ES2932268T3 - Biomarcadores de aterosclerosis subclínica - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a PIGR, APOA, HPT, HEP2, C5, ITIH1 e IGHA2 como biomarcadores para el cribado, diagnóstico y/o seguimiento de aterosclerosis subclínica y métodos y kits que los utilizan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de aterosclerosis subclínica
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de agentes de diagnóstico. En particular, se refiere a biomarcadores de proteína para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica y a procedimientos y a kits que utilizan los mismos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Uno de los desafíos asociados con el tratamiento clínico de la enfermedad aterosclerótica es que, a menudo, se diagnostica demasiado tarde, habitualmente cuando la afección está muy avanzada y las lesiones ya son irreversibles, o cuando ha provocado signos o acontecimientos clínicos en órganos o territorios vascularizados por las arterias enfermas.
En la actualidad, la prevención primaria está basada en la evaluación de factores de riesgo modificables según recomendaciones estandarizadas. Sin embargo, se ha descubierto que, en cada nivel de exposición a un factor de riesgo, existe una variación sustancial en la cantidad de aterosclerosis (Fernández-Ortiz A et al., Am Heart J 2013; 166: 990-8).
La medición no invasiva mediante procedimientos de obtención de imágenes de la carga aterosclerótica subclínica en personas de mediana edad tiene el potencial de mejorar la evaluación del riesgo cardiovascular y podría contribuir a una prevención más eficaz de los acontecimientos cardiovasculares. No obstante, las directrices más recientes (Perk J. et al., Eur Heart J 2012; 33: 1635-701) sólo recomiendan estas pruebas de obtención de imágenes en adultos asintomáticos que se considera que tienen riesgo moderado (Fernández-Ortiz A et al., 2013).
El estudio de progresión y detección temprana de la aterosclerosis subclínica (PESA, Progression and Early detection of Subclinical Atherosclerosis) es un estudio de cohortes longitudinales con el objetivo de caracterizar la prevalencia de la aterosclerosis subclínica y los determinantes asociados con la presencia y progresión de la enfermedad en una población asintomática de mediana edad.
Curiosamente, en el estudio de PESA se demostró que una proporción sustancial de los individuos asintomáticos clasificados como de bajo riesgo basándose en puntuaciones de riesgo cardiovascular tradicionales (es decir, FHS-10 años) tenía aterosclerosis extensa (Fernández-Friera L et al., Circulation. 2015; 131: 2104-2113).
Los autores realizaron un análisis con el objetivo de identificar diferencias entre los participantes con aterosclerosis subclínica en un único territorio (enfermedad focal) y aquellos con múltiples territorios (enfermedad intermediada o generalizada). Los resultados de este análisis evidenciaron una asociación estadísticamente significativa entre la extensión de aterosclerosis y las puntuaciones de riesgo cardiovascular (CVR, cardiovascular risk) y la mayoría de factores de CVR. Fernández-Friera L et al., 2015 dan a conocer, además, que la mayoría de los individuos clasificados como de alto riesgo mediante las escalas de puntuaciones de factor de riesgo tradicionales padecían aterosclerosis subclínica, padeciendo una alta proporción enfermedad intermediada o generalizada.
Sin embargo, la aterosclerosis subclínica también estaba presente en el 60 % de los individuos clasificados como de bajo riesgo, lo que sugiere una asociación de la aterosclerosis con características no consideradas en escalas de riesgo estándar. Esta fue una observación sorprendente, puesto que será más probable que los individuos que presentan aterosclerosis subclínica multiterritorial, a pesar de ser clasificados como de bajo riesgo, desarrollen acontecimientos de enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ASCVD, atherosclerotic cardiovascular diseases). Fernández-Friera L et al., 2017 (J Am Coll Cardiol. 2017; 70(24): 2979-2991) también se refieren al estudio de PESA y notifican que muchos individuos de mediana edad sin factores de CVR presentan aterosclerosis. Este estudio ha descubierto que los niveles de LDL-colesterol (LDL-C), incluso a los niveles que actualmente se consideran normales, están asociados independientemente con la presencia y la extensión de aterosclerosis subclínica. Por tanto, apuntan hacia una reducción de LDL-C como medida preventiva que va a adoptarse incluso en individuos que se considera que tienen bajo riesgo.
La identificación de biomarcadores de aterosclerosis en el entorno subclínico es técnicamente más exigente que en un contexto de acontecimientos de CV agudos o de CVD bien desarrollada, en los que se espera que la enfermedad tenga un claro impacto sobre los niveles de proteína en plasma. Muy pocos estudios han evaluado posibles biomarcadores de proteína en plasma de la ateroeclerosis subclínica. Se han utilizado inmunoensayos para cuantificar las alteraciones en las proteínas plasmáticas específicas adiponectina (Saarikoski LA et al., 2010) y TIMP4 (Oikonen M et al., 2012), que muestran que estas proteínas están disminuidas en individuos con ateroeclerosis carotídea subclínica asintomática en la cohorte de riesgo cardiovascular en jóvenes finlandeses. Un análisis de proteómica de descubrimiento de la cohorte de riesgo cardiovascular en jóvenes finlandeses descubrió
una asociación entre los niveles de FBLN1C en plasma y la presencia de placas en individuos de mediana edad (Bhosale SD et al., 2018), y el resultado se confirmó mediante proteómica dirigida en la misma población. Sin embargo, en el estudio de los inventores de la presente invención, FBLN1C no pasó los rigurosos criterios de filtrado utilizados.
Yin X et al., 2014 (Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2014, 34: 939-945) se centran en la identificación de nuevos biomarcadores de proteína en plasma que, individualmente o en agregación, predicen el riesgo de ASCVD. Este documento reveló una asociación entre PIGR y el infarto de miocardio en un único análisis de marcador.
Ngo D et al. 2016 (Circulation 2016, 134:270-285) tienen el objetivo de detectar asociaciones entre concentraciones de proteína en plasma y componentes de puntuación de riesgo de Framingham en el estudio Framingham del corazón (FHS, Framingham Heart Study). En particular, menciona una asociación entre los niveles de PIGR en plasma y fumar. Fumar es un factor de riesgo cardiaco bien establecido y es una de las variables en el algoritmo de evaluación de riesgos del FHS. Además, se notifica que PIGR está asociado con la puntuación de cardiopatía coronaria del FHS.
Por consiguiente, existe la necesidad de descubrir nuevos biomarcadores para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de individuos que padecen aterosclerosis subclínica. Además, es particularmente deseable identificar marcadores que sean independientes de las puntuaciones y los factores de CVR tradicionales, con el fin de poder detectar aquellos sujetos que padecen aterosclerosis subclínica de aquellos clasificados como de bajo riesgo cardiovascular.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud da a conocer los resultados de lo que es, según el conocimiento de los inventores de la presente invención, el análisis de proteómica en plasma basado en espectrometría de masas más profundo y amplio hasta la fecha en la búsqueda de biomarcadores relacionados con la aterosclerosis. Los inventores utilizaron una plataforma de proteómica que puede cuantificar más de 1.000 proteínas a partir de muestras de plasma no empobrecido en una cohorte de 444 individuos del estudio de PESA. Este análisis fue posible al combinar la precisión cuantitativa y la robustez proporcionadas por el marcaje isobárico multiplexado con flujos de trabajo estadísticos bien validados y automatizados (Navarro P y Vázquez J, 2014; García-Marques F et al., 2016; Trevisan-Herraz M et al., 2018). Un segundo análisis de muestras de plasma obtenidas de los mismos individuos en el seguimiento de 3 años validó los resultados e identificó un conjunto de supuestas proteínas biomarcadoras cuya asociación con la aterosclerosis permanecía estable a lo largo del tiempo. Esta validación en la segunda visita era esencial para reducir fuentes de error en la fase de descubrimiento, para descartar proteínas con una notable variabilidad biológica y para concentrar los esfuerzos en un conjunto robusto de biomarcadores útiles para la detección de aterosclerosis subclínica.
Los inventores han descubierto que los niveles de PIGR (receptor de inmunoglobulina polimérico, Polymeric immunoglobulin receptor), APOA (apolipoproteína(a)), HPT (haptoglobina), HEP2 (cofactor 2 de heparina), C5 (componente 5 del complemento), ITIH1 (inhibidor de inter-alfa-tripsina 1, Inter-alpha-trypsin inhibitor 1) e IGHA2 (región constante de cadena pesada de inmunoglobulina alfa 2, immunoglobulin heavy constant alpha 2) en plasma, según se determinan mediante análisis por cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS), están asociados con la enfermedad aterosclerótica subclínica independientemente unos de otros, y de los factores de riesgo cardiovascular establecidos (por ejemplo, la edad, fumar) y de las escalas de riesgo cardiovascular (por ejemplo, puntuación de riesgo del FHS).
Además, se ha demostrado que la acumulación de estas proteínas en la capa media y principalmente en la capa íntima (placa) es mayor a medida que la placa evoluciona desde el tipo estría grasa hasta el tipo lesión fibrolipídica (véanse la figura 1 y la figura 5). Por tanto, los inventores también han asociado los niveles de estas proteínas con el grado de avance de la aterosclerosis.
Partiendo de esta base, los inventores proponen estos biomarcadores y, preferentemente, combinaciones de los mismos, para su utilización en un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica, tal como se describe en el presente documento.
Por consiguiente, el primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica en un sujeto, que comprende determinar los niveles de uno o varios marcadores de proteína, tal como se define en la reivindicación 1.
En un segundo aspecto que no forma parte de la presente invención, se da a conocer un procedimiento para tratar a un sujeto que padece aterosclerosis subclínica, en el que dicho procedimiento comprende:
a. identificar un sujeto que padece ateroesclerosis subclínica mediante el procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización, tal como se define en el presente documento;
b. administrar a dicho paciente una cantidad eficaz terapéuticamente de un tratamiento adecuado para prevenir/reducir placas ateroscleróticas.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la utilización de un kit para determinar los niveles de uno o varios de los marcadores de proteína, tal como se describen en el presente documento, en una muestra biológica aislada de un sujeto. El kit también puede contener instrucciones que indican cómo pueden utilizarse los materiales dentro del kit.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la utilización de un kit, según el aspecto anterior, en un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica, tal como se describe en el presente documento.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Análisis de proteómica cuantitativo de los niveles de PIGR (figura 1A), APOA (figura 1B), ITIH1 (figura 1C), C5 (figura 1D) e IGHA2 (figura 1E) en las capas media e íntima de muestras de aortas humanas (controles; con placas ateroecleróticas con estrías grasas (FS, fatty streaks) y con placas con lesiones fibrolipídicas (FL, fibrolipidic lesions)). Los resultados significativos estadísticamente se han resaltado con asteriscos (*), en los que * significa un valor de p de 0,05, ** significa un valor de p de 0,01, *** significa un valor de p de 0,001 y **** significa un valor de p de 0,0001, y el valor de referencia es el grupo sano.
Figura 2. Asociación de niveles de proteína en plasma con los factores de riesgo CV tradicionales.
La red se construyó analizando la correlación de cada uno de los factores de riesgo continuos con los niveles en plasma de cada una de las proteínas cuantificadas mediante proteómica. Las correlaciones significativas estadísticamente se seleccionaron mediante un valor de p corregido por Bonferroni < 0,05 tanto en PESA-V1 como en PESA-V2, y se utilizaron los coeficientes de correlación de Pearson como ponderaciones para construir una red de correlaciones utilizando Cytoscape. El grosor de las líneas es proporcional a las ponderaciones (gris oscuro: correlación positiva; gris claro: correlación negativa). También se muestran las correlaciones entre los factores de riesgo. DBP (diastolic blood pressure): tensión arterial diastólica; SBP (systolic blood pressure): tensión arterial sistólica; LDL (low density lipoprotein): lipoproteína de baja densidad; Ch: colesterol; HDL (high density lipoprotein): lipoproteína de alta densidad; APOB: apolipoproteína B-100; PRG4: proteoglicano 4; PCYOX1: prenilcisteína oxidasa 1; P06309: variable kappa de inmunoglobulina 2D-28 (GeneName IGKV2D-28); ApOM: apolipoproteína M; APOE: apolipoproteína E; APOC3: apolipoproteína C-III; APOC2: apolipoproteína C-II; THRB: protrombina; PLTP (phospholipid transfer protein): proteína de transferencia de fosfolípidos; APOF: apolipoproteína F; PON3: paraoxonasa/lactonasa sérica 3; CFB (complement factor B): factor B del complemento; a Po A1 : apolipoproteína A-I; APOA2: apolipoproteína A-Il.
Figura 3. Correlación de proteínas plasmáticas con el grosor de placa y CACS en las cohortes de PESA-V1 y PESA-V2.
(A) Correlación de niveles relativos de proteína plasmática con el grosor de placa (coeficientes de correlación de Pearson) obtenidos en PESA-V1 en comparación con los obtenidos en PESA-V2. Los tamaños de los puntos son indicativos de las abundancias de proteína en plasma (en número de péptidos cuantificados por proteína). El recuadro muestra el comportamiento de proteínas relacionadas con la respuesta inmunitaria humoral y de otras proteínas que producen una correlación significativa.
(B) Correlación de niveles relativos en plasma con CACS en PESA-V1 y en PESA-V2. Los datos se muestran como en (A).
Figura 4. Gráficos de bosque que muestran razones de probabilidades de aterosclerosis subclínica (casos frente a controles) en PESA-V1 para proteínas seleccionadas.
Las razones de probabilidades se refieren a valores relativos de proteína determinados mediante proteómica y expresados en unidades de desviación estándar, utilizando modelos de regresión logística univariantes (no ajustados) o modelos multivariantes ajustados por puntuaciones de riesgo común (FHS-10 años, BEWAT o ICHS). Las barras de error indican intervalos de confianza del 95 %.
Figura 5. Niveles absolutos de abundancia de proteína de las cinco proteínas seleccionadas en muestras de tejido aterosclerótico humano.
Las cinco proteínas se sometieron a cuantificación absoluta mediante proteómica y se expresaron sus niveles en relación con la cantidad total de proteína de cada muestra. Los niveles se midieron en muestras de la capa media (obtenidas de aortas sanas o de aortas que muestran placas tempranas (con lesiones fibrolipídicas o con estrías grasas)) o de la capa íntima (con lesiones fibrolipídicas o con estrías grasas). Las significaciones estadísticas indicadas de los cambios en la abundancia de proteína con respecto a las de las muestras sanas se calculan utilizando la prueba de la t de Student.
Figura 6. Gráficos de bosque que muestran razones de probabilidades de aterosclerosis subclínica (casos frente a
controles) en AWHS para proteínas seleccionadas.
Las razones de probabilidades se refieren a valores de proteína que se determinan mediante turbidimetría y se expresan en unidades de desviación estándar, utilizando modelos de regresión logística univariantes (no ajustados) o modelos multivariantes ajustados por puntuaciones de riesgo común (FHS-10 años, BEWAT o ICHS). Las barras de error indican intervalos de confianza del 95 %.
Figura 7. Gráficos de bosque que muestran áreas bajo la curva (AUC, Area Under the Curve) después del análisis de ROC de paneles de biomarcadores de proteína para una predicción mejorada de la aterosclerosis subclínica en PESA-V1 y en AWHS.
Las barras de error indican intervalos de confianza del 95 % de los valores de AUC. Los asteriscos indican que la significación estadística de la AUC es significativamente mejor que la obtenida utilizando la puntuación de riesgo sola.
