% CI p Receptor de imunoglobulina 0,004 1,39 1,11 1,74 polimérica (PIGR) Ig região C de cadeia alfa 0,020 1,29 1,04 1,59 2(IGHA2) Modelo 1 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,005 1,34 1,09 1,63 Haptoglobina (HPT) 0,341 1,12 0,88 1,43 Cofator 2 da heparina (HEP2) 0,032 1,28 1,02 1,61 Lg região C de cadeia gamma 1 0,425 0,93 0,79 1,10 (IGHG1) Receptor de imunoglobulina 0,000 1,49 1,19 1,85 polimérica (PIGR) Modelo 2 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,004 1,34 1,10 1,64 Cofator 2 da heparina (HEP2) 0,001 1,34 1,12 1,60 Receptor de imunoglobulina 0,000 1,52 1,22 1,89 polimérica (PIGR) Modelo 3 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,006 1,32 1,08 1,61 Haptoglobina (HPT) 0,016 1,28 1,05 1,58 Ig região C de cadeia alfa 0,001 1,39 1,14 1,71 2(IGHA2) Modelo 4 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,005 1,32 1,09 1,61 Cofator 2 da heparina (HEP2) 0,000 1,49 1,25 1,77 Ig região C de cadeia alfa 0,009 1,30 1,07 1,58 2(IGHA2) Modelo 5 Apolipoproteína(a) (APOA) 0,015 1,27 1,05 1,55 Haptoglobina (HPT) 0,001 1,39 1,14 1,70 10-y FHS 0,000 1,74 1,38 2,21 Ig região C de cadeia alfa 2 0,022 1,27 1,03 1,55 Modelo 6 (IGHA2) Apolipoproteína(a) (APOA) 0,012 1,29 1,06 1,58 Haptoglobina (HPT) 0,071 1,21 0,98 1,49 Modelo 7 BEWAT 0,005 0,75 0,61 0,92 val. OU 95% CI p Ig região C de cadeia alfa 2 0,017 1,27 1,04 1,55 (IGHA2) Apolipoproteína(a) (APOA) 0,016 1,27 1,05 1,55 Haptoglobina (HPT) 0,008 1,32 1,08 1,61 ICHS 0,021 0,79 0,64 0,96 Ig região C de cadeia alfa 2 0,012 1,29 1,06 1,57 Modelo 8 (IGHA2) Apolipoproteína(a) (APOA) 0,018 1,27 1,04 1,54 Haptoglobina (HPT) 0,008 1,32 1,08 1,62

2.4 - As Proteínas de Plasma que Associam com Aterosclerose Subclínica Acumulam em Lesões Ateroscleróticas Precoces

[00204] Nós determinamos a abundância das cinco proteínas selecionadas nas camadas média e íntimas de lesões de aterosclerose humanas precoces (faixa gordurosa e placas fibrolipídicas). A Análise proteômica quantitativa revelou abundâncias absolutas marcadamente elevadas de PIGR, IGHA2, APOA, HPT e HEP2 na íntima em relação a camada média (Figura 5). Acumulação íntima dessas cinco proteínas aumentou adicionalmente as lesões que progrediram do estágio de faixa gordurosa para o estágio fibrolipídico (Figura 5). Assim, as cinco proteínas que associam com aterosclerose subclínica no Plasma também acumulam em lesões ateroscleróticas nos estágios iniciais da formação da placa.

2.5 - Validação em um Coorte Proveniente do Estudo de Saúde Aragon Worker (AWHS)

[00205] Para a fase de validação, nós selecionamos os painéis compostos por IGHA2, APOA e HPT, uma vez que essas proteínas podem ser medidas usando kits com base em anticorpo comercialmente disponíveis usados na clínica. O estudo de validação foi conduzido com um conjunto de 350 amostras de plasma obtidos do coorte de AWHS.A análise de Regressão Logística Multivariável revelou que o aumento da concentração de plasma de cada uma dentre as três proteínas foi significativamente associado com um aumento da probabilidade de aterosclerose subclínica (Figura 6A). Essa tendência foi mantida após ajuste por meio de qualquer uma dentre as três pontuações de risco, indicando que os níveis dessas proteínas foram associados independentemente com aterosclerose subclínica na população de AWHS (Figura 6B-D).

