CN103951734A - 边界病病毒重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒 - Google Patents

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CN103951734A CN201410161997.9A CN201410161997A CN103951734A CN 103951734 A CN103951734 A CN 103951734A CN 201410161997 A CN201410161997 A CN 201410161997A CN 103951734 A CN103951734 A CN 103951734A
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杨蕾蕾
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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种边界病病毒（BDV）重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒。系将BDVE2蛋白主要抗原区域克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经重组大肠杆菌表达纯化后获得重组BDVE2蛋白，Westernblot试验证明该蛋白具有良好的抗原性。将该蛋白包被酶标板，通过抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、二抗浓度和作用时间以及显色时间的优化建立ELISA方法，检测山羊BDV阴性血清确定临界值和判定标准。本发明构建的重组菌株对外源蛋白表达稳定，抗原性好；在此基础上首次用于建立边界病病毒IgG抗体ELISA检测方法。

Description

边界病病毒重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种边界病病毒重组E2蛋白和边界病病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒。
背景技术
大肠杆菌表达系统是目前比较成熟的表达系统，具有操作简单，安全无毒，外源蛋白表达量高等优点，已经成功用于多种蛋白的生产。E2蛋白是边界病病毒（Border disease virus，BDV）的主要囊膜蛋白，介导病毒感染入胞和保护性免疫反应，是BDV主要的免疫保护性抗原。目前国际普遍采用的边界病病毒抗体的检测方法主要基于全病毒建立间接ELISA方法和中和实验，国内尚无研究报道，此外对于该蛋白诱导IgG抗体产生规律的研究尚未进行，本发明旨在建立检测边界病E2蛋白IgG抗体的ELISA方法，为临床检测和相关研究奠定基础。
发明内容
技术问题
本发明的目的是针对目前尚无BDV IgG抗体检测方法的现状，提供一种准确可靠的BDVIgG抗体ELISA检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供用于ELISA方法的重组E2蛋白的制备方法。
技术方案
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种边界病病毒重组E2蛋白，该蛋白系将包含E2主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌BL21(DE3)培养至OD600达0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体经Ni亲和层析柱纯化获得。
所述边界病病毒BDV重组E2蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1，即边界病病毒（毒株JSLS12-01为参考毒株）的多聚蛋白第793-1002位氨基酸残基:
CPCDSKPVVKGKFNTTLLNGNAFQLVCPLGWVGQVECTTVSTTTLAVEVVKTYKRSKPFPRRAGCDHTTISGEDLYHCTMGGNWTCIKGEQVRYAGGAVKQCKWCDFIFREKAGLTHYPIGKCILNNETGYRYVDDTPCEKGGVAISKTGNLECLIGETVVKVFSTDERLGPMPCRPKEVISSEGPISKTACTFNYSKTLKNKYYEPRDS
其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