Figura 8. Gráficos de bosque que muestran áreas bajo la curva después del análisis de ROC de paneles de biomarcadores de proteína para una predicción mejorada de la aterosclerosis subclínica en individuos con bajo riesgo (FHS-10 años < 0,1) en PESA-V1 y en AWHS. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95 % de los valores de AUC. Los asteriscos indican que la significación estadística de la AUC es significativamente mejor que 0,5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Los términos “sujeto” o “individuo” se utilizan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a todos los animales clasificados como mamíferos, e incluyen, pero sin limitarse a los mismos, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferentemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
El término “diagnóstico”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere tanto al procedimiento de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir, el procedimiento de diagnóstico, como a la opinión a la que se llega mediante este procedimiento, es decir, la opinión de diagnóstico.
El término “cribado” se entiende en el presente documento como examinar o someter a pruebas un grupo de individuos asintomáticos que pertenecen a la población general, o un grupo de individuos que tienen uno o varios factores de riesgo (es decir, un sujeto que se sospecha que desarrolla o está en riesgo de desarrollar una enfermedad), con el objetivo de discriminar individuos sanos de aquellos que padecen o se sospecha que padecen una enfermedad. Un procedimiento de cribado se utiliza, en general, para la “detección temprana” de una enfermedad. La expresión “detección temprana” se refiere a la detección antes de la presencia de signos clínicos. El término “monitorización”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a determinar la evolución de la enfermedad y/o la eficacia de una terapia, por ejemplo, determinar si existe una remisión de la enfermedad; o, por el contrario, si existe una progresión o una recaída de la enfermedad.
El término “biomarcador”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a marcadores de enfermedad que son normalmente sustancias halladas en una muestra corporal que se pueden medir fácilmente. La cantidad medida se puede correlacionar con la fisiopatología de la enfermedad subyacente, tal como la presencia o ausencia de aterosclerosis subclínica, o con su pronóstico (es decir, la probabilidad de superar la enfermedad subyacente). En pacientes que reciben tratamiento para su afección, la cantidad medida también se puede correlacionar con la capacidad de respuesta a la terapia.
La expresión “cantidad eficaz terapéuticamente”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad que es eficaz, tras la administración de una sola dosis o de múltiples dosis a un sujeto (tal como un paciente humano) en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad, un trastorno o una afección patológica.
La expresión secuencia “idéntica sustancialmente”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia que es, como mínimo, aproximadamente el 95 %, preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede determinar mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch.
La expresión “reactivo de afinidad” se puede referir a un ligando (por ejemplo, anticuerpo, péptido, proteína, ácido nucleico o molécula pequeña) que captura selectivamente (se une a) una molécula diana a través de reconocimiento molecular específico, normalmente con una afinidad de unión en el intervalo de nanomolar a subnanomolar. Por ejemplo, el reactivo de afinidad puede ser un aptámero, anticuerpo o mimético de anticuerpo.
El término “afinidad”, tal como se utiliza en el presente documento, se puede referir a la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una molécula de unión a antígeno (KD), y se considera una medida para la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de la KD, más fuerte será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de asociación (KA), que es 1/KD). Resultará evidente para el experto que la constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente.
El término “aptámero” o la expresión “aptámero de ácido nucleico”, tal como se utilizan en el presente documento, se pueden referir a un ácido nucleico monocatenario (ARN o ADN) aislado o purificado que se une con alta especificidad y afinidad a una diana a través de interacciones distintas del apareamiento de bases de Watson-Crick. Un aptámero tiene una estructura tridimensional que proporciona contactos químicos para unirse específicamente a una diana. A diferencia de la unión de ácido nucleico tradicional, la unión de aptámero no depende de una secuencia de bases lineal conservada, sino más bien de una estructura secundaria o terciaria particular. Es decir, las secuencias de ácido nucleico de aptámeros son secuencias no codificantes. Cualquier potencial de codificación que pueda poseer un aptámero es totalmente fortuito y no desempeña ningún papel en la unión de un aptámero a una diana. Un aptámero minimizado típico tiene un tamaño de 5-15 kDa (15-45 nucleótidos), se une a una diana con afinidad de nanomolar a subnanomolar y discrimina frente a dianas estrechamente relacionadas (por ejemplo, los aptámeros no se unirán normalmente a otras proteínas del mismo gen o de la misma familia funcional).
El término “anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se puede referir a una inmunoglobulina o a un fragmento de unión a antígeno de la misma. A menos que se especifique lo contrario, el término incluye, pero sin limitarse a los mismos, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, multiespecíficos, humanizados, humanos, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro. El anticuerpo puede incluir una región constante, o una parte de la misma, tal como los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Por ejemplo, se pueden utilizar regiones constantes de cadena pesada de los diversos isotipos, que incluyen: IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgM, IgA1, IgA2 , IgD e IgE. A modo de ejemplo, la región constante de cadena ligera puede ser kappa o lambda. En determinadas realizaciones, el término “anticuerpo” también se puede referir a derivados de anticuerpo, tales como proteínas de fusión a base de anticuerpos (por ejemplo, que incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina) o anticuerpos modificados adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales, tales como polímeros solubles en agua, por ejemplo, polietilenglicol (PEG).
Las expresiones “dominio de unión a antígeno” y “fragmento de unión a antígeno” se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. Para determinados antígenos, el dominio de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno se puede unir sólo a una parte del antígeno. La parte del antígeno que es reconocida específicamente y es unida por el anticuerpo se denomina “epítopo” o “determinante antigénico”. Entre los dominios de unión a antígeno y fragmentos de unión a antígeno se incluyen Fab; un fragmento F(ab’ )2 (un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra); un fragmento Fv; un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv); un fragmento Fd (que tiene los dos dominios Vh y Ch1 ); anticuerpos de un solo dominio (sdAb; que consisten en un solo dominio Vh) y otros fragmentos de anticuerpo que conservan la función de unión a antígeno. El fragmento Fab tiene dominios Vh-Ch1 y Vl-Cl unidos de manera covalente por un enlace disulfuro entre las regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y tiene dominios Vh y Vl unidos de manera no covalente. El scFv contiene un polipéptido flexible que une (1) el extremo C-terminal de Vh al extremo N-terminal de Vl o (2) el extremo C-terminal de Vl al extremo N-terminal de Vh. Entre los sdAb se incluyen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de manera natural de cadenas ligeras y anticuerpos de un solo dominio derivados de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales. Estos dominios y fragmentos de unión a antígeno se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y se evalúan para determinar su función de la misma manera que las inmunoglobulinas intactas.
La expresión “anticuerpo recombinante”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo producido o expresado utilizando un vector de expresión recombinante, en el que el vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo recombinante, de manera que la introducción del vector de expresión en una célula anfitriona apropiada tiene como resultado la producción o expresión del anticuerpo recombinante. Los anticuerpos recombinantes pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados, anticuerpos monoespecíficos o multiespecíficos.
La expresión “mimético de anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se puede referir a armazones a base de proteínas que se han modificado por ingeniería para unirse a dianas terapéuticas con una afinidad y una especificidad que coinciden con las de anticuerpos naturales. Los miméticos de anticuerpo se han desarrollado utilizando un plegado similar a inmunoglobulina, por ejemplo, fibronectina de tipo Ill, NCAM y CTLA-4. También se han obtenido otros armazones de mimético que no presentan ninguna similitud con los plegados de inmunoglobulina. Entre los ejemplos no limitativos de dichos armazones se encuentran DARPin, anticalinas, Affibody, adnectinas, finómeros, etc. (véase, por ejemplo, Weidle et al., 2013, Cáncer Genomics & Proteomics, 10, 1
18; Lofblom, J. et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol., 22, 843-848; Banta, S. et al., 2010, Annu. Rev. Biomed. Eng., 15, 93-113).
Procedimientos de la invención
En un primer aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica en un sujeto, que comprende determinar los niveles de uno o varios marcadores de proteína, tal como se define en la reivindicación 1.
Además, los inventores han asociado la acumulación de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5 en placa con el grado de avance de la aterosclerosis (véanse la figura 1 y la figura 5). Por consiguiente, la determinación de los niveles en plasma de estas proteínas en el procedimiento de detección, diagnóstico y/o monitorización de la presente invención también puede proporcionar información sobre el grado de avance de aterosclerosis subclínica o permitir la predicción del mismo.
La expresión “aterosclerosis subclínica”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a aterosclerosis en individuos asintomáticos. La expresión “individuos asintomáticos” se refiere a aquellos sujetos que no han experimentado previamente signos clínicos de enfermedad cardiovascular, que incluyen, por ejemplo, infarto de miocardio, angina de pecho o accidente cerebrovascular.
Preferentemente, “aterosclerosis subclínica” se refiere a la presencia de placas ateroscleróticas en los territorios carotídeo, aórtico o ileofemoral o CACS > 1 en individuos asintomáticos. La “extensión” multiterritorial de la aterosclerosis subclínica se define según el número de sitios vasculares afectados (carótida derecha, carótida izquierda, aorta abdominal, ileofemoral derecha, ileofemoral izquierda y arterias coronarias). Por ejemplo, tal como se detalla en los ejemplos, en el estudio de PESA, los participantes se clasificaron en cuatro categorías distintas según los resultados de los ensayos de obtención de imágenes (“puntuación de PESA”), concretamente como libres de enfermedad (0 sitios vasculares afectados) o como que padecen aterosclerosis focal (1 sitio), intermedia (2-3 sitios) o generalizada (4-6 sitios).
La “presencia de placas ateroscleróticas” se puede evaluar mediante la exploración en sección transversal de las carótidas, la aorta abdominal infrarrenal y las arterias ileofemorales. El término “placa” se refiere normalmente a una protuberancia focal en la luz arterial de grosor > 0,5 mm o > 50 % del grosor de íntima-media circundante o un grosor difuso > 1,5 mm medido entre las superficies de contacto media-adventicia e íntima-luz.
La etapa (a) del procedimiento, según el primer aspecto de la presente invención, comprende determinar en dicha muestra biológica los niveles de expresión de uno o varios marcadores de proteína, tal como se definió anteriormente.
PIGR (receptor de inmunoglobulina polimérico) se une a las moléculas de IgA e IgM poliméricas en la superficie basolateral de células epiteliales; a continuación, el complejo se transporta a través de la célula para su secreción en la superficie apical. Durante este proceso, se produce una escisión que separa el segmento extracelular (conocido como componente secretor) del segmento transmembrana. La secuencia canónica de PIGR humano se denomina SEQ ID NO: 1 (número de registro de UniProtKB P01833-1; esta es la versión 4 de la secuencia del 26 de junio de 2007):
MLLFVLTCLLAVFPAISTKSPIFGPEEVNSVEGNSVSITCYYPPTSVNRHTRKYWCRQGA
RGGCITLISSEGYVSSKYAGRANLTNFPENGTFWNIAQLSQDDSGRYKCGLGINSRGLS
FDVSLEVSQGPGLLNDTKVYTVDLGRTVTINCPFKTENAQKRKSLYKQIGLYPVLVIDSS
GYVNPNYTGRIRLDIQGTGQLLFSWINQLRLSDAGQYLCQAGDDSNSNKKNADLQVLKP
EPELVYEDLRGSVTFHCALGPEVANVAKFLCRQSSGENCDVWNTLGKRAPAFEGRILLN
PQDKDGSFSWITGLRKEDAGRYLCGAHSDGQLQEGSPIQAWQLFVNEESTIPRSPTWK
GVAGGSVAVLCPYNRKESKSIKYWCLWEGAQNGRCPLLVDSEGWVKAQYEGRLSLLEEPG
NGTFTVILNQLTSRDAGFYWCLTNGDTLWRTTVEIKIIEGEPNLKVPGNVTAVLGETLKV
PCHFPCKFSSYEKYWCKWNNTGCQALPSQDEGPSKAFVNCDENSRLVSLTLNLVTRADEG
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DPRLFAEEKAVADTRDQADGSRASVDSGSSEEQGGSSRALVSTLVPLGLVLAVGAVAVGV
ARARHRKNVDRVSIRSYRTDISMSDFENSREFGANDNMGASSITQET SLGGKEEFVATTE
STTETKEPKKAKRSSKEEAEMAYKDFLLQSSTVAAEAQDGPQEA
El término “PIGR”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína PIGR humana con SEQ ID NO: 1 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 1. La secuencia canónica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina alfa 2 humana (IGHA2) se denomina SEQ ID NO: 2 (número de registro de UniProtKB P01877-1; esta es la versión 4 de la secuencia del 15 de marzo de 2017):
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNWVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDAS
GDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNSSQDVTVPCRVPPPPPCCHPRLSLHRPA
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GFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKKGETFSC
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El término “IGHA2”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína IGHA2 humana con SEQ ID NO: 2 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 2.
La presencia de PIGR e IGHA2 en lesiones ateroscleróticas tempranas es un hallazgo nuevo. PIGR e IGHA2 están relacionadas funcionalmente y se sabe que están implicadas en la respuesta inmunitaria humoral. Se piensa que las inmunoglobulinas IgA son la primera línea de protección inmunitaria específica de antígeno en las superficies de las mucosas, mientras que PIGR es un receptor que se une a IgA e IgM poliméricas circulantes en la superficie basolateral de células epiteliales intestinales y las transporta a través de la célula para su secreción en la superficie apical hacia la luz intestinal (Kaetzel CS, 2005; Wines BD y Hogarth PM, 2006). Si bien, en la actualidad, la aterosclerosis se considera una enfermedad inmunitaria-inflamatoria crónica con un fuerte componente autoinmunitario y una clara contribución por parte de la inmunidad tanto innata como adaptativa (Hansson GK y Hemmnsson A, 2011), hay poca información sobre el papel de los anticuerpos IgA en enfermedades Cv (Tsiantoulas D et al., 2014). Se ha descrito que los niveles de PIGR aumentan en el esputo y la sangre de fumadores y pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Ohlmeier S et al., 2012); además, PIGR se vinculó con el hecho de fumar en una cohorte del estudio de descendencia de Framingham, aunque los niveles de PIGR no estaban asociados con la enfermedad CV en esa cohorte (Ngo D et al., 2016). El único vínculo entre PIGR y la ateroesclerosis conocido por los presentes inventores es el nivel elevado de esta proteína en las vesículas extracelulares de individuos con síndrome coronario agudo, aunque la inclusión de este parámetro no mejoró la detección de la enfermedad con respecto a factores de riesgo convencionales o troponina I (de Hoog VC et al., 2013). No se ha descrito antes ninguna asociación entre la isoforma de IgA IGHA2 y la aterosclerosis; sin embargo, se ha descrito IgA total en suero elevada (que incluye IGHA1, la isoforma más abundante, e IGHA2) en relación con la aterosclerosis avanzada o acontecimientos CV de último estadio; por ejemplo, en pacientes con aterosclerosis grave (Muscari A et al., 1988) o con infarto de miocardio u otros acontecimientos isquémicos principales previos (Muscari A et al., 1993). Los niveles de IgA, junto con los de IgE e IgG, pero no IgM, también se correlacionan con infarto de miocardio y muerte cardiaca en hombres dislipidémicos (Kovanen PT et al., 1998).
