CN103954565B - 一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，属于材料化学技术领域。本发明包括纳米金二聚体的组装、纳米金的表面修饰、纳米金与细胞共同孵育、细胞内手性信号的表征等步骤。本发明选择金纳米粒子作为激元，将其组装成二聚体后，对其表面进行改性修饰，使其能够快速的进入细胞内部，然后对其进行圆二色谱的表征。本发明提供了能够高效进入细胞内的纳米金二聚体的制备方法，得到了结构均一，在细胞内有良好的分散性，且手性信号稳定的纳米金二聚体。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
金纳米粒子作为一种基本的纳米材料，具有独特的物理、化学性质。通过自组装的方式使其形成二聚体结构，一方面由于二聚体的不对称结构，另一方面由于纳米粒子表面的等离子体共振与手性配体偶极之间的耦合，使得这种二聚体组装体能够在体外可见光区表现出强烈的圆二色性。细胞是生命的基本结构和功能单位，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。将金纳米材料以二聚体的形式导入细胞，可以有效利用圆二色光谱超灵敏的信号放大作用对细胞内的生命活动进行探究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法。
本发明的技术方案，一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，步骤为：
（1）纳米金二聚体的组装：利用柠檬酸还原法得到金纳米粒子，将其分别与硫代磷酸化修饰的巯基DNA1、DNA2及DNA3偶联形成Au-DNA1复合体、Au-DNA2复合体及Au-DNA3复合体；将复合体Au-DNA1和Au-DNA2混合，形成纳米金二聚体溶胶结构，并对此结构进行表征；
（2）纳米金的表面修饰：将巯基修饰的聚乙二醇PEG5000和穿膜肽TAT同时加入到步骤（1）中得到的纳米金二聚体溶胶及Au-DNA3复合体溶液中，偶联24h后分别得到表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子；
（3）纳米金与细胞共同孵育：将步骤（2）中得到的纳米金二聚体及金纳米粒子分别与一定数量的细胞共同培养一段时间后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有纳米金二聚体的细胞悬液及细胞内含有金纳米粒子的细胞悬液；
（4）细胞内手性信号的表征：对步骤（3）中得到的细胞悬液进行生物电镜表征和圆二色性表征。
所述基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，具体步骤如下：
（1）纳米金二聚体的组装：取200mL、2nM、20nm的金纳米粒子8000rpm离心10min，并重悬在20mL0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS中，得纳米金重悬液；
取5mL纳米金重悬液并按金纳米粒子︰DNA摩尔浓度比为1︰5向溶液中加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA1进行偶联，室温静置24h后得到Au-DNA1复合体；另取5mL纳米金重悬液按同样的摩尔比加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA2，室温静置24h后得到Au-DNA2复合体；按同样的摩尔比把硫代磷酸化修饰的巯基DNA3加入到余下的10mL纳米金重悬液中，得到Au-DNA3复合体溶胶；
将Au-DNA1和Au-DNA2复合体等体积混匀，80℃孵育5min，室温冷却并静置12h，得到纳米金二聚体溶胶；
（2）纳米金表面修饰：将巯基修饰的PEG5000和TAT按金纳米粒子︰PEG︰TAT摩尔比为1︰1000︰100同时加入步骤（1）制备的纳米金二聚体溶胶和Au-DNA3复合体溶胶中；室温震荡24h后，8000rpm离心10min，沉淀重悬于超纯水中，分到得到表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子；
（3）纳米金与细胞的共同孵育：将步骤（2）中得到的表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子分别以8000rpm离心10min，沉淀重悬于细胞培养液中，使纳米金二聚体及金纳米粒子的终浓度都为5nM；将细胞接种于24孔培养板的两个孔中，每个孔中的细胞数量控制为104个，培养24h后去掉培养液；向其中一个孔加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液300μL，另一个加入300μL含有金纳米粒子的细胞培养液，分别孵育2h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次，将洗涤后的细胞用0.25%胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心10min，沉淀重悬于50μLPBS中，分别得到细胞内含有纳米金二聚体的细胞悬液及细胞内含有金纳米粒子的细胞悬液；