2.6 - Valor de Previsão de Painéis Biomarcadores de Proteína

[00206] A habilidade das três proteínas, incluídas como um painel biomarcador, de melhorar sozinha a previsão de aterosclerose subclínica por meio da pontuação de riscos foi avaliada por um análise de características operacionais do receptor (ROC) análise. No coorte de PESA-V1, um painel composto pelas três proteínas e pontuação de 10-Year FHS produziu um AUC (0,76:0,71-0,81 95% CI) significativamente maior que a pontuação de 10-Year FHS sozinha (0,71:0,66- 0,77, p <0,05, Teste DeLong) (Figura 7A). NRI categóricos e contínuos produzidos pelo painel de proteína foram NRI0,25 = 7% e NRI>0 = 40%, respectivamente (Tabela 24). O painel de proteína também melhorou a previsão da doença no coorte de AWHS (AUC =0,72:0,66-0,77 vs0,61:0,54-0,69, p <0,01) (Figura 7A), rendendo NRI0,25 = 29% e NRI>0 = 51%. O painel biomarcador também melhorou significativamente as AUCs para a Pontuação de BEWAT (Figura 7B) e a pontuação de ICHS (Figura 7C), com NRIs acima de 16% e alcançando 64% em alguns casos Tabela 24), em ambas as populações. As AUCs também foram melhoradas significativamente por algumas combinações de apenas duas proteínas, por exemplo, IGHA2 e HPT ou APOA e HPT (Figura 7 e Tabela 24).

Tabela 24 - Índices de Reclassificação de Rede dos Painéis Biomarcadores de Proteína. Índices de Reclassificação de Rede Categóricos (NRI0,25) e Contínuos (NRI>0) estão Listados para Avaliar a Melhora no Desempenho para Classificar Corretamente Indivíduos de Acordo com a Presença e Extensão de Aterosclerose Subclínica sobre aquelas Alcançados por meio da Pontuação de Risco Sozinha (10-Year FHS, BEWAT ou ICHS). Para Calcular NRI0,25 os Indivíduos foram Classificados em Quatro Categorias de Risco Discretas.

PESA AWHS NRI025 NRI>0 NRI025 NRI>0 10-Y FHS+IGHA2+APOA 5,0% 31,5% -4,8% 2,0%

PESA AWHS NRI025 NRI>0 NRI025 NRI>0 10-Y FHS+IGHA2+HPT 7,2% 33,3% 25,4% 51,4% FHSIOY+APOA+HPT 10,4% 26,1% 29,0% 49,6% 10-Y FHS+IGHA2+APOA+HPT 7,2% 40,5% 29,0% 51,3% BEWAT+IGHA2+APOA 16,2% 34,2% 16,5% 29,3% BEWAT+IGHA2+HPT 113% 33,3% 33,7% 53,6% BEWAT+APOA+HPT 14,9% 24,3% 43,8% 66,3% BEWAT+IGHA2+APOA+HPT 203% 37,8% 47,0% 64,5% ICHS+IGHA2+APOA 8,6% 32,4% 3,7% 30,4% ICHS+IGHA2+HPT 10,4% 35,1% 18,0% 49,4% ICHS+APOA+HPT 8,6% 32,4% 17,2% 42,8% ICHS+IG HA2+APOA+HPT 16,7% 45,0% 26,0% 45,1%

[00207] Para avaliar se essas proteínas fornecem informações úteis sobre os indivíduos com baixo risco de eventos CV de acordo com pontuação de riscos, nós selecionamos uma subpopulação de participantes com uma pontuação de 10-Year FHS <0,1 (Fernandez-Friera L et al., 2015; Pencina MJ et al., 2009; Ford ES et al., 2004). Nessa subpopulação, o painel biomarcador de proteína 3 previu eficientemente a doença subclínica em PESA-V1 (AUC =0,62:0,56-0,68, p <0,001 vs AUC =0,5) (Figura 8 à esquerda ), rendendo NRIs de 5-8% (Tabela 25). O painel 3 de proteína também previu a doença na subpopulação AWHS (AUC =0,68:0,6- 0,76, p <0,0001 vs AUC =0,5) (Figura 8 à esquerda), com NRIs variando de 10 até 36% (Tabela 25). Aterosclerose subclínica em ambas as populações foi prevista eficientemente para algumas combinações de apenas 2 proteínas (Figura 8).

Tabela 25 - Índices de Reclassificação de Rede Dos Painéis Biomarcadores de Proteína na População de Baixo Risco. Índices de Reclassificação de Rede Categóricos (NRI0,5) estão Listados para Avaliar a Melhora no Desempenho para Classificar Corretamente Indivíduos de Acordo Com a Presença e Extensão de Aterosclerose Subclínica em Subpopulações de Baixo Risco (Pontuação de 10-Year FHS <0,1).

Duas Categorias Discretas (Risco /sem Risco) Foram Usadas para Calcular NRI0,5,

PESA AWHS NRI0,5 NRI0,5 IGHA2+APOA 8,8% 10,9% IGHA2+HPT 4,1% 34,9% APOA+HPT 4,6% 32,0% IGHA2+APOA+HPT 5,1% 36,0% Lista de Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de aterosclerose subclínica, preferencialmente aterosclerose subclínica generalizada, em um indivíduo, em que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a) determinar em uma amostra biológica isolada do dito indivíduo os níveis de expressão de proteína de: i. PIGR e/ou IGHA2; e ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro ou cinco biomarcadores, selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5; b) comparar os níveis dos biomarcadores com um valor de referência; c) em que, quando os níveis na amostra do indivíduo de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2 ITIH1 e/ou C5 são aumentados em relação ao valor de referência correspondente, é indicativo de aterosclerose subclínica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende determinar os níveis de expressão de proteína de PIGR e/ou IGHA2; e um, dois, três, quatro ou cinco biomarcadores selecionados dentre a lista que consiste em APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende determinar os níveis de expressão de proteína de uma pluralidade de biomarcadores selecionados dentre o grupo que consiste em:

a.