La apolipoproteína(a) (APOA) es el principal constituyente de la lipoproteína(a) (LPA). Se sabe que APOA es escindida proteolíticamente y que los fragmentos se acumulan en lesiones ateroscleróticas. Se sabe bien que APOA se acumula en la íntima; esta proteína contiene sitios de unión a lisina que permiten que se una fuertemente a las superficies expuestas en el endotelio denudado, entre y se acumule en los espacios subíntimos (Tsimikas S, 2017). Existen abundantes evidencias que vinculan APOA con la ateroesclerosis. Aunque el papel fisiológico de Lp(a) en seres humanos todavía no se ha dilucidado por completo (Orso E y Schmitz G, 2017), se ha identificado que la partícula es un predictor independiente de la calcificación arterial coronaria (Greif M et al., 2013), y la epidemiología respalda una fuerte asociación entre Lp(a) elevada y los desenlaces de enfermedad CV aterosclerótica (Ellis KL et al., 2017), lo que sugiere que Lp(a) desempeña un papel causal en la enfermedad (Ellis KL y Watts GF, 2018). No existen tratamientos que reduzcan específicamente Lp(a) y, por tanto, no se ha demostrado el potencial efecto de reducción de Lp(a) sobre el riesgo de CVD; no obstante, algunas autoridades recomiendan someter a prueba los niveles de Lp(a) en determinadas situaciones clínicas, por ejemplo, en individuos con un historial personal o familiar de CAD prematura o en riesgo intermedio/alto de CAD (Ellis KL y Watts GF, 2018).
Los presentes resultados proporcionan la primera demostración del potencial de los niveles de proteína APOA como un predictor independiente de aterosclerosis en la fase subclínica, complementando la información proporcionada no sólo por factores de riesgo conocidos, sino también por IGAH2 y HPT.
La secuencia canónica de APOA humana se denomina SEQ ID NO: 3 (número de registro de UniProtKB P08519; esta es la versión 1 de la secuencia del 1 de agosto de 1988):
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El término “APOA”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína APOA humana con SEQ ID NO: 3 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 3.
La cadena pesada del inhibidor de inter-alfa-tripsina H1 (ITIH1) puede actuar como un portador de hialuronano en suero o como proteína de unión entre el hialuronano y otra proteína de matriz, que incluye aquellas en las superficies celulares en tejidos para regular la localización, la síntesis y la degradación del hialuronano que son esenciales para que las células que experimentan los procesos biológicos. La secuencia canónica de ITIH1 humana
se denomina SEQ ID NO: 4 (número de registro de UniProtKB P19827; esta es la versión 3 de la secuencia del 15 de julio de 1998):
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El término “ITIH1”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína ITIH1 humana con SEQ ID NO: 4 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 4.
La activación del complemento C5 humano por una convertasa C5 inicia el ensamblaje espontáneo de los componentes del complemento tardíos, C5-C9, para dar el complejo de ataque a la membrana. La secuencia canónica de C5 humano se denomina SEQ ID NO: 5 (número de registro de UniProtKB P01031-1; esta es la versión 4 de la secuencia del 5 de febrero de 2008):
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El término “C5”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína C5 humana con SEQ ID NO: 5 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 5.
La presencia y acumulación de HPT en la capa íntima es coherente con su papel antioxidante en el fomento de la depuración de hemoglobina libre liberada de los eritrocitos (RBC, red blood cells); sin embargo, no se ha
documentado antes la acumulación de HPT en las fases más tempranas de la formación de placas. A este respecto, recientemente se ha revelado la presencia de hierro activo por rédox, hemoglobina y glicoforina A en placas ateroscleróticas tempranas, lo que implica la infiltración de RBC en la íntima como uno de los desencadenantes iniciales de la oxidación en la íntima (Delbosc S et al., 2017).
Varios estudios en seres humanos han indicado que el fenotipo 2-2 de HPT puede estar asociado con CVD en diabetes mellitus tipo 2 (Levy AP et al., 2002; Levy AP et al., 2004). Previamente, se han observado niveles aumentados de HPT en pacientes con CAD (Lee cW et al., 2013) y eran predictivos de acontecimientos de CV (Holme I et al., 2009). La HPT se considera una proteína de fase aguda y, al igual que otras proteínas de esta clase, tales como CRP, fibrinógeno y proteína amiloidea sérica, se ha utilizado como un marcador de inflamación. Estos marcadores, solos o en combinación, mejoran la predicción de acontecimientos de CV principales, tales como infarto de miocardio agudo y accidente cerebrovascular isquémico (Holme I et al., 2009; Engstrom G et al., 2002; Holme I et al., 2010; Brea D et al., 2009; Sabatine MS et al., 2007). Sin embargo, estas proteínas también detectan otras enfermedades asociadas a la inflamación; por ejemplo, se producen aumentos similares en HPT y fibrinógeno en pacientes con disfunción renal o enfermedad CV avanzada, lo que refleja acontecimientos inflamatorios compartidos en estas afecciones (Luczak M et al., 2011). Además, un estudio reciente de las asociaciones entre proteínas de fase aguda y los desenlaces de CV en 581 pacientes no descubrió ninguna asociación entre HPT y características de placas coronarias o acontecimientos clínicos (Battes LC et al., 2014). En un estudio de proteómica de descubrimiento, se descubrió que los marcadores inflamatorios SAA-1 y CRP estaban aumentados en pacientes con aterosclerosis estable o síndrome coronario agudo, pero no se detectaron cambios en los niveles de HPT (Kristensen LP et al., 2014). Los presentes resultados no mostraron ninguna asociación de estas proteínas de fase aguda con el grosor de placa o CACS. Estos resultados sugieren que los niveles de HPT en plasma no rastrean estrictamente el comportamiento de marcadores inflamatorios.
La secuencia canónica de haptoglobina humana se denomina SEQ ID NO: 9 (número de registro de UniProtKB P00738; esta es la versión 1 de la secuencia del 21 de julio de 1986):
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El término “HPT”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína haptoglobina humana con SEQ ID NO: 9 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 9.
Previamente, se ha hallado HEP2 en el núcleo rico en lípidos de ateromas (Rau JC et al., 2009), pero no se ha descrito en placas tempranas. La expresión reducida de HEP2 se ha asociado con aterosclerosis agravada (Kanagawa Y et al., 2001; Takamori N et al., 2004), supuestamente debido a su papel como inhibidor de trombina. De manera similar, la actividad de HEP2 en plasma se ha asociado de manera inversa con la prevalencia de la enfermedad arterial (Aihara K et al., 2009), se ha demostrado que individuos con altos niveles de HEP2 tienen menos aterosclerosis (Aihara K et al., 2004) y se piensa que HEP2 desempeña un papel protector frente a la remodelación vascular y cardiaca (Aihara K et al., 2009; Ikeda Y et al., 2012). Por lo tanto, el presente hallazgo de que HEP2 está aumentado en aterosclerosis subclínica no se esperaba a partir de los estudios previos.
La secuencia canónica del cofactor 2 de heparina (HEP2) humano se denomina SEQ ID NO: 10 (número de registro de UniProtKB P05546; esta es la versión 3 de la secuencia del 1 de noviembre de 1991):
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El término “HEP2”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína HEP2 humana con SEQ ID NO: 10 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 10. En una realización particular, el procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de la presente
invención comprende determinar en la etapa a) los niveles de expresión de proteína de uno o varios biomarcadores que comprenden o que consisten en:
i. PIGR y/o IGHA2; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro o cinco biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5.
Preferentemente, la etapa a) comprende determinar los niveles de expresión de PIGR y/o IGHA2 y uno, dos o tres biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5. Por consiguiente, en una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dichos uno o varios biomarcadores en la etapa a) son una pluralidad de biomarcadores que comprende o que consiste en:
a. PIGR y/o IGHA2, y APOA;
b. PIGR y/o IGHA2, y HPT;
c. PIGR y/o IGHA2, y HEP2;
d. PIGR y/o IGHA2, y C5;
e. PIGR y/o IGHA2, e ITIH1;
f. PIGR y/o IGHA2, APOA y HPT;
g. PIGR y/o IGHA2, APOA y HEP2;
h. PIGR y/o IGHA2, APOA y C5;
i. PIGR y/o IGHA2, APOA e ITIH1;
j. PIGR y/o IGHA2, HPT y HEP2;
k. PIGR y/o IGHA2, HPT y C5;
l. PIGR y/o IGHA2, HPT e ITIH1;
m. PIGR y/o IGHA2, HEP2 y C5;
n. PIGR y/o IGHA2, HEP2 e ITIH1;
o. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT y C5;
p. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT e ITIH1;
q. PIGR y/o IGHA2, APOA, HEP2 y C5;
r. PIGR y/o IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1;
s. PIGR y/o IGHA2, HPT, HEP2 y C5;
t. PIGR y/o IGHA2, HPT, HEP2 e ITIH1; y
u. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT y HEP2.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dichos uno o varios biomarcadores en la etapa a) son una pluralidad de biomarcadores que comprende o que consiste en:
- PIGR, APOA e ITIH1; o
- PIGR, APOA y C5; o
- IGHA2, APOA e ITIH1; o
- IGHA2, APOA y C5; o
- PIGR, ITIH1 y C5; o
- IGHA2, ITIH1 y C5.
Más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende PIGR y/o IGHA2; y comprende, además, dos biomarcadores que son APOA; y, como mínimo, uno de HPT, HEP2, ITIH1 o C5. Por consiguiente, en otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones o características descritas en el presente documento, dicha pluralidad de biomarcadores comprende o consiste en:
- IGHA2, APOA y, como mínimo, uno de HPT, HEP2, ITIH1 o C5; o
- PIGR, APOA y, como mínimo, uno de HPT, HEP2, ITIH1 o C5.
Incluso más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende o consiste en:
- IGHA2, APOA y HPT; o
- PIGR, APOA y HPT.
En una realización adicional, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende o consiste en PIGR, IGHA2, APOA y, como mínimo, uno de HPT, HEP2, ITIH1 o C5. Preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende o consiste en una pluralidad de biomarcadores seleccionados entre el grupo que consiste en:
(i) PIGR, IGHA2, APOA, ITIH1 y C5;
(ii) PIGR, IGHA2, APOA, HPT y HEP2;
(iii) PIGR, IGHA2, APOA, HPT e ITIH1;
(iv) PIGR, IGHA2, APOA, HPT y C5;
(v) PIGR, IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1; y
(vi) PIGR, IGHA2, APOA, HEP2 y C5.
Realizaciones alternativas, que no forman parte de la presente invención, comprenden determinar en la etapa a) los niveles de expresión de uno o varios biomarcadores que comprenden o que consisten en:
i. como mínimo, ITIH1; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2.
Preferentemente, dichos uno o varios biomarcadores en a) son una pluralidad de biomarcadores que comprende ITIH1 y uno o dos biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, h Ep2, C5, PIGR e IGHA2. Por consiguiente, en una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dicha pluralidad de biomarcadores comprende o consiste en:
- ITIH1 y APOA; o
- ITIH1 y PIGR; o
- ITIH1 e IGHA2; o
- ITIH1 y C5; o
- ITIH1 y HPT; o
- ITIH1 y HEP2; o
- ITIH1, APOA y PIGR; o
- ITIH1, APOA e IGHA2; o
- ITIH1, APOA y C5; o
- ITIH1, APOA y HPT; o
- ITIH1, APOA y HEP2; o
- ITIH1, PIGR e IGHA2; o
- ITIH1, PIGR y C5; o
- ITIH1, PIGR y HPT; o
- ITIH1, PIGR y HEP2; o
- ITIH1, IGHA2 y C5; o
- ITIH1, IGHA2 y HPT; o
- ITIH1, IGHA2 y HEP2; o
- ITIH1, C5 y HPT; o
- ITIH1, C5 y HEP2; o
- ITIH1, HPT y HEP2.
Más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende ITIH1 y dos biomarcadores que consisten en (i) APOA; y (ii) como mínimo, uno de PIGR, IGHA2, HPT, HEP2 o C5.
Realizaciones alternativas adicionales, que no forman parte de la presente invención, comprenden determinar en la etapa a) los niveles de expresión de uno o varios biomarcadores que comprenden o que consisten en:
i. como mínimo, HPT; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre APOA, HEP2, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2.
Preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende HPT y uno o dos biomarcadores seleccionados entre APOA, HEP2, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2. Por consiguiente, en una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dicha pluralidad de biomarcadores comprende o consiste en:
- HPT y APOA; o
- HPT y PIGR; o
- HPT e IGHA2; o
- HPT y C5; o
- HPT e ITIH1; o
- HPT y HEP2;
- HPT, APOA y PIGR; o
- HPT, APOA e IGHA2; o
- HPT, APOA y C5; o
- HPT, APOA e ITIH1; o
- HPT, APOA y HEP2; o
- HPT, PIGR e IGHA2; o
- HPT, PIGR y C5; o
- HPT, PIGR e ITIH1; o
- HPT, PIGR y HEP2; o
- HPT, IGHA2 y C5; o
- HPT, IGHA2 e ITIH1; o
- HPT, IGHA2 y HEP2; o
- HPT, C5 e ITIH1; o
- HPT, C5 y HEP2; o
- HPT, ITIH1 y HEP2.
Más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende HPT y dos biomarcadores que consisten en (i) APOA; y (ii) como mínimo, uno de PIGR, HEP2, IGHA2, C5 o ITIH1.
Realizaciones alternativas todavía adicionales, que no forman parte de la presente invención, comprenden determinar en la etapa a) los niveles de expresión de uno o varios biomarcadores que comprenden o que consisten en:
i. como mínimo, APOA; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre ITIH1, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2.
Preferentemente, dichos uno o varios biomarcadores en a) son una pluralidad de biomarcadores que comprende APOA y uno o dos biomarcadores seleccionados entre ITIH1, HPT, h Ep2, C5, PIGR e IGHA2. Por consiguiente, en una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dicha pluralidad de biomarcadores comprende o consiste en:
- APOA e ITIH1; o
- APOA y PIGR; o
- APOA e IGHA2; o
- APOA y C5; o
- APOA y HPT; o
- APOA y HEP2; o
- APOA, ITIH1 y PIGR; o
- APOA, ITIH1 e IGHA2; o
- APOA, ITIH1 y C5; o
- APOA, ITIH1 y HPT; o
- APOA, ITIH1 y HEP2; o
- APOA, PIGR e IGHA2; o
- APOA, PIGR y C5; o
- APOA, PIGR y HPT; o
- APOA, PIGR y HEP2; o
- APOA, IGHA2 y C5; o
- APOA, IGHA2 y HPT; o
- APOA, IGHA2 y HEP2; o
- APOA, C5 y HPT; o
- APOA, C5 y HEP2; o
- APOA, HPT y HEP2.
Más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende APOA y dos biomarcadores que consisten en (i) HPT; y (ii) como mínimo, uno de PIGR, IGHA2, HEp2, ITIH1 o C5.
Realizaciones alternativas todavía adicionales, que no forman parte de la presente invención, comprenden determinar en la etapa a) los niveles de expresión de uno o varios biomarcadores que comprenden o que consisten en:
i. como mínimo, HEP2; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2.
Preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende HEP2 y uno o dos biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, C5, ITIH1, PIGR e IGHA2. Por consiguiente, en una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones descritas en el presente documento, dicha pluralidad de biomarcadores comprende o consiste en:
- HEP2 y APOA; o
- HEP2 y PIGR; o
- HEP2 e IGHA2; o
- HEP2 y C5; o
- HEP2 e ITIH1; o
- HEP2 y HPT; o
- HEP2, APOA y PIGR; o
- HEP2, APOA e IGHA2; o
- HEP2, APOA y C5; o
- HEP2, APOA e ITIH1; o
- HEP2, APOA y HPT; o
- HEP2, PIGR e IGHA2; o
- HEP2, PIGR y C5; o
- HEP2, PIGR e ITIH1; o
- HEP2, PIGR y HPT; o
- HEP2, IGHA2 y C5; o
- HEP2, IGHA2 e ITIH1; o
- HEP2, IGHA2 y HPT; o
- HEP2, C5 e ITIH1; o
- HEP2, C5 y HPT; o
- HEP2, ITIH1 y HPT.