TGTCCTTGTGATTCCAAACCCGTGGTTAAGGGTAAATTCAATACAACACTGCTCAACGGGAATGCATTCCAGTTAGTCTGCCCTCTAGGGTGGGTAGGACAAGTGGAGTGTACCACCGTGAGCACCACCACTTTAGCCGTTGAAGTGGTGAAAACATATAAAAGGAGCAAACCATTCCCCCGAAGAGCTGGCTGTGACCACACCACCATTTCTGGAGAAGACCTGTATCACTGCACGATGGGTGGCAACTGGACTTGCATTAAAGGTGAACAAGTGAGGTACGCTGGGGGTGCAGTTAAGCAGTGCAAGTGGTGTGACTTCATATTTAGAGAAAAAGCTGGTCTTACTCACTACCCAATAGGCAAGTGCATTTTAAATAATGAGACAGGTTACAGGTATGTAGATGACACACCATGTGAAAAGGGTGGGGTGGCGATTAGTAAGACCGGGAATCTAGAGTGCTTGATAGGGGAAACCGTGGTGAAGGTGTTTAGCACGGATGAGAGGTTAGGACCTATGCCTTGCAGGCCGAAGGAAGTGATATCTAGTGAGGGGCCCATCAGTAAGACCGCCTGCACTTTCAACTATTCAAAAACCCTCAAGAACAAATACTATGAACCTAGGGATAGT
所述的原核表达载体为pET32a。
本发明所述的重组大肠杆菌表达的BDV E2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）根据BDV JSLS12-01株基因序列设计引物F:CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAGCC（SEQID NO.3）、R:CCCTCGAGACTATCCCTAGGTTCATAGTA（SEQ ID NO.4），从BDV JSLS12-01株病毒中提取RNA，经RT-PCR扩增得到编码目的基因片段（目的基因片段为SEQ ID NO.2，不包含酶切位点和保护性碱基），通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点，把所述的基因片段克隆入原核表达载体中，然后通过酶切和测序鉴定，获得阳性重组质粒；
（2）将步骤（1）所述的经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），得到重组表达菌株BL21-E2；
（3）培养所述的重组表达菌株BL21-E2，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。
用所述的边界病病毒重组E2蛋白作为抗原建立检测边界病病毒特异性IgG抗体的ELISA检测方法并组装成试剂盒，系将上述重组蛋白包被酶标板，通过抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、二抗浓度和作用时间以及显色时间的优化建立ELISA方法，检测阴性血清确定临界值和判定标准。
有益效果：
目前使用的BDV抗体检测方法大多用瑞典Svanova公司以重组全病毒为抗原检测IgG抗体的ELISA方法，国内没有相关检测试剂盒。本发明构建了表达BDVE2蛋白的重组大肠杆菌，并将其用于建立BDV IgG抗体ELISA检测方法，初步应用结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性；该试剂盒检测与边界病病毒同属的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清均为阴性，特异性良好；将阳性血清和阴性血清连续倍比稀释，计算P/N值，直到1/1600仍为阳性，证明该方法具有很高的敏感性；经检测批内变异系数<4%，批间变异系数<10%，证明本方法具有良好的重复性。这将为系统研究BDV感染后IgG抗体产生规律、临床感染情况的监测和诊断方法的建立奠定基础。
附图说明
图1目的基因的PCR扩增。
E2：PCR产物；M：DNA marker DL-2000
图2重组质粒的酶切鉴定
M：DNA marker DL-2000；1：酶切的重组质粒；2：空质粒对照
图3SDS-PAGE检测重组蛋白的表达与纯化
M：蛋白Marker；1：空载体诱导产物；2：纯化后包涵体
图4重组蛋白的Western blot鉴定
1：HIS单抗鉴定空载体诱导产物；2：HIS单抗鉴定重组BDV-E2蛋白；3：BDV阳性山羊血清鉴定重组BDV-E2蛋白
具体实施方式
实施例1E2基因片段的PCR扩增与原核表达质粒的构建
1.1引物设计
根据根据CSFV基因序列设计引物，上下游引物各引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ位点，序列如下：
F:CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAGC（SEQ ID NO.3）；
R:CCCTCGAGACTATCCCTAGGTTCATAGTA（SEQ ID NO.4）
以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。
1.2PCR扩增目的片段