PIGR e/ou IGHA2, e APOA;

b.

PIGR e/ou IGHA2, e HPT;

c.

PIGR e/ou IGHA2, e HEP2;

d.

PIGR e/ou IGHA2, e C5;

e.

PIGR e/ou IGHA2, e ITIH1;

f.

PIGR e/ou IGHA2, APOA e HPT;

g.

PIGR e/ou IGHA2, APOA e HEP2;

h.

PIGR e/ou IGHA2, APOA e C5;

i.

PIGR e/ou IGHA2, APOA e ITIH1;

j.

PIGR e/ou IGHA2, HPT e HEP2;

k.

PIGR e/ou IGHA2, HPT e C5;

l.

PIGR e/ou IGHA2, HPT e ITIH1;

m.

PIGR e/ou IGHA2, HEP2 e C5;

n.

PIGR e/ou IGHA2, HEP2 e ITIH1;

o.

PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e C5;

p.

PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e ITIH1;

q.

PIGR e/ou IGHA2, APOA, HEP2 e C5;

r.

PIGR e/ou IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1;

s.

PIGR e/ou IGHA2, HPT, HEP2 e C5;

t.

PIGR e/ou IGHA2, HPT, HEP2 e ITIH1; e u.

PIGR e/ou IGHA2, APOA, HPT e HEP2.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente determinar na dita amostra biológica os níveis de expressão de proteína de IGHG1; em que, quando os níveis de IGHG1 na amostra do indivíduo são diminuídos em relação a um valor de referência, é indicativo de aterosclerose subclínica.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os níveis de IGHA2 são níveis relativos em relação a qualquer um dentre IGHA1, IGHG1, IGHG2 ou uma combinação dos mesmos, preferencialmente em que níveis de IGHA2 são níveis relativos em relação a IGHA1 ou em relação aos níveis médios de IGHG1 e IGHG2.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente conduzir uma pontuação de risco cardiovascular tradicional, preferencialmente em que a dita pontuação de risco cardiovascular tradicional é selecionada dentre o grupo que consiste em 10-y FHS, 30-y FHS, ICHS e as pontuações de BEWAT, mais preferencialmente em que a dita pontuação de risco cardiovascular é 10-y FHS.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito método é caracterizado pelo fato de que é um método para a triagem e/ou diagnóstico de aterosclerose subclínica em um indivíduo classificado como de baixo risco ao conduzir uma pontuação de risco cardiovascular tradicional.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a dita amostra biológica isolada do indivíduo é uma amostra de soro, sangue ou plasma, preferencialmente é uma amostra de soro.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um indivíduo humano.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e/ou c) são implementadas por um computador.

11. Aparelho de processamento de dados caracterizado pelo fato de que compreende meios para realizar as etapas de um método, conforme definido na reivindicação 10.

12. Programa de computador caracterizado pelo fato de que compreende instruções que, quando o programa é executado por um computador, fazem com que o computador realize as etapas do método, conforme definido na reivindicação 10.

13. Mídia de armazenamento legível em computador caracterizada pelo fato de que tem armazenado na mesma um programa de computador, conforme definido na reivindicação

12.

14. Kit caracterizado pelo fato de que compreende reagentes adequados para a determinação dos níveis de expressão de proteína dos seguintes biomarcadores: i. PIGR e/ou IGHA2; ii. opcionalmente, um, dois, três, quatro ou cinco biomarcadores selecionados dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5; em que o dito kit compreende: a. um reagente de afinidade para PIGR e/ou IGHA2; b. opcionalmente, um reagente de afinidade para um, dois, três quatro ou cinco dentre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 e C5; c. opcionalmente, compreender adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes ao determinar os ditos níveis de expressão de proteína em uma amostra biológica isolada de um indivíduo.

15. Uso de um kit em um método para a triagem, diagnóstico e/ou monitoramento de um indivíduo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito kit compreende: a. um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de PIGR e/ou IGHA2; e b. opcionalmente, um reagente para determinar os níveis de expressão de proteína de um, dois, três, quatro ou cinco de APOA, HPT, HEP2, ITIH1 ou C5;

c. opcionalmente, compreender adicionalmente instruções para o uso dos ditos reagentes ao determinar os ditos níveis de expressão de proteínas em uma amostra biológica isolada de um indivíduo;

preferencialmente, em que o dito kit se dá conforme definido na reivindicação 14.