Más preferentemente, dicha pluralidad de biomarcadores en a) comprende HEP2 y dos biomarcadores que consisten en (i) APOA; y (ii) como mínimo, uno de PIGR, HPT, IGHA2 , C5 o ITIH1.
El término “muestra” o la expresión “muestra biológica”, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar el biomarcador deseado y puede comprender material celular y/o no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido o fluido biológico adecuado, tal como, por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, líquido amniótico, líquidos linfáticos, secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leucocitos. Preferentemente, las muestras utilizadas para la determinación del nivelo niveles de los marcadores de proteína en los procedimientos de la presente invención son muestras que se pueden obtener utilizando procedimientos mínimamente invasivos. En una realización preferente, las muestras son muestras de sangre, plasma o suero. Preferentemente, esta muestra biológica es plasma sanguíneo.
Estos tipos de muestras se utilizan de manera rutinaria en la práctica clínica y un experto en la materia sabrá cómo identificar los medios más apropiados para su obtención y conservación. Una vez que se ha obtenido la muestra, se puede utilizar fresca, se puede congelar, liofilizar o conservar utilizando medios apropiados.
La expresión “determinar los niveles del marcador”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a determinar la cantidad o concentración absoluta o relativa del biomarcador en la muestra. Un experto conoce bien técnicas para someter a ensayo los niveles de biomarcadores individuales de muestras de prueba, y la presente invención no está limitada a los medios mediante los cuales se evalúan los componentes.
En la técnica se conocen bien procedimientos para cuantificar la expresión de proteínas. Entre los procedimientos adecuados para determinar los niveles de una proteína determinada se incluyen, sin limitación, aquellos descritos a continuación en el presente documento. Los procedimientos preferentes para determinar los niveles de expresión de proteína en los procedimientos de la presente invención son inmunoensayos. Un experto en la materia conoce diversos tipos de inmunoensayos para la cuantificación de proteínas de interés. Estos procedimientos se basan en la utilización de reactivos de afinidad, que pueden ser cualquier anticuerpo u otro ligando que se une específicamente a la proteína diana o a un fragmento de la misma, en los que dicho reactivo de afinidad está, preferentemente, marcado. Por ejemplo, el reactivo de afinidad se puede marcar enzimáticamente, o se puede marcar con un isótopo radiactivo o con un agente fluorescente.
Los reactivos de afinidad pueden ser cualquier anticuerpo o ligando que se une específicamente a la proteína diana o a un fragmento de la misma. Entre los ligandos de afinidad se pueden incluir proteínas, péptidos, aptámeros de ácido nucleico o de péptido, y otros armazones de proteína específica diana, como miméticos de anticuerpo. Los anticuerpos específicos contra los marcadores de proteína utilizados en los procedimientos de la presente invención se pueden producir, por ejemplo, inmunizando un anfitrión con una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma. Del mismo modo, los péptidos específicos contra los marcadores de proteína utilizados en los procedimientos de la presente invención se pueden producir mediante el cribado de bibliotecas de péptidos sintéticos.
Las técnicas de inmunotransferencia o de transferencia Western permiten la comparación de la abundancia relativa de proteínas separadas mediante un gel electroforético (por ejemplo, proteínas nativas por la estructura tridimensional o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido). Las técnicas de inmunotransferencia utilizan anticuerpos (u otros ligandos específicos en técnicas relacionadas) para identificar proteínas diana entre un conjunto de especies de proteínas no relacionadas. Implican la identificación de la diana de proteína a través de reacciones específicas de antígeno-anticuerpo (o proteína-ligando). Las proteínas se separan normalmente mediante electroforesis y se transfieren a una lámina de material polimérico (en general, nitrocelulosa, nailon o
poli(difluoruro de vinilideno)). Las transferencias por puntos y por ranuras son procedimientos simplificados en los que las muestras de proteína no se separan mediante electroforesis, sino que se inmovilizan directamente sobre una membrana.
Tradicionalmente, la cuantificación de proteínas en solución se ha llevado a cabo mediante inmunoensayos sobre un soporte sólido. Dicho inmunoensayo puede ser, por ejemplo, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de inmunoadsorción fluorescente (FIA), un inmunoensayo de quimioluminiscencia (CIA) o un radioinmunoensayo (RIA), un inmunoensayo enzimático multiplicado, un radioinmunoensayo en fase sólida (SPROA), un ensayo de polarización de fluorescencia (FP), un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FrET), un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia con resolución temporal (TR-FRET), un ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR). Específicamente, se abarcan múltiples versiones y cualquier versión de nueva generación de cualquiera de los anteriores. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un ensayo ELISA o cualquier versión múltiple del mismo.
Otros procedimientos que se pueden utilizar para la cuantificación de proteínas en solución son técnicas basadas en espectrometría de masas (Ms), también denominada espectroscopía de masas. La expresión “procedimientos basados en espectrometría de masas (MS)”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a espectrometría de masas sola o acoplada a otros procedimientos de detección o separación, que incluyen cromatografía de gases combinada con espectroscopía de masas, cromatografía líquida combinada con espectroscopía de masas, cromatografía de fluidos supercríticos combinada con espectroscopía de masas, cromatografía líquida de alta resolución combinada con espectrometría de masas, MALDI combinada con espectroscopía de masas, espectroscopía de ionización por pulverización combinada con espectroscopía de masas, electroforesis capilar combinada con espectrometría de masas, RMN combinada con espectrometría de masas e IR combinado con espectrometría de masas. Estos procedimientos basados en MS pueden incluir MS individual o MS en tándem. En otra realización particular, los niveles de expresión de proteína se determinan mediante análisis de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
Los espectrómetros de masas funcionan convirtiendo las moléculas de analito en un estado cargado (ionizado), con el posterior análisis de los iones y cualquier fragmento de iones que se producen durante el procedimiento de ionización, basándose en su proporción de masa con respecto a carga (m/z). Están disponibles varias tecnologías diferentes tanto para la ionización como para el análisis de iones, lo que da lugar a muchos tipos diferentes de espectrómetros de masas con diferentes combinaciones de estos dos procedimientos. Por un lado, entre los ejemplos de fuentes de iones se incluyen fuente de ionización por electropulverización, fuente de ionización química a presión atmosférica, foto-ionización a presión atmosférica o ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI). Por otro lado, los analizadores de espectrometría de masas pueden ser, pero sin limitarse a los mismos, analizadores de cuadrupolo, analizadores de tiempo de vuelo (TOF), analizadores de trampa de iones, analizadores de Orbitrap o analizadores híbridos, tales como analizadores híbridos de cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF), analizadores híbridos de cuadrupolo-Orbitrap, analizadores híbridos de trampa de iones-Orbitrap, analizadores híbridos triple cuadrupolo-trampa de iones lineal o analizadores trihíbridos de cuadrupolo-trampa de iones-Orbitrap. En una realización preferente, los niveles de los marcadores de proteína se determinan utilizando un analizador híbrido de cuadrupolo-Orbitrap.
Se pueden utilizar patrones internos en el análisis de MS, ya que permite corregir cualquier pérdida o ineficiencia en el procedimiento de preparación de muestras o cualquier alteración en la eficiencia de ionización, por ejemplo, las debidas a la supresión de iones. Las versiones isotópicas isobáricas o estables del analito son patrones internos ideales ya que tienen propiedades químicas casi idénticas, pero se distinguen fácilmente durante la MS. En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las realizaciones descritas anteriormente 0 a continuación, la determinación de los niveles del marcador de proteína se lleva a cabo mediante un procedimiento basado en MS utilizando versiones marcadas isobáricas/isotópicas del marcador de proteína como patrones internos. Además, o alternativamente, se pueden realizar adiciones conocidas al disolvente de extracción de compuestos no detectados en muestras biológicas sin adiciones conocidas.
Tal como se muestra en los ejemplos (véanse las tablas 5 y 6), IGHG1 e IGHG2 también son predictores independientes de aterosclerosis subclínica. En particular, se ha demostrado que estos disminuyen en presencia de la enfermedad. Por consiguiente, el procedimiento de la presente invención puede comprender además:
a) determinar en dicha muestra biológica los niveles de expresión de proteína de IGHG1 y/o IGHG2; b) comparar los niveles de los biomarcadores con un valor de referencia;
c) en el que cuando los niveles de IGHG1 y/o IGHG2 en la muestra del sujeto están disminuidos con respecto al valor de referencia correspondiente es indicativo de aterosclerosis subclínica.
Además, los niveles de IGHA2 se pueden expresar en relación con los niveles de cualquiera de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina alfa 1 (IGHA1), región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 (IGHG1), región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 2 (IGHG2) o una combinación de las mismas. Preferentemente, los niveles de IGHA2 se expresan en relación con los niveles de IGHA1 o los niveles promedio de IGHG1 e IGHG2.
La secuencia canónica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina alfa 1 (IGHA1) humana se denomina SEQ ID NO: 6 (número de registro de UniProtKB P01876-1; esta es la versión 2 de la secuencia del 1 de febrero de 1991):
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNWIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDAS
GDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSP
SCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLC
GCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEEL
ALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRV
AAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSWMAEVDGTCY
El término “IGHA1”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína IGHA1 humana con SEQ ID NO: 6 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 6.
La secuencia canónica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 (IGHG1) humana se denomina SEQ ID NO: 7 (número de registro de UniProtKB P01857-1; esta es la versión 1 de la secuencia del 21 de julio de 1986):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
El término “IGHG1”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína IGHG1 humana con SEQ ID NO: 7 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 7.
La secuencia canónica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 2 (IGHG2) humana se denomina SEQ ID NO: 8 (número de registro de UniProtKB P01859-1; esta es la versión 2 de la secuencia del 16 de diciembre de 2008):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
El término “IGHG2”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína IGHG2 humana con SEQ ID NO: 8 y a secuencias idénticas sustancialmente a la misma. Preferentemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 8.
Los inventores también descubrieron que IGHG1, IGKC e IGLC2 disminuían con el grosor de placa en PESA-V1, mientras que IGHA1, IGHG3, IGHG4 e IGHM no se vieron afectadas, permaneciendo estos cambios detectables en PESA-V2 (figura 3A). Por lo tanto, los datos presentados respaldan el papel de la respuesta inmunitaria humoral en las fases tempranas de la ateroesclerosis (Tsiantoulas D et al., 2014) y también sugieren la existencia del intercambio de clases de Ig. Se ha propuesto un papel en el intercambio de clases de IgA para BAFF (factor de activación de células B) y APRIL (ligando de inducción de la proliferación), dos factores implicados en el desarrollo de células B en enfermedades autoinmunitarias (Kaneko T et al., 2014), con evidencias que sugieren un papel para BAFF en dirigir el intercambio de IgA1 y para APRIL en dirigir el intercambio de IgA2 (Litinskiy MB et al., 2002). Por tanto, es concebible que un intercambio de clases de IgA está desencadenado por la activación diferencial de subconjuntos específicos de células B que se propone que tiene lugar durante la aterosclerosis (Tsiantoulas D et al., 2014).
En la etapa (b), el procedimiento de detección y/o diagnóstico de la presente invención comprende comparar el nivel o niveles del marcador o marcadores de proteína con un valor de referencia.
La expresión “valor de referencia”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un criterio predeterminado utilizado como una referencia para evaluar los valores o datos obtenidos a partir de las muestras recogidas de un sujeto. Este “valor de referencia” también se puede denominar “valor de corte” o “valor umbral”.
El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o un límite inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor que se compara con un valor de control o de nivel inicial particular. Un valor de referencia puede estar basado
en un valor de muestra individual o puede estar basado en un gran número de muestras, tales como de una población de sujetos del grupo coincidente de edad cronológica, o basado en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen la muestra que va a someterse a prueba.
Los niveles de expresión de los marcadores de proteína se pueden utilizar para calcular una puntuación combinada que va a compararse con un valor de referencia. La puntuación combinada es un valor obtenido según una fórmula o un algoritmo matemático determinado, en los que los valores de expresión de cada uno de los marcadores de proteína utilizados en los procedimientos de la presente invención son variables de dicho algoritmo matemático. En una realización particular, cuando se calcula la puntuación combinada, esta es proporcional a los niveles de expresión de uno o varios de PIGR, IGHA2, ApOa , HPT, HEP2, ITIH1 y C5, en la que cuanto mayor sea la puntuación, mayor será la probabilidad de aterosclerosis subclínica.
Además, en la etapa (c), el procedimiento, según el primer aspecto de la presente invención, comprende clasificar al sujeto como que tiene o presenta una alta probabilidad de padecer aterosclerosis subclínica, según la comparación con el valor de referencia, en el que cuando los niveles de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y/o C5 en la muestra del sujeto están aumentados en la muestra del sujeto con respecto al valor de referencia correspondiente es indicativo de aterosclerosis subclínica.
Los niveles de los biomarcadores se consideran “aumentados” cuando su valor es mayor que un valor de referencia. Preferentemente, los niveles de los biomarcadores (o la puntuación combinada) se consideran mayores que un valor de referencia cuando son, como mínimo, el 10 %, como mínimo, el 15 %, como mínimo, el 20 %, como mínimo, el 25 %, como mínimo, el 30 %, como mínimo, el 35 %, como mínimo, el 40 %, como mínimo, el 45 %, como mínimo, el 50 %, como mínimo, el 55 %, como mínimo, el 60 %, como mínimo, el 65 %, como mínimo, el 70 %, como mínimo, el 75 %, como mínimo, el 80 %, como mínimo, el 85 %, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 %, como mínimo, el 100 %, como mínimo, el 110 %, como mínimo, el 120 %, como mínimo, el 130 %, como mínimo, el 140 %, como mínimo, el 150 %, o más mayores que el valor de referencia.
Del mismo modo, los niveles de los biomarcadores se consideran “disminuidos” cuando su valor es menor que el valor de referencia. Preferentemente, los niveles de los biomarcadores (o la puntuación combinada) se consideran menores que un valor de referencia cuando son, como mínimo, el 10 %, como mínimo, el 15 %, como mínimo, el 20 %, como mínimo, el 25 %, como mínimo, el 30 %, como mínimo, el 35 %, como mínimo, el 40 %, como mínimo, el 45 %, como mínimo, el 50 %, como mínimo, el 55 %, como mínimo, el 60 %, como mínimo, el 65 %, como mínimo, el 70 %, como mínimo, el 75 %, como mínimo, el 80 %, como mínimo, el 85 %, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 %, como mínimo, el 100 %, como mínimo, el 110 %, como mínimo, el 120 %, como mínimo, el 130 %, como mínimo, el 140 %, como mínimo, el 150 %, o más menores que el valor de referencia.
Alternativamente, o además, los sujetos que tienen más de aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 veces de desviación de niveles con respecto al valor de referencia, tal como se describe en el presente documento.