（4）细胞内二聚体的表征：采用生物透射电镜和圆二色谱法对步骤（3）中得到的细胞悬液进行表征。
所述DNA1序列如SEQIDNO.1所示，DNA2序列如SEQIDNO.2所示，DNA3序列如SEQIDNO.3所示，TAT多肽序列如SEQIDNO.4所示。具体如表1。
表1DNA及多肽的编号、序列及长度
| 编号 | 序列(5’-3’) | 长度 |
| DNA1 | CAATAGCCCT TGGATAAAAA AAAAA-SH | 25 |
| DNA2 | ATCCAAGGGC TATTGAAAAA AAAAA-SH | 25 |
| DNA3 | AAAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAA-SH | 25 |
| TAT | YGRKKRRQRR RC | 12 |
本发明的有益效果：本发明提供了能够高效进入细胞内的纳米金二聚体的制备方法，得到了结构均一，在细胞内有良好的分散性，且手性信号稳定的纳米金二聚体，构建了细胞内金纳米二聚体的等离子手性平台。
附图说明
图1纳米金二聚体在细胞中的生物透射电镜图。
图2金纳米粒子在细胞中的生物透射电镜图。
图3纳米金二聚体及金纳米粒子细胞悬液紫外-可见光吸收谱图，1、纳米金二聚体，2、金纳米粒子。
图4纳米金二聚体及金纳米粒子的细胞悬液圆二色谱图，1、纳米金二聚体，2、金纳米粒子。
具体实施方式
实施例1
所有的玻璃仪器都用王水浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2MΩ的Milli-Q超纯水。
本发明所使用的DNA和多肽均购自中国上海生工生物工程有限公司。
（1）纳米金二聚体的组装：取200mL2nM20nm左右的金纳米粒子8000rpm离心10min，并重悬在20mL0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）。取出5mL并按纳米粒子︰DNA为1︰5的摩尔浓度比向溶液中加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA1进行偶联，室温静置24h后得到Au-DNA1复合体。另取5mL按同样的摩尔比加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA2，室温静置24h后得到Au-DNA2复合体。按同样的摩尔浓度比把硫代磷酸化修饰的巯基DNA3加入到余下的10mL纳米金重悬液中，得到Au-DNA3复合体。将Au-DNA1和Au-DNA2等体积混匀，80℃孵育5min，室温冷却并静置12h，得到纳米金二聚体。
（2）纳米金的表面修饰：将巯基修饰的PEG5000和TAT按金纳米粒子︰PEG︰TAT为1︰1000︰100的摩尔比同时加入上述获得的纳米金二聚体溶胶及Au-DNA3复合体溶胶中，迅速混匀。室温震荡24h后，分别8000rpm离心10min，沉淀重悬于超纯水中，反复离心重悬3次，分别得到表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子。
（3）纳米金与细胞共同孵育：
将上述表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子分别8000rpm离心10min，沉淀重悬于含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中，使纳米金二聚体及金纳米粒子的终浓度均为5nM。将人子宫颈癌细胞接种于24孔培养板中，取其中2个孔使每孔中的细胞数量约为104个，培养24h后去掉培养液，向其中一个孔加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液300μL，另一个孔中加入300μL上述含有金纳米粒子的细胞培养液。分别孵育2h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次。将洗涤后的细胞用0.25%胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心10min，沉淀重悬于50μLPBS中，分别得到细胞内含有纳米金二聚体的细胞悬液及细胞内含有金纳米粒子的细胞悬液。
（4）细胞内纳米金的表征：
电镜表征：分别取上述获得的细胞悬液分别用戊二醛固定、锇酸固定、丙酮包埋、烘干并切片、染色。透射电镜采用JEOLJEM-2100型号的电镜，其加速电压为80kV。