取200μl BDV JSLS12-01毒株（见参考文献Liu X,Mao L,Li W,Yang L,Zhang W,Wei J,Jiang J.2013.Genome Sequence of Border Disease Virus Strain JSLS12-01,Isolated from Sheep in China.Genome Announc.1(6).pii:e00502-13.doi:10.1128/genomeA.00502-13.），加入1ml Trizol试剂，震荡混匀，静置10min，加入200μl氯仿，剧烈震荡，12000rpm4℃离心10min，小心吸取上清，加入等体积异丙醇混匀，-20℃放置2h，12000rpm4℃离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤，干燥，加入10μl无Rnase的双蒸水溶解RNA。
按照反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）操作说明用下游引物R进行反转录，具体为：2×ES Reaction Mix10μl；EasyScript RT/RI Enzyme Mix1μl；Oligo(dT)181μl；RNA5μl；无Rnase的双蒸水补足至20μl。42℃反应45min，85℃加热5min灭活反转录酶，以反转录产物为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：上游、下游引物（10pmol/L）各1μL；dNTPs（2.5mmol/L）2μL；10×PCRbuffer2.5μL；模板4μL；Taq酶（5U/μL）0.5μL；灭菌双蒸水补至25μL。循环参数：94℃预变性5min；以94℃30s，52℃30s，72℃45s进行35次循环；最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，可以看到约630bp的条带（结果见图1），回收PCR产物，-20℃保存备用。
1.3重组质粒的构建和鉴定
将回收的目的基因PCR产物用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，回收纯化之后克隆入同样酶切处理的表达载体质粒pET-32a（Novagen）中，连接反应在16℃进行，之后将连接产物转化E.coli DH5α（购自北京全式金生物技术有限公司）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。挑取平板上的菌落，在含氨苄青霉素的LB培养基培养，碱裂解法提取质粒，经PCR和BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定（结果见图2），阳性质粒pET32a-E2获得约630bp的条带。阳性质粒送南京思普金生物科技有限公司进行测序。
实施例2重组表达菌株BL21-E2的构建
2.1转化感受态大肠杆菌BL21
实施例1中经序列测定正确的重组质粒pET32a-E2转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自北京全式金生物技术有限公司），得到重组表达菌株BL21-E2，同时将空质粒pET-32a同法转化感受态大肠杆菌BL-21。
2.2重组蛋白的诱导表达
分别挑取重组表达菌株BL21-E2和含空质粒的大肠杆菌BL21单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜振摇培养。
（1）取过夜培养的菌液10μL接种于3ml含有氨苄青霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养3h左右，使OD600达到0.6～0.8，取100μL样品于无菌Eppendorf管中作为诱导前对照；
（2）向上述菌液中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并在加入IPTG后4h收菌；4℃8000rpm离心5min收集诱导表达的细菌，PBS（pH7.2）重悬菌体沉淀；
（3）将菌液反复冻融3次，超声波裂解细菌，直至菌液变得清澈；
（4）4℃8000rpm离心10min，将沉淀用与上清等体积的PBS重悬，上清与沉淀悬浮液各取100μL备用。
2.3SDS-PAGE电泳分析
上清与沉淀蛋白样品以及空载体诱导产物中加入5×蛋白样品上样缓冲液（250mMTris-HCl，pH6.8；10%SDS；0.5%溴酚蓝；50%甘油；5%2-巯基乙醇），充分混匀后100℃煮沸5min，上样前瞬时离心，吸取上清进行SDS-PAGE，沉淀中可见明显的42kD左右目的条带，空载体诱导产物上清中没有，表明目的蛋白以包涵体的形式正确表达。
实施例3重组蛋白的大量表达，纯化及抗原性鉴定
3.1重组蛋白的大量表达，纯化
挑取2.2中的阳性菌落，接种200ml LB中，按实施例2的诱导表达条件诱导表达，离心收集菌体，按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，超声裂解后离心，分离上清和包涵体，包涵体用等体积Binding buffer重悬，按照GE HisTrap HP亲和纯化柱说明进行目的蛋白的纯化（图3）。分光光度计测定蛋白浓度为1.81mg/mL，分装后-20℃保存。
3.2重组蛋白的Western blot鉴定