El procedimiento de la presente invención, tal como entiende un experto en la materia, no reivindica que sea correcto en el 100 % de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad significativa estadísticamente de las muestras analizadas se clasifiquen correctamente. La cantidad que es significativa estadísticamente puede establecerla un experto en la materia por medio de la utilización de diferentes medidas de significación estadística obtenidas mediante pruebas estadísticas; entre los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas medidas de significación estadística se incluyen determinar intervalos de confianza, determinar el valor de p, etc. Los intervalos de confianza preferentes son, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 %, como mínimo, el 97 %, como mínimo, el 98 %, como mínimo, el 99 %. Los valores de p son, preferentemente, menores de 0,1, menores de 0,05, menores de 0,01, menores de 0,005 o menores de 0,0001. Las enseñanzas de la presente invención permiten, preferentemente, clasificar correctamente, como mínimo, el 60 %, como mínimo, el 70 %, como mínimo, el 80 %, o, como mínimo, el 90 % de los sujetos de un grupo o una población de determinación analizados. Además, se observa que la precisión del procedimiento de la presente invención se puede aumentar adicionalmente mediante la consideración adicional de parámetros bioquímicos y/o características clínicas de los pacientes (por ejemplo, la edad, el sexo, el tabaco y/u otros factores de riesgo cardiovasculares), tales como los incluidos en puntuaciones de riesgo cardiovascular tradicionales.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o varias de las realizaciones o características tal como se describen en el presente documento, el procedimiento, según el primer aspecto de la presente invención, comprende, además, llevar a cabo una puntuación de riesgo cardiovascular tradicional. Normalmente, las puntuaciones de riesgo comprenden determinaciones bioquímicas y fisiológicas, así como otras características clínicas y/o de estilo de vida del sujeto. Preferentemente, dicha puntuación de riesgo cardiovascular tradicional se selecciona entre el grupo que consiste en FHS-10 años o FHS-30 años (Kannel et al., 1979; Splansky et al., 2007), ICHS (Fernández-Alvira et al., 2017) y las puntuaciones BEWa T (Fernández-Alvira et al., 2017), más preferentemente en la que dicha puntuación de riesgo cardiovascular es FHS-10 años.
Dicha puntuación de riesgo se puede combinar con las mediciones de proteína de PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y/o C5 (que incluyen cualquier combinación de las mismas, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento) utilizando combinaciones matemáticas apropiadas, preferentemente, utilizando modelos de regresión logística multivariante. En una realización particular, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones o características, tal como se describen en el presente documento, dicho procedimiento es, preferentemente, un procedimiento para el cribado y/o el diagnóstico de aterosclerosis subclínica y la medición de biomarcadores se realiza en una muestra aislada de un sujeto clasificado como de bajo riesgo cuando se lleva a cabo una puntuación de riesgo cardiovascular tradicional. Por ejemplo, el riesgo de cardiopatía coronaria (CHD, coronary heart disease) a los 10 años en porcentaje se puede calcular con la ayuda de la puntuación de riesgo de Framingham (FHS-10 años). Los individuos con bajo riesgo tienen un riesgo de CHD del 10 % o menos a los 10 años, con un riesgo intermedio del 10-20 % y con un alto riesgo del 20 % o más. Sin embargo, se debe recordar que estas clasificaciones son arbitrarias.
Además, el procedimiento, según el primer aspecto de la presente invención, puede comprender, además, llevar a cabo estudios de obtención de imágenes in vivo. Esto puede incluir, pero sin limitar a los mismos, análisis por ecografía vascular bidimensional/tridimensional de la presencia y la morfología de placas ateroscleróticas y análisis de tomografía computarizada de la calcificación arterial coronaria. Preferentemente, se llevan a cabo estudios de obtención de imágenes in vivo adicionales en aquellos sujetos seleccionados por presentar en la etapa c) niveles de biomarcadores indicativos de aterosclerosis.
Los procedimientos de la presente invención o cualquiera de las etapas de los mismos se podrían implementar mediante un ordenador. Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento implementado por ordenador, en el que el procedimiento es cualquiera de los procedimientos que forman parte de la presente invención dada a conocer en el presente documento o cualquier combinación de los mismos.
Cabe destacar que cualquier programa informático que pueda implementar cualquiera de los procedimientos de la presente invención o utilizar cualquiera de estos procedimientos, o cualquier combinación de los mismos, también forma parte de la presente invención. Normalmente, este programa informático se puede cargar directamente en la memoria interna de un ordenador digital, que comprende partes de código de software para realizar las etapas de comparar los niveles de los marcadores de proteína, tal como se describe en la presente invención, de las una o varias muestras biológicas de un sujeto, con un valor de referencia y determinar la presencia o probabilidad de padecer aterosclerosis subclínica, cuando dicho producto se ejecuta en un ordenador.
Además, cabe destacar que cualquier dispositivo o aparato que comprenda medios para llevar a cabo las etapas de cualquiera de los procedimientos de la presente invención o cualquier combinación de los mismos, o para llevar a cabo un programa informático que pueda implementar cualquiera de los procedimientos de la presente invención o cualquier combinación de los mismos, se incluye como parte de la presente memoria descriptiva.
Los procedimientos de la presente invención también pueden comprender el almacenamiento de los resultados del procedimiento en un portador de datos, preferentemente, en los que dicho portador de datos es un medio legible por ordenador. La presente invención se refiere, además, a un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene almacenado en el mismo un programa informático de la presente invención o los resultados de cualquiera de los procedimientos de la presente invención. Tal como se utiliza en el presente documento, “un medio legible por ordenador” puede ser cualquier aparato que puede incluir, almacenar, comunicar, propagar o transportar los resultados de la determinación del procedimiento de la presente invención. El medio puede ser un sistema (o aparato o dispositivo) electrónico, magnético, óptico, electromagnético, de infrarrojos o semiconductor o un medio de propagación.
En un segundo aspecto, que no forma parte de la presente invención, se da a conocer en el presente documento un procedimiento para tratar a un sujeto que padece aterosclerosis subclínica, en el que dicho procedimiento comprende:
a. identificar un sujeto que padece aterosclerosis subclínica mediante el procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización, tal como se define en el presente documento;
b. administrar a dicho paciente una cantidad eficaz terapéuticamente de un tratamiento adecuado para prevenir/reducir placas ateroscleróticas.
Estos pueden incluir tratamientos para reducir los niveles de colesterol de HDL o los niveles de triglicéridos totales; y/o para aumentar los niveles de colesterol de HDL en plasma. En la actualidad, las estatinas se encuentran entre los fármacos más eficaces terapéuticamente disponibles para reducir el nivel de LDL en sangre. También se sabe que las estatinas aumentan los niveles de colesterol de h Dl y disminuyen los niveles de triglicéridos totales. Se cree que las estatinas alteran la biosíntesis de colesterol y otros esteroles en el hígado mediante la inhibición competitiva de la enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa (“HMG-CoA reductasa”). La HMG-CoA reductasa cataliza la conversión de HMG-CoA en mevalonato, que es la etapa determinante de la velocidad en la biosíntesis de colesterol. En consecuencia, su inhibición conduce a una reducción en la velocidad de formación de colesterol en el hígado. En la técnica se conocen bien las estatinas, y entre estas se incluyen, por ejemplo, pravastatina,
simvastatina, lovastatina, fluvastatina, atorvastatina y rosuvastatina.
Kit y utilización de un kit en los procedimientos de la invención
En un aspecto adicional, en el presente documento se describe, aunque no forma parte de la presente invención, un kit para determinar los niveles de uno o varios de los marcadores de proteína, tal como se describen en el presente documento, en una muestra biológica aislada de un sujeto. El kit también puede contener instrucciones que indican cómo se pueden utilizar los materiales dentro del kit.
El término 'kit” o la expresión “kit de prueba” indica combinaciones de reactivos y adyuvantes requeridos para un análisis. Aunque en la mayoría de los casos un kit de prueba consiste en varias unidades, también están disponibles elementos de análisis de una sola pieza, que del mismo modo se deben considerar como kits de prueba.
En una realización particular, el kit comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de proteína de uno o varios de los marcadores seleccionados entre el grupo que consiste en PIGR, IGHA2, APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5.
Estos reactivos pueden ser útiles para determinar los niveles de expresión del marcador o marcadores de proteína diana utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, la determinación de los niveles de dicho marcador o marcadores de proteína se puede llevar a cabo utilizando un reactivo de afinidad (por ejemplo, mediante un inmunoensayo), tal como se describe según el primer aspecto de la presente invención.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de PIGR o IGHA2 (preferentemente, PIGR e iGhA2);
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) uno, dos, tres, cuatro o cinco de APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de PIGR o IGHA2 (preferentemente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de PIGR y un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de IGHA2);
b. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA; y
c. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de HPT, HEP2, ITIH1 o C5;
d. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización alternativa, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) ITIH1;
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) ITIH1;
b. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA; y
c. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad
para), como mínimo, uno de PIGR, HPT, HEP2, IGHA2 o C5;
d. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización alternativa adicional, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) HPT;
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre APOA, ITIH1, HEP2, C5, PIGR e IGHA2;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) HPT;
b. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA; y
c. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de PIGR, ITIH1, HEP2, IGHA2 o C5;
d. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En todavía realizaciones alternativas adicionales, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA;
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre ITIH1, HPT, HEP2, C5, PIGR e IGHA2;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA;
b. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) HPT; y
c. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de PIGR, ITIH1, HEP2, IGHA2 o C5;
d. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En todavía realizaciones alternativas adicionales, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) HEP2;
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis biomarcadores seleccionados entre ITIH1, HPT, APOA, C5, PIGR e IGHA2;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
En una realización preferente, opcionalmente en combinación con una o varias de las características o realizaciones, tal como se describen en el presente documento, dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) HEP2;
b. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) APOA; y
c. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para), como mínimo, uno de PIGR, ITIH1, HPT, IGHA2 o C5;
d. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
Las combinaciones preferentes de biomarcadores que van a medirse y los reactivos correspondientes (por ejemplo, reactivos de afinidad) son tal como se describieron para el primer aspecto de la presente invención anteriormente en el presente documento.
Además, cualquiera de estas realizaciones puede comprender, además, uno o varios de los siguientes:
- un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) IGHA1;
- un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) IGHG1; o
- un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de (por ejemplo, un reactivo de afinidad para) IGHG2.
La expresión “un reactivo de afinidad para”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un reactivo de afinidad que se puede unir específicamente a la proteína diana indicada. Se pueden marcar los diversos reactivos de afinidad con la misma etiqueta o con etiquetas diferentes. Preferentemente, estos se marcarán con etiquetas diferentes para múltiples análisis.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o varias de las realizaciones o características descritas en el presente documento, dicho reactivo de afinidad es un anticuerpo, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. El reactivo de afinidad se puede unir a cualquier región lineal o conformacional (por ejemplo, epítopo) específica para la proteína diana.
Entre los ejemplos ilustrativos/no limitativos de anticuerpos disponibles en el mercado que se unen específicamente a las proteínas, tal como se describen en el presente documento, se incluyen los siguientes:
- Anticuerpo monoclonal de rata contra PIGR (7C1, ABCAM) número de catálogo ab170321,
- Anticuerpo de ratón contra IgA2 humana (A9604D2, Southern biotech) número de catálogo 9140-01,
- Anticuerpo monoclonal contra complemento C5 (12F3, Thermo scientific) número de catálogo HYB 029-02-02, - Anticuerpo monoclonal de conejo contra lipoproteína(a) [EPR6474, ABCAM) número de catálogo ab125014, - Anticuerpo monoclonal contra iTi H1 (40B10, Thermo scientific) número de catálogo LF-MA014,
- IGHA1: anticuerpo de ratón contra IgA1 humana (Southern biotech, 9130-01)
- IGHG1: anticuerpo monoclonal de ratón contra IgG 1 kappa (ABCAM, ab81032)
- IGHG2: anticuerpo monoclonal de ratón contra IgG2 humana (SIGMA, 15635)
En el presente documento se han descrito posibles inmunoensayos y reactivos de afinidad. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un ensayo ELISA.
En algunas realizaciones, el kit incluye los reactivos de afinidad mencionados anteriormente para la proteína o proteínas diana y uno o varios reactivos auxiliares. Se puede utilizar un reactivo de afinidad primario (por ejemplo, un anticuerpo primario) con propósitos de captura y un reactivo de afinidad secundario (por ejemplo, un anticuerpo secundario) con propósitos de detección.
El reactivo de afinidad primario o de captura es normalmente un anticuerpo monoclonal específico para la proteína diana. Los reactivos de afinidad secundarios o de detección pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Además, estos se pueden obtener de cualquier organismo mamífero, que incluye ratones, ratas, hámsteres, cabras, camellos, pollos, conejos y otros.
El reactivo de afinidad de detección puede estar marcado. Una etiqueta o un marcador pueden ser cualquier composición que sea detectable. Se puede utilizar cualquier medio analítico conocido en la técnica para determinar o detectar el reactivo de afinidad secundario. Estos medios incluyen la utilización de espectroscopía, química, fotoquímica, bioquímica, inmunoquímica u óptica. El marcador puede ser, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, peroxidasa del rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y otras utilizadas habitualmente en un ELISA), un radiomarcador (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas, luminol, etc.), un colorante fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, etc.) o cualquier otro colorante conocido en la técnica. El marcador puede estar acoplado directa o indirectamente (por ejemplo, a través de pares de unión, tales como biotina y avidina) al reactivo de afinidad de detección según procedimientos bien conocidos en la técnica. Tal como se ha indicado anteriormente, se pueden utilizar una amplia variedad de marcadores. La elección del marcador puede depender de la sensibilidad
requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad, la instrumentación disponible o las provisiones de eliminación.
Preferentemente, dicho kit comprende una superficie o un soporte sólido que se recubre con el reactivo de afinidad primario. El soporte sólido puede incluir cualquier soporte conocido en la técnica sobre el que se puede inmovilizar una proteína de esta divulgación. En algunas realizaciones, dichos soportes sólidos son placas de pocillos de microtitulación, portaobjetos (por ejemplo, portaobjetos de vidrio), chips (por ejemplo, chips de proteínas, chips de biosensores, tales como chips Biacore), cartuchos microfluídicos, cubetas, perlas (por ejemplo, perlas magnéticas, perlas xMAP®) o resinas.
Los reactivos auxiliares utilizados normalmente en un inmunoensayo, tal como un inmunoensayo con soporte sólido, pueden incluir, por ejemplo, un tampón de inmovilización, un reactivo de inmovilización, un tampón de dilución, un reactivo de detección, un tampón de bloqueo, un tampón de lavado, un tampón de detección, una solución de parada, un tampón de aclarado del sistema y una solución de limpieza del sistema, que son bien conocidos por un experto en la materia.
Además, la determinación de los niveles de dicho marcador o marcadores de proteína se puede llevar a cabo mediante un procedimiento basado en espectrometría de masas (MS), y dicho kit puede comprender dicho marcador no marcado y/o dicho marcador marcado de manera estable para la detección mediante un procedimiento basado en espectrometría de masas (MS), preferentemente, en el que el marcador está marcado con una etiqueta que comprende uno o varios isótopos estables. Los átomos isotópicos que se pueden incorporar en la etiqueta son átomos pesados, por ejemplo, 13C, 15N, 18O y/o 34S, que se pueden distinguir mediante MS.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la utilización de un kit, según el aspecto anterior, en un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica, tal como se describe en el presente documento.
Las características y realizaciones preferidas son tal como se han definido anteriormente para otros aspectos de la presente invención.