圆二色谱表征：分别取50μL的上述样品加入到比色皿中，25℃下依次在紫外-可见光谱仪和圆二色谱仪上测定其信号。
SEQIDNO.1
DNA1：
CAATAGCCCTTGGATAAAAAAAAAA-SH
SEQIDNO.2
DNA2
ATCCAAGGGCTATTGAAAAAAAAAA-SH
SEQIDNO.3
DNA3
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH
SEQIDNO.4
TAT（RNA多肽序列）
YGRKKRRQRRRC
Claims (3)
1.一种基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，其特征在于步骤为：
（1）纳米金二聚体的组装：利用柠檬酸还原法得到金纳米粒子，将其分别与硫代磷酸化修饰的巯基DNA1、DNA2及DNA3偶联形成Au-DNA1复合体、Au-DNA2复合体及Au-DNA3复合体；将复合体Au-DNA1和Au-DNA2混合，形成纳米金二聚体溶胶结构，并对此结构进行表征；
（2）纳米金的表面修饰：将巯基修饰的聚乙二醇PEG5000和穿膜肽TAT同时加入到步骤（1）中得到的纳米金二聚体溶胶及Au-DNA3复合体溶液中，偶联24h后分别得到表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子；
（3）纳米金与细胞共同孵育：将步骤（2）中得到的纳米金二聚体及金纳米粒子分别与一定数量的细胞共同培养一段时间后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有纳米金二聚体的细胞悬液及细胞内含有金纳米粒子的细胞悬液；
（4）细胞内手性信号的表征：分别取上述步骤（3）中得到的细胞悬液进行生物电镜表征和圆二色性表征。
2.根据权利要求1所述基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）纳米金二聚体的组装：取200mL、2nM、20nm的金纳米粒子8000rpm离心10min，并重悬在20mL0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS中，得纳米金重悬液；
取5mL纳米金重悬液并按金纳米粒子︰DNA摩尔浓度比为1︰5向溶液中加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA1进行偶联，室温静置24h后得到Au-DNA1复合体；另取5mL纳米金重悬液按同样的摩尔比加入硫代磷酸化修饰的巯基DNA2，室温静置24h后得到Au-DNA2复合体；按同样的摩尔比把硫代磷酸化修饰的巯基DNA3加入到余下的10mL纳米金重悬液中，得到Au-DNA3复合体溶胶；
将Au-DNA1和Au-DNA2复合体等体积混匀，80℃孵育5min，室温冷却并静置12h，得到纳米金二聚体溶胶；
（2）纳米金表面修饰：将巯基修饰的PEG5000和TAT按金纳米粒子︰PEG︰TAT摩尔比为1︰1000︰100同时加入步骤（1）制备的纳米金二聚体溶胶及Au-DNA3复合体溶胶中；室温震荡24h后，8000rpm离心10min，沉淀重悬于超纯水中，分别得到表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子；
（3）纳米金与细胞的共同孵育：将步骤（2）中得到的表面修饰的纳米金二聚体及表面修饰的金纳米粒子分别以8000rpm离心10min，沉淀重悬于细胞培养液中，使纳米金二聚体及金纳米粒子的终浓度都为5nM；将细胞接种于24孔培养板的两个孔中，每个孔中的细胞数量控制为104个，培养24h后去掉培养液；向其中一个孔加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液300μL，另一个加入300μL含有金纳米粒子的细胞培养液，分别孵育2h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次，将洗涤后的细胞用0.25%胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心10min，沉淀重悬于50μLPBS中，分别得到细胞内含有纳米金二聚体的细胞悬液及细胞内含有金纳米粒子的细胞悬液；
（4）细胞内二聚体的表征：采用生物透射电镜和圆二色谱法，分别取上述步骤（3）中得到的细胞悬液进行表征。
3.根据权利要求1所述基于离散型金纳米二聚体的细胞内等离子手性平台的构建方法，其特征在于：所述DNA1序列如SEQIDNO.1所示，DNA2序列如SEQIDNO.2所示，DNA3序列如SEQIDNO.3所示，TAT多肽序列如SEQIDNO.4所示。
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