（1）SDS-PAGE；
（2）转印：电泳结束后，取下凝胶按下列顺序安装转印装置（半干转印法）即：＋极－海绵－NC膜－凝胶－海绵－－极，转印条件是20V，30min；
（3）将NC膜（Pall）用含5％脱脂乳的PBST封闭液封闭过夜；
（4）将His-Tag Mouse McAb（Abmart）和BDV抗体阳性山羊血清（购自瑞典Svanova公司）用封闭液1:2000（或1:500）稀释后，加入到NC膜上，室温轻摇2h；
（5）用PBST洗涤5次，5min/次；
（6）加1：1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP或兔抗山羊IgG-HRP（北京博奥森生物技术有限公司），室温轻摇1.5h；
（7）用PBST洗涤5次，5min/次；
（10）用DAB显色试剂盒显色（武汉博士德）：1mL去离子水中加入A、B、C液各一滴，混匀后加到NC膜上，直至有明显条带出现。结果见图4，重组蛋白泳道均有特异性条带（42kD）出现，空载体对照则没有。
实施例4ELISA试剂盒的建立与应用
4.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
按矩阵法进行，以pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原蛋白分别稀释至终浓度为4.0、2.0、1.0、0.5ug/mL，4℃过夜包被酶标板（Nunc）。洗涤后加入用PBST以1:25、1:50、1:100稀释的边界病阳性血清和阴性血清，每个稀释度重复一次，取其平均值，计算各条件下P/N值，选择阳性血清OD值接近1、P/N值最大的反应条件作为ELISA最佳反应条件。结果为：抗原最佳包被浓度4μg/mL；血清最佳稀释度1:50（表1）。
表1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
4.2封闭液的选择
以4.1中确定的最佳抗原浓度包被酶标板，洗涤后，分别用50g/L的脱脂乳、10g/L的明胶、5%的马血清、5g/L的BSA、20g/L的BSA的PBST200μL/孔37℃封闭2h，检测7份阳性血清和1份阴性血清。计算P/N值，最终选择P/N值最高的20g/LBSA作为最佳封闭液（表2）。
表2封闭液的选择
4.3待检血清作用时间的选择
按上述条件包被、封闭酶标板，检测7份阳性血清和1份阴性血清，37℃分别作用0.5h、1.0h和1.5h，对其进行ELISA测定，计算P/N值，最终选择P/N值最高的1.0h作为最佳作用时间。
表3待检血清作用时间的选择
4.4二抗工作浓度的选择
按上述条件进行包被、封闭、加样，洗涤后分别加入1:20000、1:30000、1:40000、1:50000稀释的的兔抗山羊IgG-HRP（北京博奥森生物技术有限公司），100μL/孔，进行ELISA测定，以P/N值最高的1:30000作为最佳工作浓度。
表4二抗浓度的选择
4.5二抗作用时间的选择
将二抗按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用30min、45min、60min，对标准阴阳性血清进行ELISA测定，比较各组阳性血清的P/N值，以选择合适的酶标二抗作用时间，确定二抗作用时间为45min。
表5二抗作用时间的选择
4.6显色时间的选择
按照前面筛选条件进行ELISA试验，加入TMB（上海碧云天生物技术有限公司）后分别显色5、10、15min，计算P/N值。选取P/N最高的10min作为最佳显色时间。
表6显色时间的选择
4.7间接ELISA临界值的确定
将经Svanova公司BDV抗体检测试剂盒检测为阴性的羊血清样品40份，用建立的ELISA方法检测。计算平均值X为0.263，标准差SD为0.068。则血清OD≤X+2SD=0.399，判为阴性，OD≥X+3SD=0.467判为阳性，介于两者之间者判为可疑，重复检测一次，若仍为可疑，即判为阳性。
4.8重复性
使用5批蛋白包被酶标板，选用16份羊血清进行批内和批间重复性试验，计算变异系数，以验证本方法的可重复性，结果表明批内变异系数<4%，批间变异系数<10%，证明本方法具有良好的重复性。
4.9敏感性和特异性试验
将阳性血清和阴性血清连续倍比稀释，计算P/N值，直到1/1600仍为阳性，证明该方法具有很高的敏感性；用该ELISA方法对猪瘟病毒（CSFV）（IDEXX公司阻断ELISA试剂盒阳性血清）、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）(购自中国兽医药品监察所)标准阳性血清进行检测，结果为阴性，证明本方法具有良好的特异性。
4.10临床血清样品的检测
应用本研究建立的ELISA试剂盒对187份临床血清进行检测，以4.7中确定的判定标准为依据对检测结果进行判定。阳性率为47.59%。
4.11ELISA试剂盒组装
ELISA试剂盒包含包被的酶标板（Nunc公司）、重组BDVE2蛋白、阴阳性对照血清、兔抗山羊HRP-IgG酶标二抗（北京博奥森生物技术有限公司）、TMB显色液（上海碧云天生物技术有限公司）、终止液、封闭液、洗涤液。
SEQUENCE LISTING
 