Se contempla que cualquier característica descrita en el presente documento se puede combinar opcionalmente con cualquiera de las realizaciones de cualquier procedimiento, kit, utilización de un kit, o programa informático de la presente invención; y cualquier realización comentada en esta memoria descriptiva se puede implementar con respecto a cualquiera de los mismos. Se entenderá que las realizaciones particulares descritas en el presente documento se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la presente invención. Las características principales de la presente invención se pueden utilizar en diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la presente invención.
La utilización de la palabra “un” o “una” puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o varios”, “como mínimo, uno” y “uno o más de uno”. La utilización del término “otro” u “otra” también se puede referir a uno o varios. La utilización del término “o” en las reivindicaciones se utiliza para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solo o que las alternativas son mutuamente exclusivas.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de procedimiento no indicados adicionales. El término “comprende” también abarca y da a conocer expresamente los términos “consiste en” y “consiste esencialmente en”. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o a las etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la presente invención reivindicada. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en la reivindicación excepto para, por ejemplo, impurezas asociadas normalmente con el elemento o la limitación.
La expresión “o combinaciones de los mismos”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, se pretende que “A, B, C o combinaciones de los mismos” incluya, como mínimo, uno de: A, B, C, AB, AC, bC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Siguiendo con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o varios elementos o términos, tales como Bb , AAA, AB, BBC, AAABCCCC, c BbAAA, CABAbB, y así sucesivamente. El experto en la materia entenderá que normalmente no existe ninguna limitación en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente de otro modo a partir del contexto.
Tal como se utiliza en el presente documento, las palabras de aproximación tales como, sin limitación, “aproximadamente”, “alrededor de”, “de manera aproximada” se refieren a una condición que, cuando está
modificada así, se entiende que no es necesariamente absoluta ni perfecta, pero que se consideraría lo suficientemente cercana a los expertos habituales en la técnica para garantizar que está presente la designación de la condición. El grado en que la descripción puede variar dependerá de la magnitud del cambio que pueda introducirse y que un experto en la materia todavía reconozca que la característica modificada todavía tiene las características y capacidades requeridas de la característica no modificada. En general, pero sujeto a lo comentado anteriormente, un valor numérico en el presente documento que está modificado por una palabra de aproximación, tal como “aproximadamente”, puede variar desde el valor indicado en un ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 %. Por consiguiente, el término “aproximadamente” puede significar el valor indicado ± 5 % de su valor, preferentemente, el valor indicado ± 2 % de su valor, lo más preferentemente, el término “aproximadamente” significa exactamente el valor indicado (± 0 %).
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no se deben interpretar como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLOS EJEMPLO 1.- Identificación de biomarcadores de proteína de aterosclerosis subclínica mediante proteómica cuantitativa - cohorte PESA, visita 1 (PESA-v1)
1.1 Material y procedimientos
Subcohorte PESA: el análisis proteómico se realiza en el plasma de 476 individuos. Las muestras se emparejan según el sexo, la edad y el historial clínico. Todos los individuos de la subcohorte PESA se han sometido a un extenso análisis bioquímico y de imagen, tal como se ha descrito anteriormente (Fernández-Friera et al., 2015; Fernández-Ortiz et al., 2013). Según la extensión de la aterosclerosis subclínica, los individuos se clasificaron en cuatro grupos utilizando la puntuación de PESA (Fernandez-Friera et al., 2015): sin enfermedad, enfermedad focalizada, intermedia y generalizada.
La proteómica cuantitativa mediante marcaje isobárico multiplexado y el análisis cuantitativo de los datos se realizan siguiendo protocolos detallados establecidos en el laboratorio y ya descritos (Burillo et al., 2016; Garcia-Marques et al., 2016; Gomez-Serrano et al., 2016; Latorre-Pellicer et al., 2016; Martin-Alonso et al., 2015). La identificación, cuantificación y análisis estadístico y de sistemas biológicos se realizan mediante modelos desarrollados en el laboratorio de los presentes inventores y descritos en su totalidad con anterioridad (Bonzon-Kulichenko et al., 2015; Garcia-Marques et al., 2016; Jorge et al., 2009; Navarro et al., 2014; Navarro y Vazquez, 2009; Trevisan-Herraz et al., 2018, en prensa). Los análisis por espectrometría de masas se realizan en un equipo híbrido de cuadrupoloorbitrap (HF Orbitrap, ThermoFisher).
Los análisis epidemiológicos se realizan de la siguiente manera. Se lleva a cabo la selección de un panel de potenciales biomarcadores en la subcohorte PESA mediante el análisis de los valores cuantitativos de proteína, determinados tal como se ha descrito anteriormente, utilizando el paquete SPSS construyendo modelos de regresión lineal o logística multivariante para predecir la enfermedad (en cuanto a número de placas, grosor, número de territorios afectados o puntuación de PESA), después del ajuste por todos los demás factores de riesgo conocidos (por ejemplo, colesterol, tensión arterial, sexo, edad, niveles de LDL y HDL). A continuación, se realiza un análisis ROC para medir el aumento del poder predictivo del panel de biomarcadores sobre los procedimientos existentes para predecir el riesgo cardiovascular (por ejemplo, puntuaciones de FHS10 años, BEWAT o ICHS).
1.2.- Análisis de la asociación de los niveles de PIGR, APOA y C5 en plasma con la extensión de las lesiones ateroscleróticas en individuos asintomáticos
Tabla 1.- Análisis de correlación de los niveles de PIGR, APOA y C5 en plasma con grosor medio de placa (medido mediante eco 2D) o con carga de placa (medido mediante eco 3D)
La tabla muestra cómo los niveles de PIGR, APOA y C5 en plasma tienen una fuerte correlación con cualquiera de las dos mediciones independientes de la extensión de las lesiones ateroscleróticas, incluso después de ajustar por factores de riesgo convencionales. Además, las tres proteínas siguen estando significativamente asociadas al grosor de la placa cuando las tres se toman juntas en un modelo multivariante que incluye factores de riesgo. Este resultado significa que las tres proteínas están asociadas con la placa independientemente de cada una de ellas. Tabla 2.- Análisis de correlación de los niveles de PIGR, APOA y C5 en plasma con grosor medio de placa (medido mediante eco 2D) o con carga de placa (medido mediante eco 3D) en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS-10 años.
La tabla muestra cómo los niveles de PIGR, APOA y C5, tomados conjuntamente en un modelo multivariante, mantienen su correlación con la extensión de las lesiones ateroscleróticas, incluso en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS 10 años. Estos resultados indican que estas proteínas pueden rastrear de manera independiente y eficaz la presencia de lesiones de aterosclerosis en casos en los que no hay evidencia de riesgo cardiovascular según los factores de riesgo clásicos.
1.3.- Análisis de los niveles de proteína de PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 en capas media e íntima de aorta humana sin o con lesiones ateroscleróticas
Los datos mostrados en la figura 1 indican que todas las proteínas seleccionadas en plasma como potenciales marcadores de aterosclerosis subclínica, concretamente PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2, se acumulan en la capa media y principalmente en la capa íntima (placa), y que la acumulación es mayor a medida que la placa evoluciona desde el tipo de estría grasa al tipo de lesión fibrolipídica. Dicha acumulación puede explicar (o ser una consecuencia de) el aumento de los niveles plasmáticos en individuos con aterosclerosis subclínica.
1.4.- Análisis de la acción de los niveles plasmáticos de PIGR, APOA e ITIH1 (C5) como predictores independientes de aterosclerosis subclínica generalizada
Estos datos muestran que cada uno de los niveles de PIGR, APOA, ITIH1 y C5 en plasma es un predictor independiente de la aterosclerosis subclínica generalizada, incluso cuando se incluyen factores de riesgo conocidos en el modelo logístico. Además, PIGR, APOA e ITIH1, juntos, son también predictores independientes en presencia de una puntuación conocida de riesgos, tales como FHS-10 años, FHS-30 años, BEWAT o ICHS. Sin querer limitarse a la teoría, en el análisis de regresión se observa que C5 e ITIH1 presentan una fuerte covarianza, por lo que parecen ser dependientes. La covarianza observada sugeriría que C5 e IT1H1 pueden intercambiarse (si ITIH1 no se considera en el modelo multivariante, entonces C5 se comporta como un predictor independiente junto con PIGR y APOA y cualquiera de los factores de riesgo conocidos).
Tabla 4.- Análisis de regresión logística de los niveles de PIGR, APOA e ITIH1 en plasma como predictores de enfermedad generalizada en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS-10 años o FHS-30 años.
La tabla 4 muestra que PIGR, APOA e ITIH1 mantienen su capacidad de ser predictores independientes de enfermedad generalizada, incluso en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS-10 años. La tabla también muestra que PIGR e ITIH1 mantienen su capacidad de ser predictores independientes de enfermedad generalizada, incluso en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS-30 años. Estos resultados indican que estas proteínas pueden predecir de manera eficaz la presencia de lesiones de aterosclerosis en casos en los que no hay evidencia de riesgo cardiovascular según los factores de riesgo clásicos.
1.5.- Análisis de la asociación con aterosclerosis y del poder de predicción de la ateroesclerosis generalizada de los niveles de IGHA2 en plasma
Tabla 5.- Análisis de correlación de los niveles de IGHA1, IGHA2, IGHG1 e IGHG2 en plasma con grosor medio de placa (medido mediante eco 2D)
(Aumentado)
(Disminuido)
(Disminuido)
La tabla muestra que el grosor de placa se correlaciona con una mayor abundancia de IGHA2 (pero no de IGHA1) y con una menor abundancia de IGHG1 o IGHG2, independientemente de FHS 10 años. La correlación con IGHA2 se mantiene incluso en la subpoblación de individuos con bajo riesgo según FHS-10 años. La proporción IGHA2/IGHG1 tiene una correlación aún más fuerte que IGHA2 sola. La proporción IGHA2/promedio (IGHG1, IGHG2) es incluso mejor. Estos resultados sugieren que el grosor de placa se correlaciona con el cambio de isotipo de Ig.
La tabla muestra que el nivel de IGHA2 en plasma (corregido o no por otras Ig), pero no los de IGHA1, es un predictor independiente de aterosclerosis subclínica generalizada, incluso cuando se incluye la puntuación de riesgo FHS-10 años en el modelo logístico. Este efecto se mantiene en la población con bajo riesgo.
1.6.- Análisis de la acción de paneles de biomarcadores como predictores independientes de aterosclerosis subclínica generalizada
Tabla 7.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC, Receiver-operating curve) de varias puntuaciones de riesgos y factores de riesgo como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
La tabla muestra cómo las tres puntuaciones de riesgo, así como los factores de riesgo individuales, son capaces de producir una discriminación significativa estadísticamente entre individuos no enfermos y aquellos con enfermedad generalizada.
Tabla 8.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC) de PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
La tabla muestra que cada una de las proteínas individuales es capaz de producir una discriminación significativa estadísticamente entre individuos no enfermos y aquellos con enfermedad generalizada.
Tabla 9.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC) de varios paneles que contienen tres proteínas del grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2, como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
Cuando se compara con los datos de la tabla 7, esta tabla muestra que es posible utilizar combinaciones de tres proteínas que son capaces de discriminar entre individuos no enfermos y aquellos con enfermedad generalizada con una acción similar o mejor que la de las puntuaciones de riesgos ampliamente utilizadas.
Tabla 10.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC) de FHS-10 años sola o en combinación con diferentes paneles de proteínas, como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
La tabla muestra que la adición a FHS-10 años de paneles que contienen varias proteínas del grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produce una acción discriminatoria significativamente superior a la de FHS-10 años sola (tal como se deduce de los intervalos de confianza del 95 % de los valores AUC). Estos resultados indican que el panel de proteínas puede servir para mejorar significativamente la predicción de la aterosclerosis subclínica en comparación con los estándares actuales.
Tabla 11.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC) de ICHS sola o en combinación con diferentes paneles de proteínas, como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
La tabla muestra que la adición a ICHS de paneles que contienen varias proteínas del grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produce una acción discriminatoria significativamente superior a la de ICHS sola (tal como se deduce de los intervalos de confianza del 95 % de los valores AUC). Estos resultados indican que el panel de proteínas puede servir para mejorar significativamente la predicción de la aterosclerosis subclínica en comparación con los estándares actuales.
Tabla 12.- Análisis de curva operativa del receptor (ROC) de la puntuación de BEWAT sola o en combinación con diferentes paneles de proteínas, como predictores de enfermedad generalizada en la población de PESA (sin enfermedad frente a enfermedad generalizada).
La tabla muestra que la adición a la puntuación BEWAT de paneles que contienen varias proteínas del grupo PIGR, APOA, ITIH1, C5 e IGHA2 produce una acción discriminatoria significativamente superior a la de BEWAT sola (tal como se deduce de los intervalos de confianza del 95 % de los valores de AUC). Estos resultados indican que el panel de proteínas puede servir para mejorar significativamente la predicción de la aterosclerosis subclínica en comparación con los estándares actuales.
EJEMPLO 2.- Confirmación de la estabilidad de los cambios en la abundancia de proteína a lo largo del tiempo - cohorte PESA, visita 2 (PESA-v2) y validación del panel de biomarcadores obtenido mediante análisis inmunoturbidimétrico
2.1 Material y procedimientos
Muestras de plasma. Se recogieron muestras de plasma de la cohorte de estudio PESA (Fernández-Friera L et al., 2015) y de la cohorte AWHS. (Casasnovas JA et al., 2012) Para la fase de descubrimiento, se diseñó un estudio de casos y controles anidado dentro de la cohorte PESA prospectiva (PESA-V1). Para tener en cuenta los posibles elementos de confusión y aumentar la eficiencia, el estudio se restringió a hombres, y los controles se emparejaron por los factores de riesgo CV. En primer lugar, se seleccionaron 222 sujetos de caso entre los participantes con ateroesclerosis subclínica extensa, definidos como sujetos con 3 o más territorios vasculares afectados. Los sujetos de control se seleccionaron en una razón de 1:1 entre los participantes con aterosclerosis subclínica no extensa, definidos como sujetos con ninguno o 1 territorio vascular afectado. Los sujetos de control se emparejaron con los sujetos de caso en función de la edad (calibre: 3 años), la hipertensión, la dislipemia y la diabetes. También se recogieron muestras de plasma de los mismos individuos tres años después (PESA-V2), excepto dos casos y sus controles emparejados que no renovaron su consentimiento para el análisis “ómico”. El conjunto de validación se diseñó dentro de la cohorte AWHS siguiendo la misma metodología. Se realizó un estudio de casos y controles anidado, restringido a hombres y emparejado por edad, hipertensión, dislipemia y diabetes. Se seleccionaron 220 sujetos de caso entre los participantes con aterosclerosis subclínica extensa, definidos como sujetos con 3 o más territorios vasculares afectados. El mismo número de sujetos de control se seleccionaron entre los participantes de control con aterosclerosis subclínica no extensa, definidos como sujetos con 2 o menos territorios vasculares afectados.
Evaluación de factores de riesgo CV y ateroesclerosis subclínica. En el estudio de PESA, los factores de riesgo CV se recogieron de forma prospectiva mediante cuestionarios (tabaquismo, antecedentes familiares) o cuantificación objetiva (hipertensión, diabetes, dislipidemia), tal como se ha descrito previamente. (Fernández-Friera L et al., 2015) Se realizaron ecografía vascular bidimensional y tomografía computarizada cardiaca sin contraste en todos los participantes, tal como se ha descrito previamente. (Fernández-Friera L et al., 2015; Fernández-Friera L et al., 2017) La presencia de placas ateroscleróticas por ecografía se evaluó mediante exploración transversal de carótidas, aorta abdominal infrarrenal y arterias iliofemorales. La identificación de placas en ambas arterias carótidas y femorales y las características clínicas en el estudio de AWHS se determinaron tal como se ha descrito (Laclaustra M et al., 2016). Muestras de tejido. Las muestras de tejido aórtico de las capas media e íntima se obtuvieron de donantes de órganos fallecidos con la autorización de la Agencia Francesa de Biomedicina (PFS 09-007, BRIF BB-0033-00029; AoS BBMRI-EU/infraestructura BIOBANQUE; n.° de registro: 2, último: 15 de abril de 2014. [BlORESOURCE]). Algunas de estas muestras eran macroscópicamente normales (AoS) y carecían de lesiones ateromatosas tempranas y se utilizaron como controles sanos (9 individuos) para compararlas con aquellas con muestras con estrías grasas (FS) (7 individuos para la capa media y 6 en el caso de la capa íntima) o placas fibrolipídicas (FL) (11 individuos en el caso de la capa media y 12 en el caso de la capa íntima). El tejido (100 mg de FL, FS o AoS) se homogeneizó a baja temperatura y los lisados se resuspendieron en tampón (yodoacetamida 50 mM (Sigma), SDS al 1 %, EDTA 1 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,5) para la extracción de proteínas o en TRIZOL para el aislamiento de ARNm. Las proteínas se extrajeron agitando en vórtice las muestras 4 veces con intervalos de 15 minutos en hielo. Las proteínas en el sobrenadante se midieron mediante el procedimiento BCA y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis proteómico.
Análisis proteómico. Las muestras de proteína plasmática y tisular se sometieron a una digestión asistida por filtro con tripsina según las instrucciones del fabricante (Nanosep Centrifugal Devices con Omega Membrane-10K, PALL), y los péptidos resultantes se sometieron a un marcaje isobárico multiplexado con reactivos TMT (Thermo Fisher Scientific).(Baldan-Martin M et al, 2018; Bagwan N et al., 2018) Dos de los 10 canales se reservaron para muestras patrón de referencia interna creadas mediante la agrupación de las muestras. Los péptidos plasmáticos se separaron en cinco fracciones utilizando un kit de fraccionamiento de péptido de alto pH reversible (Thermo Fisher Scientific) y los péptidos tisulares se separaron en ocho fracciones utilizando cartuchos OASIS MCX. Cada fracción plasmática se analizó mediante LC-EM/EM utilizando un sistema HPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) acoplado mediante una fuente de iones de nanoelectropulverización (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) a un espectrómetro de masas Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania).(Bagwan N et al., 2018) Las fracciones tisulares se analizaron en un sistema de cromatografía líquida Easy nLC 1000 acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Themo Scientific). (Baldan-Martin M et al., 2018).
Análisis inmunoturbidimétrico. Los niveles plasmáticos de IGHA2, HPT y APOA se midieron mediante ensayos inmunoturbidimétricos (LK088.OPT, NK058.OPT y LK098.OPT, respectivamente) utilizando el analizador Binding Site Optilite. El análisis fue realizado de forma ciega por un técnico de la empresa The Binding Site.
Análisis estadístico. La identificación, cuantificación y análisis estadístico de los péptidos y de los sistemas biológicos se realizaron utilizando los modelos desarrollados en el laboratorio de los presentes inventores (Navarro P et al., 2014; Navarro P y Vazquez J, 2008; Jorge I et al., 2009; Garcia-Marques F et al., 2016; Bonzon-Kulichenko E et al., 2016; Martinez-Bartolome S et al., 2008). La información cuantitativa se extrajo de los espectros MS/MS de péptidos marcados con TMT. La cuantificación de los péptidos se analizó utilizando el modelo WSPP, que utiliza las
cuantificaciones en bruto como datos de entrada y calcula los cambios en múltiplos de log2 de la proteína para cada individuo con respecto al valor medio de las dos muestras de patrones internos de referencia. En este modelo, las proporciones de log2 de proteína se expresan como variables estandarizadas en unidades de desviación estándar según sus varianzas estimadas (valores Zq).
Se utilizaron modelos de regresión lineal y logística ajustados para analizar la asociación de proteínas con la presencia y la extensión de la aterosclerosis utilizando el software SPSS (IBM, Armonk, Nueva York). Se realizó un análisis multivariante para explorar las variables candidatas con una asociación clínica: glucosa, LdL, HDL, tensión arterial sistólica y diastólica, tabaquismo y edad. Las asociaciones se expresaron como razones de probabilidades (OR) con intervalos de confianza (IC) del 95 %. Las diferencias se consideraron significativas cuando un valor de p < 0,05 se consideró significativo estadísticamente. Se calculó el estadístico C o el área bajo la curva (a Uc ) característica operativa del receptor (ROC) para cada modelo como medida del poder discriminatorio de cada panel de biomarcadores de proteína. La comparación del índice C para los modelos que incluían y no incluían la información proporcionada por los paneles de biomarcadores se realizó según el procedimiento de DeLong (DeLong ER et al., 1988). Para evaluar si los paneles de biomarcadores ayudaron a clasificar correctamente a los individuos según la presencia y la extensión de la aterosclerosis subclínica, se calculó el índice de reclasificación neta categórica utilizando cuatro categorías de riesgo discretas (NRI0,25), y el índice de reclasificación neta sin categorías (NRC>0), también denominado índice de reclasificación neta continua (Kerr KF et al., 2014, Pepe MS et al., 2015; Leening MJ et al., 2014), que no depende de la elección arbitraria de categorías, sino que considera adecuado cualquier cambio en el riesgo previsto en la dirección correcta. En la subpoblación de bajo riesgo se evaluó si los paneles de biomarcadores ayudaban a clasificar a los individuos según la presencia de ateroesclerosis subclínica utilizando dos categorías de riesgo (riesgo/no riesgo) (NRI0,5).
Diseño del estudio
El presente informe examina una subcohorte del estudio de PESA. (Fernández-Ortiz A et al., 2013) La primera cohorte, utilizada para la fase de descubrimiento (PESA-V1), incluyó a 444 hombres con una edad media de 48,5 años, organizados en 222 pares de individuos sin historial clínico de aterosclerosis. Las características clínicas completas de la cohorte PESA-V1 se detallan en la tabla 13. Las muestras de plasma de PESA-V1 se analizaron mediante proteómica cuantitativa profunda.
Tabla 13.- Características de la población de PESA-V1 utilizada para la fase de descubrimiento
¡n a te ro sc le ro s is (n=222) A te ro s c le ro s is (n=222)
E d a d ( a ñ o s ) 48 ±4 49 ± 4
S B P ( m m H g ) 120 ± 12 124 ± 12
D B P ( m m H g ) 75 ± 9 77 ± 9
G l u c o s a e n a y u n a s ( m g / d l ) 94 ± 11 96 ± 15
C o l e s t e r o l T o t a l ( m g / d l ) 201 ± 33 210 ± 36
L D L - C ( m g / d l ) 136 ± 30 143 ± 33
H D L - C ( m g / d l ) 44 ± 10 43 ± 10
T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 106 ± 58 121 ± 65
F u m a n a c t u a l m e n t e 25% 41%
La estabilidad de los cambios detectados en la abundancia de proteínas a lo largo del tiempo se confirmó repitiendo el análisis proteómico con plasma recogido de los mismos individuos tres años después (PESA-V2) (excepto para los cuatro individuos que no renovaron su consentimiento para el análisis “ómico”); las características clínicas de los individuos de PESA-V2 se muestran en la tabla suplementaria 1. La proteómica cuantificó una media de 1093 proteínas por individuo y 454 proteínas pudieron ser cuantificadas en más del 80 % de los individuos. El análisis de las 884 muestras de plasma requirió un total de 560 series de LC-MS.
Tabla 14.- Características de la población de PESA-V2
Sin a te ro s c le ro s is (n=220) A te ro s c le ro s is (n=220)
E d a d ( a ñ o s ) 48 ± 4 49 ± 4
S B P ( m m H g ) 120 ± 12 124 ± 12
D B P ( m m H g ) 75 ± 10 77 ± 9
G l u c o s a e n a y u n a s ( m g / d l ) 92 ± 10 97 ± 21
C o l e s t e r o l T o t a l ( m g / d l ) 203 ± 33 209 ± 37
L D L - C ( m g / d l ) 137 ± 29 141 ± 34
H D L - C ( m g / d l ) 46 ± 11 44 ± 10
T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 102 ± 50 121 ± 65
Sin a te ro s c le ro s is (n=220) A te ro s c le ro s is (n=220) Fuman actualmente 21% 34%
Los valores son media ± DE o %
Para la fase de validación, se examinó una tercera cohorte de 350 hombres del estudio de salud de los trabajadores de Aragón. Esta cohorte tenía una edad media de 50,3 años y se organizó en 175 pares de individuos sin antecedentes de enfermedad CV clínica y con características clínicas similares a las de la subcohorte PESA (tabla 15). (Casasnovas JA et al., 2012; Laclaustra M et al., 2016) Las muestras de plasma de la cohorte AWHS se analizaron mediante turbidimetría utilizando anticuerpos disponibles en el mercado contra proteínas seleccionadas.
Tabla 15.- Características de la población de AWHS utilizada en la fase de validación
Sin a te ro s c le ro s is (n=175) A te ro s c le ro s is (n=175)
Edad (años) 49,6 ± 4,1 51,0 ± 3,6
SBP (mmHg) 122,1 ± 12,0 125,8 ± 13,9
DBP (mmHg) 81,4 ± 8,7 82,5 ± 8,8
Glucosa en ayunas (mg/dl) 98,2 ± 17,9 98.3 ± 17 ,2
Colesterol Total (mg/dl) 215,4 ± 35,5 221,6 ± 37,3
HDL-C (mg/dl) 54,0 ± 11 ,1 50.4 ± 10,4
Fuman actualmente 17% 44%
Los valores son media ± DE o %
2.1 Asociación de proteínas plasmáticas con factores de riesgo tradicionales
Se construyó una red de correlaciones que incluía las proteínas cuyos niveles estaban correlacionados significativamente con los factores de riesgo CV continuos tradicionales en los conjuntos de muestras de PESA-V1 y PESA-V2; los factores de riesgo CV considerados fueron la glucosa, la edad, la tensión arterial diastólica y sistólica, el colesterol, las LDL y las HDL (figura 2). La mayoría de las correlaciones fueron de apolipoproteínas y otras proteínas implicadas en el transporte de lípidos, que mostraron una correlación positiva con LDL, HDL y colesterol. Aparte de estas asociaciones esperadas, no hubo patrones claros de asociación con otros factores, lo que sugiere que en la fase subclínica los factores de riesgo CV tradicionales tienen un impacto limitado en el proteoma plasmático.
2.2 Asociación de proteínas plasmáticas con grosor de placa y puntuación de calcio
La asociación entre los niveles de proteínas plasmáticas y el grosor de placa se evaluó mediante un análisis de regresión lineal univariante corregido por una prueba de hipótesis múltiple. Este análisis reveló una lista de proteínas plasmáticas que mostraban una correlación significativa (FDR < 5 %) con el grosor de placa en PESA-V1 (tabla 16). La mayoría de las proteínas mantuvieron la correlación con el grosor de placa con una FDR inferior al 15 % en el seguimiento de 3 años (PESA-V2) (tabla 16). La mayoría de estas proteínas estaban relacionadas con la respuesta inmunitaria humoral, incluyendo el receptor de inmunoglobulina polimérico (PIGR) e IGHA2, que estaban aumentados, y la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 2 (IGHG2), la región constante de inmunoglobulina kappa (IGKC), la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 (IGHG1) y la región constante de inmunoglobulina lambda 2 (IGLC2), que estaban disminuidos. La HPT, la proteína de unión a C4 (C4BP), el cofactor de heparina 2 (HEP2), ApOa , el componente del complemento 9 (CO9) y la gelsolina (GELS) también mantuvieron su correlación con el grosor de placa tres años después (tabla 16). También se observó que los niveles de la proteína de adhesión vascular 1 (VCAM1) y el factor von Willebrand (VWF), dos proteínas que se consideran que son biomarcadoras de la disfunción endotelial, disminuyeron con el grosor de placa en PESA-V1 (tabla 16). Aunque esta tendencia fue contraria a la esperada, esta observación no se reprodujo en PESA-V2.
Tabla 16.- Proteínas que muestran correlación significativa con el grosor de placa. Se realizó un análisis de regresión lineal para medir la correlación entre el grosor de placa y los niveles de proteínas plasmáticas en PESA-V1 y PESA-V2. La significación estadística del coeficiente de correlación de Pearson se expresó en relación a la tasa de falsos descubrimientos (FDR, false discovery rate). Se enumeran las proteínas que tienen una correlación significativa en V1 (FDR < 5 %) y en V2 (FDR < 15 %).
En general, las correlaciones con el grosor de placa en PESA-V1 se reprodujeron en PESA-V2 (figura 3A). Curiosamente, las proteínas relacionadas con la respuesta inmunitaria humoral estaban entre las que mejor mantuvieron en V2 la correlación observada en V1 (figura 3A). La asociación opuesta con el grosor de placa de IGHA2 y la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina delta (IGHD) en comparación con la de IGLC2, IGKC, IGHG1 e IGHG2, junto con la falta de correlación para los isotipos relacionados con la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina alfa 1 (IGHA1) y la región constante de cadena pesada de las inmunoglobulinas gamma 3 y 4 (IGHG3 e IGHG34, respectivamente), sugirieron que la formación de placa está asociada con un cambio de isotipo.
Entre las proteínas que se correlacionaron con el grosor de placa, se juzgó que IGHA2, PIGR, HEP2, HPT, APOA, GELS, IGKC, IGLC2 e IGHG1 fueron las proteínas que mejor mantuvieron la correlación tanto en PESA-V1 como en V2 después del ajuste por factores de riesgo individuales utilizando el análisis de regresión lineal multivariante (tabla 17).
Tabla 17.- Correlación de niveles de proteínas plasmáticas con el grosor de placa. Se realizó un análisis de regresión lineal bivariante para medir la correlación entre el grosor de placa y los niveles de las proteínas plasmáticas indicadas en las cohortes PESA-V1 y PESA-V2 después del ajuste por cada uno de los factores de riesgo conocidos. La significación estadística del coeficiente de correlación de Pearson se expresó en relación al valor de p.
Dado que estos resultados se obtuvieron tras el análisis de un gran número de proteínas mediante proteómica, se estudió si algunos de ellos podían reproducirse utilizando otros enfoques. El análisis mediante turbidimetría de los niveles plasmáticos de dos proteínas representativas (IGHA2 y APOA) para las que existían anticuerpos disponibles en el mercado confirmó su correlación independiente con el grosor de placa (tabla 18).
Tabla 18.- Validación de algunos resultados proteómicos mediante enfoques basados en anticuerpos. Los niveles plasmáticos de IGHA2 y APOA se midieron mediante turbidimetría. Se realizó un análisis de regresión lineal bivariante para medir la correlación entre el grosor de placa y los niveles de proteína en la cohorte PESA-V1 después de ajustar por cada uno de los factores de riesgo conocidos. La significación estadística del coeficiente de correlación de Pearson se expresó en relación al valor de p.
Se realizó un análisis similar con las proteínas que se correlacionaban con la puntuación de calcio arterial coronario (CACS, coronay artery calcium score). Algunas de las proteínas asociadas al grosor de placa, incluyendo HPT, APOA y GELS, también mostraron una correlación significativa con la CACS en PESA-V1 que se mantuvo en V2 (tabla 19 y la figura 3B).