 
<110>  江苏省农业科学院
 
 
<120>  边界病病毒BDV重组E2蛋白及其IgG抗体检测试剂盒
 
 
<130>  0
 
 
<160>  4    
 
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
 
<210>  1
<211>  210
<212>  PRT
<213>  d
 
 
<220>
<221>  边界病病毒BDV重组E2蛋白
<222>  (1)..(210)
<223> 
 
 
 
<400>  1
 
Cys Pro Cys Asp Ser Lys Pro Val Val Lys Gly Lys Phe Asn Thr Thr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Leu Asn Gly Asn Ala Phe Gln Leu Val Cys Pro Leu Gly Trp Val
            20                  25                  30          
 
 
Gly Gln Val Glu Cys Thr Thr Val Ser Thr Thr Thr Leu Ala Val Glu
        35                  40                  45             
 
 
Val Val Lys Thr Tyr Lys Arg Ser Lys Pro Phe Pro Arg Arg Ala Gly
    50                  55                  60                  
 
 
Cys Asp His Thr Thr Ile Ser Gly Glu Asp Leu Tyr His Cys Thr Met
65                  70                  75                  80 
 
 
Gly Gly Asn Trp Thr Cys Ile Lys Gly Glu Gln Val Arg Tyr Ala Gly
                85                  90                  95     
 
 
Gly Ala Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Asp Phe Ile Phe Arg Glu Lys
            100                 105                 110        
 
 
Ala Gly Leu Thr His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Asn Asn Glu
        115                 120                 125            
 
 
Thr Gly Tyr Arg Tyr Val Asp Asp Thr Pro Cys Glu Lys Gly Gly Val
    130                 135                 140                
 
 
Ala Ile Ser Lys Thr Gly Asn Leu Glu Cys Leu Ile Gly Glu Thr Val
145                 150                 155                 160
 
 
Val Lys Val Phe Ser Thr Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg
                165                 170                 175    
 
 
Pro Lys Glu Val Ile Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ser Lys Thr Ala Cys
            180                 185                 190        
 
 
Thr Phe Asn Tyr Ser Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg
        195                 200                 205            
 
 
Asp Ser
    210
 
 
<210>  2
<211>  630
<212>  DNA
<213>  人工
 
 
<220>
<221>  表达边界病病毒BDV重组E2蛋白核苷酸序列
<222>  (1)..(630)
<223> 
 
 
 
<400>  2
tgtccttgtg attccaaacc cgtggttaag ggtaaattca atacaacact gctcaacggg     60
 
aatgcattcc agttagtctg ccctctaggg tgggtaggac aagtggagtg taccaccgtg    120
 
agcaccacca ctttagccgt tgaagtggtg aaaacatata aaaggagcaa accattcccc    180
 
cgaagagctg gctgtgacca caccaccatt tctggagaag acctgtatca ctgcacgatg    240
 
ggtggcaact ggacttgcat taaaggtgaa caagtgaggt acgctggggg tgcagttaag    300
 
cagtgcaagt ggtgtgactt catatttaga gaaaaagctg gtcttactca ctacccaata    360
 
ggcaagtgca ttttaaataa tgagacaggt tacaggtatg tagatgacac accatgtgaa    420
 
aagggtgggg tggcgattag taagaccggg aatctagagt gcttgatagg ggaaaccgtg    480
 
gtgaaggtgt ttagcacgga tgagaggtta ggacctatgc cttgcaggcc gaaggaagtg    540
 
atatctagtg aggggcccat cagtaagacc gcctgcactt tcaactattc aaaaaccctc    600
 
aagaacaaat actatgaacc tagggatagt                                     630
 
 
<210>  3
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工
 
 
<220>
<221>  引物F
<222>  (1)..(28)
<223> 
 
 
 
<400>  3
cgggatcctg tccttgtgat tccaagcc                                        28
 
 
<210>  4
<211>  29
<212>  DNA
<213>  了
 
 
<220>
<221>  引物R
<222>  (1)..(29)
<223> 
 
 
 
<400>  4
ccctcgagac tatccctagg ttcatagta                                       29
 

Claims (5)

1.一种边界病病毒重组E2蛋白，该蛋白系将包含E2主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET-32a得到重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌BL21(DE3)培养至OD600达0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，分离菌体经Ni亲和层析柱纯化获得。
2.根据权利要求1所述的重组E2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1或2所述的重组E2蛋白，其特征在于，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
4.权利要求1-3之一所述的边界病病毒BDV重组E2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）根据边界病病毒基因序列设计引物F: CGGGATCCTGTCCTTGTGATTCCAAGCC（SEQ ID NO.3）、R: CCCTCGAGACTATCCCTAGGTTCATAGTA（SEQ ID NO.4），从BDV JSLS12-01病毒株提取RNA，经RT-PCR扩增得到编码目的基因片段（SEQ ID NO.2），通过BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，把所述的基因片段克隆入原核表达载体中，然后通过酶切和测序鉴定，获得阳性重组质粒；
（2）将步骤（1）所述的经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），得到重组表达菌株BL21-E2；
（3）培养所述的重组表达菌株BL21-E2，加入IPTG 进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。
5.用权利要求1-3之一所述的边界病病毒重组E2蛋白建立检测BDV IgG抗体的ELISA试剂盒。
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