Tabla 19.- Proteínas que muestran una correlación significativa con la puntuación de calcio arterial coronario. Se realizó un análisis de regresión lineal para medir la correlación entre los niveles de CACS y de proteínas plasmáticas en PESA-V1 y PESA-V2. La significación estadística del coeficiente de correlación de Pearson se expresó en relación a la tasa de falsos descubrimientos (FDR). Se enumeran las proteínas que tienen una correlación significativa en V1 (FDR < 5 %) y en V2 (FDR < 15 %).
Sin embargo, entre las proteínas relacionadas con la respuesta inmunitaria humoral, sólo IGKC mantuvo su correlación con la CACS (tabla 19 y figura 3B). El factor del complemento B (CFB), la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina mu (IGHM) y la proteína similar al antígeno CD5 (CD5L) fueron otras proteínas que se correlacionaron con la CACS, pero no con el grosor de placa. Entre las proteínas que se correlacionan con la CACS, HPT, APOA, GELS, CD5L e IGKC fueron las que mejor mantuvieron la correlación tanto en PESA-V1 como en V2 después del ajuste por factores de riesgo (tabla 20).
Tabla 20.- Correlación de niveles de proteínas plasmáticas con la puntuación de calcio. Se realizó un análisis de regresión lineal bivariante para medir la correlación entre la Ca Cs y los niveles de las proteínas plasmáticas indicadas en las cohortes PESA-V1 y PESA-V2 después del ajuste por cada uno de los factores de riesgo conocidos. La significación estadística del coeficiente de correlación de Pearson se expresó en relación al valor de p.
También se analizó el comportamiento de proteínas de fase aguda representativas (incluyendo la proteína C reactiva (CRP, C-reactive protein), proteína amiloidea A-1 sérica (SAA1, serum amyloid A-1) y glicoproteína 1 alfa-1 ácida (ORM1)) y de otras proteínas que se han descrito previamente como asociadas a la aterosclerosis subclínica (tabla 21). Mientras que la CRP se correlacionó con el grosor de placa en PESA-V2, ninguna de las proteínas de fase aguda mantuvo una correlación estable en las dos visitas de PESA. Entre las proteínas que anteriormente se propuso que estaban asociadas con la aterosclerosis subclínica, (Saarikoski LA et al., 2010; Bhosale SD et al., 2018) la cadherina-13 (CDH13) mostró una correlación significativa con el grosor de placa en PESA-V1, pero el resultado no se confirmó en PESA-V2. No se detectaron asociaciones con CACS en ninguna de las dos visitas.
Tabla 21.- Correlación con el grosor de placa y puntuación de calcio de proteínas de fase aguda representativas y roteínas descritas como asociadas con aterosclerosis subclínica
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2.3 La asociación entre alteraciones de proteínas plasmáticas y aterosclerosis subclínica es independiente de las puntuaciones de riesgos
Se llevó a cabo un análisis de regresión logística para determinar el efecto de los niveles de proteínas plasmáticas sobre la probabilidad de que los participantes tuvieran una enfermedad aterosclerótica subclínica. El aumento de los niveles plasmáticos de PlGR, IGHA2, APOA, HPT y HEP2 estaba asociado significativamente con una mayor probabilidad de enfermedad y las asociaciones siguieron siendo significativas después del ajuste por la puntuación de FHS-10 años (tabla 22 y figura 4). La disminución de los niveles de IGHG1 también estaba asociada con la enfermedad después del ajuste por la puntuación de FHS-10 años (tabla 22). CD5L no estaba asociado significativamente, y GELS e IGKC perdieron su asociación con la aterosclerosis subclínica después del ajuste por la puntuación de FHS-10 años (tabla 22).
Tabla 22.- Análisis de regresión logística de asociación con la presencia de aterosclerosis subclínica. Las razones de probabilidades se refieren a los valores relativos de proteína determinados medianter proteómica y expresados en unidades de desviación estándar, utilizando modelos de regresión logística univariante (univariante) o bivariante ajustados por la puntuación de FHS-10 años (aj. por F10 años).
Para seleccionar un panel de biomarcadores, se probaron varias combinaciones de proteínas utilizando modelos de regresión logística multivariante. IGHG1 no alcanzó significación estadística cuando se incluyeron otras proteínas en el mismo panel, mientras que PIGR, IGHA2, APOA, HPT y HEP2 podían combinarse para formar varios paneles de tres proteínas, en los que PIGR podía sustituirse por IGHA2 y HEP2 por HPT (tabla 23). La asociación individual de estas cinco proteínas con la aterosclerosis subclínica siguió siendo significativa después del ajuste por las puntuaciones de riesgos BEWAT o ICHS (figura 4).
Tabla 23.- Modelos de regresión logística multivariante para la predicción de aterosclerosis subclínica en PESA-V1. Se utilizaron modelos de regresión logística multivariante para determinar la asociación de los valores de proteína con la presencia de aterosclerosis subclínica.
2.4 Las proteínas plasmáticas que están asociadas con la aterosclerosis subclínica se acumulan en las lesiones ateroscleróticas tempranas
Se determinó la abundancia de las cinco proteínas seleccionadas en las capas media e íntima de las lesiones tempranas de ateroesclerosis humana (estrías grasas y placas fibrolipídicas). El análisis proteómico cuantitativo reveló abundancias absolutas notablemente elevadas de PIGR, IGHA2, APOA, HPT y HEP2 en la capa íntima en relación con la capa media (figura 5). La acumulación de estas cinco proteínas en la capa íntima aumentaba aún más a medida que las lesiones progresaban desde la estría grasa hasta el estadio fibrolipídico (figura 5). Por tanto, las cinco proteínas que están asociadas con la aterosclerosis subclínica en el plasma también se acumulan en las lesiones ateroscleróticas en las fases iniciales de formación de la placa.
2.5 Validación en una cohorte del estudio de salud de los trabajadores de Aragón (AWHS)
Para la fase de validación, se seleccionó el panel que se componía de IGHA2, APOA y HPT, ya que estas proteínas podían medirse utilizando los kits basados en anticuerpos disponibles en el mercado utilizados en la clínica. El estudio de validación se realizó con un conjunto de 350 muestras de plasma obtenidas de la cohorte AWHS. El análisis de regresión logística multivariante reveló que el aumento de la concentración en plasma de cada una de las tres proteínas estaba asociado significativamente con una mayor probabilidad de aterosclerosis subclínica (figura 6A). Esta tendencia se mantuvo después de ajustar por cualquiera de las tres puntuaciones de riesgos, lo que indica que los niveles de estas proteínas estaban asociados independientemente con la aterosclerosis subclínica en la población del AWHS (figuras 6B-D).
2.6 Valor predictivo del panel de biomarcadores de proteínas
La capacidad de las tres proteínas, incluidas como panel de biomarcadores, para mejorar la predicción de la aterosclerosis subclínica solamente mediante las puntuaciones de riesgos se evaluó mediante un análisis de curva característica operativa del receptor (ROC). En la cohorte PESA-V1, un panel que se componía de las tres proteínas y puntuación de FHS-10 años produjeron un AUC (0,76:0,71-0,81 IC del 95 %) significativamente mejor que la puntuación de FHS-10 años sola (0,71:0,66-0,77, p < 0,05, prueba de DeLong) (figura 7A). El NRI categórico y continuo producido por el panel de proteínas fue NRI0,25 = 7 % y NRI>0 = 40 %, respectivamente (tabla 24). El panel de proteínas también mejoró la predicción de la enfermedad en la cohorte AWHS (AUC = 0,72:0,66-0,77 frente a 0,61:0,54-0,69, p < 0,01) (figura 7A), produciendo NRI0,25 = 29 % y NRI>0 = 51 %. El panel de biomarcadores también mejoró significativamente las AUC para la puntuación BEWAT (figura 7B) y la puntuación ICHS (figura 7C), con NRI superiores al 16 % y alcanzando el 64 % en algunos casos (tabla 24), en ambas poblaciones. Las AUC también mejoraron significativamente con algunas combinaciones de sólo dos proteínas, por ejemplo, IGHA2 y HPT o APOA y HPT (figura 7 y tabla 24).
Tabla 24.- Índices de reclasificación neta de los paneles de biomarcadores de proteína. Se enumeran los índices de reclasificación neta categórico (NRI0,25) y continuo (NRI>0) para evaluar la mejora en la acción para clasificar correctamente a los individuos según la presencia y la extensión de la aterosclerosis subclínica respecto al conseguido solamente con las puntuaciones de riesgos (FHS-10 años, BEWAT o ICHS). Para calcular el NRI0,25 los individuos se clasificaron en cuatro categorías de riesgo discretas.
Para evaluar si estas proteínas proporcionan información útil sobre individuos con bajo riesgo de acontecimientos CV según las puntuaciones de riesgos, se seleccionó una subpoblación de participantes con una puntuación de FHS-10 años < 0,1 (Fernandez-Friera L et al., 2015; Pencina MJ et al., 2009; Ford ES et al., 2004). En esta subpoblación, el panel de biomarcadores de 3 proteínas predijo de manera eficaz la enfermedad subclínica en PESA-V1 (a Uc = 0,62:0,56-0,68, p < 0,001 frente a AUC = 0,5) (figura 8 izquierda), produciendo NRI del 5-8 % (tabla 25). El panel de 3 proteínas también predijo la enfermedad en la subpoblación de AWHS (AUC = 0,68:0,6-0,76, p < 0,0001 frente a AUC = 0,5) (figura 8 derecha), con NRI que oscilaban entre el 10 y el 36 % (tabla 25). La aterosclerosis subclínica en ambas poblaciones se predijo de manera eficaz mediante algunas combinaciones de sólo 2 proteínas (figura 8).
Tabla 25.- Índices de reclasificación neta de los paneles de biomarcadores de proteína en la población de bajo riesgo. Se enumeran los índices de reclasificación neta categóricos (NRI0,5) para evaluar la mejora en la acción para clasificar correctamente a los individuos según la presencia y la extensión de la aterosclerosis subclínica en las subpoblaciones de bajo riesgo (puntuación de FHS-10 años < 0,1). Se utilizaron dos categorías discretas (riesgo/sin riesgo) para calcular el NRI0,5.
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Claims (15)
1. Procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de aterosclerosis subclínica, preferentemente, aterosclerosis subclínica generalizada, en un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende:
a) determinar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto los niveles de expresión de proteína de: i. PIGR y/o IGHA2; y
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro o cinco biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5;
b) comparar los niveles de los biomarcadores con un valor de referencia;
c) en el que cuando los niveles en la muestra del sujeto de PIGR y/o IGHA2, y opcionalmente APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y/o C5, están aumentados con respecto al valor de referencia correspondiente es indicativo de aterosclerosis subclínica.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende determinar los niveles de expresión de proteína de PIGR y/o IGHA2; y uno, dos, tres, cuatro o cinco biomarcadores seleccionados entre la lista que consiste en APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5.
3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa a) comprende determinar los niveles de expresión de proteína de una pluralidad de biomarcadores seleccionados entre el grupo que consiste en:
a. PIGR y/o IGHA2, y APOA;
b. PIGR y/o IGHA2, y HPT;
c. PIGR y/o IGHA2, y HEP2;
d. PIGR y/o IGHA2, y C5;
e. PIGR y/o IGHA2, e ITIH1;
f. PIGR y/o IGHA2, APOA y HPT;
g. PIGR y/o IGHA2, APOA y HEP2;
h. PIGR y/o IGHA2, APOA y C5;
i. PIGR y/o IGHA2, APOA e ITIH1;
j. PIGR y/o IGHA2, HPT y HEP2;
k. PIGR y/o IGHA2, HPT y C5;
l. PIGR y/o IGHA2, HPT e ITIH1;
m. PIGR y/o IGHA2, HEP2 y C5;
n. PIGR y/o IGHA2, HEP2 e ITIH1;
o. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT y C5;
p. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT e ITIH1;
q. PIGR y/o IGHA2, APOA, HEP2 y C5;
r. PIGR y/o IGHA2, APOA, HEP2 e ITIH1;
s. PIGR y/o IGHA2, HPT, HEP2 y C5;
t. PIGR y/o IGHA2, HPT, HEP2 e ITIH1; y
u. PIGR y/o IGHA2, APOA, HPT y HEP2.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho procedimiento comprende, además, determinar en dicha muestra biológica los niveles de expresión de proteína de IGHG1; en el que cuando los niveles de IGHG1 en la muestra del sujeto están disminuidos con respecto a un valor de referencia es indicativo de aterosclerosis subclínica.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los niveles de IGHA2 son niveles relativos con respecto a cualquiera de IGHA1, IGHG1, IGHG2 o una combinación de los mismos, preferentemente, en el que los niveles de IGHA2 son niveles relativos con respecto a IGHA1 o con respecto a los niveles promedio de IGHG1 e IGHG2.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho procedimiento comprende, además, llevar a cabo una puntuación de riesgo cardiovascular tradicional, preferentemente, en el que dicha puntuación de riesgo cardiovascular tradicional se selecciona entre el grupo que consiste en FHS-10 años, FHS-30 años, ICHS y las puntuaciones BEWAT, más preferentemente, en el que dicha puntuación de riesgo cardiovascular es FHS-10 años.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho procedimiento es un procedimiento para el cribado y/o el diagnóstico de aterosclerosis subclínica en un sujeto clasificado como de bajo riesgo cuando se lleva a cabo una puntuación de riesgo cardiovascular tradicional.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biológica aislada del sujeto es una muestra de suero, sangre o plasma, preferentemente, es una muestra de suero.
9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sujeto es un sujeto humano.
10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas b) y/o c) se implementan mediante un ordenador.
11. Aparato de procesamiento de datos, que comprende medios adaptados para llevar a cabo las etapas de un procedimiento según la reivindicación 10.
12. Programa informático, que comprende instrucciones que, cuando el programa se ejecuta mediante un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo las etapas del procedimiento según la reivindicación 10.
13. Medio de almacenamiento legible por ordenador, que tiene almacenado en el mismo un programa informático según la reivindicación 12.
14. Utilización de un kit en un procedimiento para el cribado, el diagnóstico y/o la monitorización de un sujeto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho kit comprende:
a. un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de PIGR y/o IGHA2; y
b. opcionalmente, un reactivo para determinar los niveles de expresión de proteína de uno, dos, tres, cuatro o cinco de APOA, HPT, HEP2, ITIH1 o C5;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
15. Utilización de un kit, según la reivindicación 14, comprendiendo el kit reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de proteína de los siguientes biomarcadores:
i. PIGR y/o IGHA2;
ii. opcionalmente, uno, dos, tres, cuatro o cinco biomarcadores seleccionados entre APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5;
en el que dicho kit comprende:
a. un reactivo de afinidad para PIGR y/o IGHA2;
b. opcionalmente, un reactivo de afinidad para uno, dos, tres, cuatro o cinco de APOA, HPT, HEP2, ITIH1 y C5;
c. opcionalmente, que comprende, además, instrucciones para la utilización de dichos reactivos para determinar dichos niveles de expresión de proteína en una muestra biológica aislada de un sujeto.
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|---|---|---|---|
| EP18382778 | 2018-10-31 | ||
| EP19382594 | 2019-07-12 | ||
| PCT/EP2019/079623 WO2020089282A1 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-30 | Biomarkers of subclinical atherosclerosis |
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